Summary
Sekvensiell salt avstamning av chromatin bundet proteiner er et nyttig verktøy for å bestemme Bindingsegenskapene for store protein komplekser. Denne metoden kan brukes til å vurdere rollen personlige underenheter eller domener i det samlede affinitet til et protein kompleks til bulk chromatin.
Abstract
Utviklingen av Bindingsegenskapene for chromatin målretting proteiner kan være svært utfordrende på grunn av den komplekse naturen chromatin og heterogene natur mest pattedyr chromatin-modifisere komplekser. For å overvinne disse hindringene, har vi tilpasset en sekvensiell salt avstamning (SSE) analysen for å evaluere de relative bindende slektskap av chromatin-bundet komplekser. Denne enkel og grei analysen kan brukes av ikke-eksperter for å evaluere den relative forskjellen i bindingen affinitet to relaterte komplekser, endringene i affinitet av et kompleks når en er tapt eller en individuell domenenavn er inaktiv og endring i forpliktende tilhørighet etter endringer i det chromatin landskapet. Ved sekvensielt re suspendere bulk chromatin i økende mengder salt, er vi kunne profil tilsettes et bestemt protein fra chromatin. Bruke disse profilene, er vi kunne fastslå hvordan endringer i en chromatin-modifisere kompleks eller endringer chromatin miljøet påvirke bindingen interaksjoner. Kopling SSE med andre i vitro og i vivo analyser, kan vi finne ut rollene enkeltdomener og proteiner funksjonalitet av et kompleks i en rekke chromatin miljøer.
Introduction
DNA regulering i eukaryote celler er en intrikat og sofistikert som er strengt kontrollert av et utvalg av proteiner som koordinere reaksjonene til intracellulær og ekstracellulære stimuli. DNA er pakket rundt histone octamers til form nucleosomes, som kan bli løst fordelt langs DNA eller komprimeres i tett spoler1. Dette strukturelle arrangement av DNA og histones kalles chromatin, som er regulert av et nettverk av proteiner som lese, skrive og slette innlegget translasjonsforskning endringer (PTM) på histones2. Noen histone PTMs, som acetylation, endre ansvaret for aminosyren de settes på, endre interaksjoner mellom histones og DNA2. Histone PTMs også tjene til å rekruttere transcriptional regulatorer, chromatin remodelers, DNA skade reparasjon maskiner og DNA replikering maskiner til bestemte områder i genomet3.
De fleste metoder for å studere chromatin vekselsvirkningene enten sonde småskala interaksjoner eller involverer store genomet hele analyser. In vitro bindende studier utnytte ofte personlige rekombinant domener med histone peptider eller DNA i analyser som geleelektroforese mobilitet Skift analyser (EMSA), isotermiske titrering calorimetry, fluorescens polarisering og peptid pulldowns. Fordi disse analyser vanligvis fokusere på et enkelt protein domene, de lette forståelsen av en liten bit av puslespillet, men tillater ikke oss å forstå samarbeidsvillig natur multi-domene proteiner, enn si sin rolle i flere protein komplekser. Et lag av intrikate legges av heterogene sammensetningen av mest pattedyr chromatin-modifisere komplekser. Denne protein heterogenitet, gjør sammen med dynamikken i chromatin landskapet, det utfordrende for å recapitulate den i vivo binding interaksjoner chromatin proteiner til chromatin i vitro.
I vivo metoder har gjort betydelige fremskritt; men er de ofte dyre, tidkrevende og teknisk utfordrende. Chromatin immunoprecipitation etterfulgt av sekvensering (ChIP-seq) er svært nyttig for å bestemme lokaliseringen av proteiner og histone endringer over genomet, men det krever betydelig optimalisering4. Proteiner er ofte krysskoblet til chromatin å bevare samhandling; men dette kan produsere kunstig interaksjoner og kan forårsake epitope maskering5. Videre krever immunoprecipitations (IP) svært spesifikke antistoffer og omfattende optimalisering av DNA klipping IP av ChIP-qPCR bruker en kjent binding området, som ofte ikke er tilgjengelig en priori. Etter optimalisering av ChIP, behandling av prøvene er kostbare og krever flere uker til måneder sekvens og analysere. Selv om denne metoden er uvurderlig for å identifisere lokaliseringen av chromatin bundet proteiner over genomet, kostnader og tidsbruk gjør det uoverkommelige bruke denne metoden til å generere hypoteser om hvordan små endringer kan påvirke global bindingsegenskapene .
I dette papir beskriver vi hvordan en sekvensiell salt avstamning (SSE) analysen kan brukes til å undersøke globale bindende profiler av chromatin-bundet proteiner og skille hvordan endringer i en protein, komplekse eller global PTM profil kan endre interaksjoner. Salt utdrag er en vanlig og bredt brukt teknikk, viser vi hvordan denne sekvensielle metoden er reproduserbare og svært allsidig. SSE tillater oss å karakterisere hvordan en enkelt undergruppe til en kompleks eller en enkelt domene bidrar til kompleksets samlede affinitet for bulk chromatin. SSE kan også brukes til å avgjøre hvis binding av et protein er påvirket av endringer i chromatin landskap, gir interessante hypoteser for histone merke målretting som kan bekreftes ved hjelp av ChIP-seq og andre genomet bredt studier.
Vi tilpasset denne metoden fra Wu et al., undersøke av den Polybromo1 (PBRM1) i bindingen av PBAF chromatin remodeler6,7. Bruker denne teknikken, vi bestemt rollen som PBRM1 for chromatin-tilknytning i PBAF chromatin remodeling komplekse og da fastsatte relative andel av de seks individuelle bromodomains til denne funksjonen7.
Her beskriver vi hvordan å optimalisere denne metoden for å utforske chromatin binding i ulike celletyper, å vurdere relativ forpliktende tilhørighet av lignende chromatin å endre komplekser, for å undersøke forskyvning av et protein fra chromatin av en kjemisk inhibitor, og å bestemme effekten av chromatin binding etter endringer i det chromatin landskapet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelser
- forberede 100 mL hypotonisk løsning Buffer A: 0,3 M sukrose, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, og 0,5% NP-40. Butikken på 4 ºC.
Merk: Noen linjer, for eksempel HEK293T, krever mindre strenge lysing forhold. Hvis kjerner lyse enkelt bruker endret Buffer A: 25 mM HEPES pH 7.6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0.05 mM EDTA, 0,1% NP-40, og 10% glyserol. - Forberede en 250 mL lagerløsning 2 x mRIPA løsning: 100 mM Tris pH 8.0, 2% NP-40, og 0,5% natrium deoxycholate.
- Utarbeide en 100 mL lager løsning av 5 M NaCl.
- Med 2 x mRIPA og 5 M NaCl løsninger, forberede 50 mL 1 x mRIPA løsning for hver av de seks salt konsentrasjonene: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM og 500 mM NaCl. Før du starter eksperimentet, kule alle løsninger på ice.
- Vokse cellelinjer under ønsket forhold.
Merk: Ved beregning av effekten av banket ned et protein, SSE for knockdown linjen må sammenlignes wildtype celler. Disse SSE må utføres side ved side. Eksempler med kjemiske hemmere eller stimuli, se delene 3-5.
2. Grunnleggende sekvensiell Salt avstamning
- Harvest 8 millioner celler av hver betingelse og vaske to ganger med 5 mL av is kaldt PBS.
Merk: Det er viktig å ha likt antall celler ha tilsvarende protein konsentrasjoner. Nøyaktig antall celler må være optimalisert for individuelle linjer eller bestemt proteiner. Det er viktig ikke å ha for mange, som økningen i protein konsentrasjoner vil hindre observasjon av elueringsrør kurven, som er avhengig av likevekt bindende. Imidlertid med for få celler kan det ikke være nok protein å oppdage kurven, og chromatin pellets er vanskeligere å isolere og tapt mellom fraksjoner. - Nytt suspendere celler i 1 mL av Buffer A + proteasehemmere, overføre til 1,5 mL mikro sentrifuge rør, og roter topp over bunnen på 4 ºC i 10 min.
- Isolere kjerner med sentrifugering 6000 x g i 5 min på 4 ºC.
Merk: Etter dette trinnet den kjernefysiske konvolutten bør fortsatt være intakt. Hvis den kjernefysiske konvolutten er intakt, vil pellet re suspendere fullt; imidlertid når konvolutten er lysed og chromatin frigjøres, vil pellet ikke å stoppe. Hvis den kjernefysiske konvolutten ikke er intakt etter Buffer A inkubering, bruker endret Buffer A. - Legge til 200 µL mRIPA 0 mM NaCl + protease hemmere til hver kjerner pellet før re frakobles pellets. Homogenize hvert utvalg av pipettering 15 ganger med en 1 mL pipette. Pellet bør re suspendere lett, men kjerner vil lyse som det er pipetted og prøven blir tykk og klissete og vanskelig å pipetter.
- For å trekke opp pellet i spissen, trykk slutten av pipette spissen mot bunnen av sentrifuger røret. Pellet vil ikke fullt løses når DNA frigis fra kjerner, men pipettering vil bryte den opp
- Når alle prøvene har vært homogenisert, ruge alle prøvene på is 3 min.
Merk: Inkubasjon tiden må optimaliseres avhengig av protein interessepunkter. - Isolere chromatin pellets av sentrifugering prøvene for 3 min 6500 x g på 4 ºC.
- Overføring nedbryting til en ren 1,5 mL sentrifuge tube. Dette vil være 0 mM brøken. 0 mM mRIPA løsningen kan fungere som en wash trinn til lyse kjerner og fjerne eventuelle løs proteiner som ikke er tilknyttet chromatin.
- Legge til 200 µL mRIPA 100 mM NaCl + protease hemmere til hver chromatin pellets før re frakobles pellets. Bryte opp chromatin pellets av pipettering pellet opp og ned 15 ganger.
Merk: Det er viktig å være i samsvar med antall ganger pellet i pipetted. - Incubate på is 3 min. Dette inkubasjon trinnet lar alle prøver å nå en likevekt stat, som er spesielt viktig når det er flere eksempler.
- Sentrifuge 6500 x g i 3 minutter på 4 ºC og overføre supernatant til en ren 1,5 mL tube.
- Gjenta 2.6-2.10 for de gjenværende salt konsentrasjonene.
Merk: Etter 400 mM NaCl, mRIPA pellet bør være klart og gloopy og vil ikke bo på bunnen av røret. Pellet kan plasseres i lokket på sentrifuge røret mens nedbryting isolert. - Legge til 70 µL av 4 x protein lasting fargestoff til hver fraksjon og laste 30 µL av hver fraksjon på en SDS akrylamid gel for western blot analyse.
Merk: for å bestemme bindende profilen av proteinet, er det avgjørende å laste tilsvarende mengder lysate, i stedet for lasting lik protein konsentrasjoner. - Utfører en standard western blot ved å overføre på en membran og bruke primære antistoffer for proteiner interessepunkter.
- å quantitate protein elut fra chromatin, ruge blot i infrarød fluorescens IRDye sekundære antistoffer og bilde blot med en imager. Andre metoder for utvikling kan brukes, men vi anbefaler fluorescens eller infrarød imaging, som det er mer kvantitativ i naturen.
- Bruk ImageJ eller lignende programvare for å beregne intensiteten for protein elut på hver saltkonsentrasjon. Elueringsrør mønsteret av protein rundt kan bestemmes av grafiske bandet intensiteten mot saltkonsentrasjon,.
3. Sekvensiell Salt avstamning i nærvær av en " leseren " hemmer
- høste to sett med celler (4 millioner) og isolere kjerner i en standard SSE.
- Re suspendere settene i 200 µL av mRIPA 0 mM NaCl og ruge i 3 minutter. Dette vil tillate fjerning av noen gratis protein i kjerner.
- Legge til 200 µL mRIPA 0 mM NaCl til hver pellets. Legg til inhibitor (2 µL av 1 mM (+) JQ1) til en prøve og DMSO kontroll.
- Agitate pellet av pipettering 15 ganger og Inkuber på is 5 min.
- Sentrifuge 6500 x g i 3 minutter på 4 ºC og overføre supernatant til en ren 1,5 mL tube.
- Gjenta 3.3-4 for alle salt konsentrasjonen og utføre en standard western blot.
4. Sekvensiell Salt avstamning i nærvær av en " forfatter " hemmer
- Behandle celler med inhibitor (10 µM SAHA) eller DMSO for 3 h.
- Høste 4 millioner celler for hver behandling.
- Utfører en standard SSE for prøvene med inhibitor lagt til alle bufferne.
5. Sekvensiell Salt utvinning følgende DNA skade
- Behandle celler med 1 µM doksorubicin for 1 h.
- Endre media på cellene og tillate dem å gjenopprette for 3 h.
- Høste 8 millioner celler og utføre grunnleggende SSE.
6. Ikke-sammenhengende Salt avstamning
- høste 12 millioner celler og vask med PBS.
- Dele cellene slik at det er 2 millioner celler per mikro sentrifuge tube.
- Nytt avbryte 500 µL av Buffer A og Inkuber for 10 min.
- Isolere kjerner med sentrifugering på 6000 x g.
- Re utsette pellets i en 200 µL av hver av mRIPA buffere + NaCl.
- Homogenize hvert utvalg av pipettering 15 ganger med 1 mL pipette tips.
- Incubate på is 3 min.
- Isolere i chromatin ved sentrifugering 6500 x g og overføre nedbryting for å rengjøre rør. Legge til 70 µL av lasting fargestoff og kjøre 30 µL på en SDS side gel for western blot analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette papiret viser vi fordeler og brukte sekvensiell salt avstamning (SSE) anvendelser som vi har tilpasset fra litteratur6. I figur 1sammenligne vi reproduserbarhet av SSE utpakking proteiner ikke-sekvensielt ved å registrere elueringsrør mønstre av ARID1a og PBRM1. Konsekvent ser vi at ARID1a, en BAF underenheten, elutes primært på 200 mM NaCl og PBRM1, en eksklusiv PBAF delenhet, elutes primært på 300 mM NaCl. Figur 1a viser tre uavhengige gjenskapninger av SSE med 8 millioner OVCA429 celler. Figur 1b viser et ikke-sammenhengende salt avstamning hvor kjerner isolert fra 2 millioner celler var re suspendert i en enkelt salt buffer. Selv om begge metodene konkludere med at ARID1a elutes på 200 mM og PBRM1 elutes på 300 mM, SSE produserer en godt definerte bindingen profil og gir et klart skille av binding av disse to komplekser. Videre i ikke-sammenhengende metoden mengden av protein elut i 400 mM og 500 mM NaCl bufferne er lavere enn den 300 mM og er uoverensstemmelse mellom de tre gjentak. Om dette problemet kan løses med ytterligere optimalisering av inkubasjon tid og sentrifugering hastighet, illustrerer dette reproduserbarhet fordelen av SSE.
Gjennom våre optimalisering fant vi at andre chromatin komplekser kan kreve mer tid til å være elut. I figur 2viser vi at transcriptional aktivatoren, PBAF, elutes fra chromatin konsekvent mellom SSEs med 3 min og 10 min incubation ganger. Derimot krever elueringsrør av den transcriptional repressor, Polycomb undertrykkende komplekse 1 (PRC1), angitt av BMI-1, lengre inkubasjon tid frigis fra chromatin8. Dette fenomenet kan være på grunn av PRC1 er lokalisert i mer kompakt og utilgjengelige områder i genomet, eller det kan være differensial bindende kinetics for to komplekser.
Etter optimalisering for et bestemt protein, kan SSEs brukes til å studere hvordan styrke protein bindende endringer i ulike forhold. SSE kan brukes til å undersøke effektiviteten av en inhibitor av protein-protein interaksjoner. For å demonstrere dette konseptet, benyttet vi (+) JQ1, som er en BRD4 bromodomain hemmer, å undersøke hvordan det forandret BRD4 binding (figur 3a)9. Vi isolerte kjerner fra 4 millioner OVCA429 celler. Hvis du vil fjerne en ubundet BRD4, ble en innledende 0 mM vask utført på begge prøver. Deretter en standard SSE ble utført med DMSO eller 1 µM (+) JQ1 lagt til hver fraksjon. Prøvene ble ruges i 5 minutter. Vi observerer at BRD4 elutes tidligere i nærvær av inhibitor sammenlignet med DMSO. Slik viser at (+) JQ1 er spesifikk for BRD4, vi blir strøket for ARID1a og så ingen endring i elueringsrørets (figur 3b).
Neste vi undersøkt hvordan protein binding kan endres når landskapet i chromatin endres. BRD4 inneholder to bromodomains som gjenkjenner acetylated lysin rester på histone haler10. For å øke nivået av histone acetylation, vi behandlet OVCA429 celler med 10 µM av histone deacetylase hemmere suberanilohydroxamic syre (SAHA) for 3 h. SAHA (10 µM) ble lagt til alle bufferne under SSE. Ved å øke den globale histone acetylation nivået, observerte vi en økning i BRD4 binding (figur 4a). Når blotting for ARID1a, observerer vi strammere binding av ARID1a, som er ikke overraskende fordi underenheter av BAF det komplekse, som BRG1, BRM og BRD9, alle inneholder bromodomains10,11 (figur 4b).
Til slutt, for å vise hvordan SSE kan brukes til å se på hvordan protein bindende endres når celler opplever genomisk endringer, vi indusert double-strandet DNA bryter med den topoisomerase II inhibitor, doksorubicin12. Vi behandlet HEK293T celler med 1 µM av doksorubicin for en time og tillatt celler å gjenopprette i tre timer. Etter utfører SSE, uten vi for PBRM1, som er involvert i DNA skade reparasjon13. Vi observerte to toppene til PBRM1 innbinding: en 300 mM og en 500 mM NaCl (figur 5). Dette tyder på at noen av befolkningen PBRM1 er bindende normalt, men et delsett av PBRM1 er mer bundet til chromatin etter DNA skade. Dette er bare ett eksempel på hvordan du bruker SSE undersøke hvordan chromatin vekselsvirkningene er endret som svar på ulike eksterne stimuli.
Figur 1: Ikke-sammenhengende forhold til sekvensielle salt utdrag i OVCA429 celler
A) Immunoblots og måling av tre uavhengige replikerer ARID1a og PBRM1 elueringsrør profiler av metoden sekvensiell salt avstamning. B) Immunoblots og måling av tre uavhengige replikerer ARID1a og PBRM1 elueringsrør profiler i metoden ikke-sammenhengende salt avstamning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Sammenligning inkubasjon ganger av PBAF og PRC1 elueringsrør profiler
A) sammenligning av PBAF (PBRM1) elueringsrør profiler med 3 og 10 minutters inkubasjon ganger. B) sammenligning av PRC1 (BMI-1) elueringsrør profiler med 3 og 10 minutters inkubasjon ganger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Effektiviteten av (+) JQ1 på hemme BRD4 binding
A) elueringsrør mønster av BRD4 i nærvær av 1 µM (+) JQ1 sammenlignet med DMSO kontroll i OVCA429 celler. B) elueringsrør profil av ARID1a i nærvær av 1 µM (+) JQ1 sammenlignet med DMSO kontroll i OVCA429 celler. Bandet intensitet angis for 0 mM - 500 mM brøkdel med DMSO eller (+) JQ1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Endringer i binding når chromatin anlagt endres
A) sammenligning av BRD4 elueringsrør fra OVCA429 cellene behandlet med 10 µM SAHA i 3 timer sammenlignet med DMSO behandling. B) elueringsrør profiler av ARID1a fra OVCA429 cellene behandlet with10 µM SAHA sammenlignet med DMSO. Bandet intensitet angis for 0 mM 500 mM brøkdel med DMSO eller SAHA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Endringer i PBRM1 binding etter DNA skade
SSE resultater for PBRM1 binding fra HEK293T cellene behandlet med 1 µM doksorubicin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karakteristikk av protein og chromatin vekselsvirkningene gjennom salt utdrag er en felles metode som har vært ansatt for tiår14,15; men har det ikke blitt systematisk optimalisert før for å avsløre sin full nytte. Viser vi hvordan denne sekvensielle metoden gir en rask og rimelig måte å skille endringer i chromatin binding når protein eller miljøet endres. SSE er svært tilpasningsdyktige og optimerbare, og viktigst, er teknisk enkelt og krever ingen spesialisert utstyr. Det viktige aspekter som må optimaliseres før du starter er: starter celle nummer hypotonisk buffer forhold og inkubasjonstiden.
Det viktigste aspektet av celle nummer er at det er samsvar mellom alle prøvene. Når du ser på BAF komplekser, gir bruke 8 millioner celler en god profil av hvordan disse kompleksene er bindende; imidlertid må antall celler (eller hvor mye buffer) justeres avhengig av overflod av protein av interesse. Det er viktig å merke seg at bruker færre celler er utfordrende fordi på 400 mM og 500 mM NaCl det er vanskelig å visualisere chromatin pellets. Det er viktig å sørge for pellet ikke overføres med nedbryting etter 400 mM NaCl.
Nøyaktig evaluere kjernefysiske proteiner, må kjerner du holde intakt før de er lysed med 0 mM NaCl mRipa løsning. Mange brukte hypotonisk løsninger er for harde for linjer som HEK293T og HeLa celler. For disse cellelinjer anbefales det å bruke endret Buffer A.
Endelig kan inkubasjon tiden variere avhengig av eksperimentet. For underenheter av BAF endrer elueringsrør mønsteret ikke mellom 3 min og 10 min incubation; imidlertid endres tilsettes til PRC1 komplekset drastisk avhengig av hvor lenge prøvene er ruges. I tillegg når evaluere effekten av en inhibitor på bindingen for målet, må inkubasjon tiden optimaliseres avhengig av hemmer kinetics.
Når du utfører eksperimentet, er det viktig å være så konsekvent som mulig med behandling av prøvene. For hver fraksjon, bør salt bufferen legges til hver prøven før homogenisering slik at hvert utvalg er like utsatt. Poenget med pipettering er å bryte opp chromatin og hjelpe utgivelsen bundet proteiner. Det er viktig å sørge for pellet passerer pipette spissen. Spesielt når du bruker et større antall celler, er chromatin pellets utfordrende å passere pipette spissen de første gangene. Vi har funnet at et 1 mL tips fungerer best for dette, som med mindre tappe tips mot bunnen av mikro sentrifuge røret, er vi i stand til å trekke opp pellet i spissen. Etter bestått chromatin pellets gjennom tipset femten ganger, bør pellet jevnt gå gjennom tipset, selv om det ikke løses. Etter rugende prøvene på is og isolere i chromatin med sentrifugering, gir fjerne nedbryting med 200 µL pipette tips maksimal fjerning uten å forstyrre chromatin pellets.
Selv om SSE krever teknisk konsistens, den er enkel, grei og kan utføres med vanlig laboratoriet ressurser. Det er viktig å merke seg at styrken i denne metoden er når den er kombinert med andre phenotypical undersøkelser. For eksempel bruker denne teknikken, vi sammenlignet bindende profiler PBRM1 når hver av seks bromodomains ble mutert, bestemte vi at alle unntatt én av bromodomains var involvert i binding av PBRM1 for ulike grader7. Intriguingly, fant vi at bromodomains som var viktig for innbindingen var også viktig for PBRM1 regulering av genuttrykk og kontroll celle spredning7. Vi også godkjent endringene i binding av disse mutanter til et diskret genomisk locus av kvantitative ChIP-qPCR7.
Vi har vist bare noen eksempler på hvordan denne teknikken kan brukes å studere protein-chromatin vekselsvirkningene; men i vår lab, har vi funnet at SSE er et allsidig verktøy for å undersøke en rekke spørsmål om chromatin leser proteiner. I kombinasjon med andre analyser, denne teknikken gjør vår evne til belyse funksjonaliteten til komponentene som utgjør dette utdype protein komplekser. Ved å forstå betydningen av enkelte domener, kan vi identifisere om de er potensielle terapeutiske mål for utviklingen av en inhibitor som blokkerer chromatin association.
Vi har vist hvordan SSE kan utvides for å evaluere effektiviteten av en lite molekyl hemmer på protein binding til chromatin. I tillegg begrenser epigenetic forfattere og viskelær, kan SSE bestemme forholdet mellom PTM nivåer og leser proteiner. Vi har også vist at SSE kan brukes til å finne endringer i bindingen som svar på eksterne stimuli som DNA skade. Om dette er en enkel teknikk, når den brukes i riktig, kan det sterkt forhånd vår kunnskap om chromatin og dens forskrifter proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en V scholar award (V2014-004) og en V scholar pluss award (D2016-030) fra V grunnlaget for kreftforskning og en American Cancer Society institusjonelle forskningsstipend (ACS IRG Grant 58-006-53) på Purdue University Center for Cancer Forskning. E. G. P. ble støttet av Borch Graduate legat prisen til Purdue University medisinsk kjemi og Institutt for molekylær farmakologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes--many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -H., Kim, S., Park, E. -J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
