Summary
Extracción de la sal secuencial de las proteínas de la cromatina obligada es una herramienta útil para la determinación de las propiedades de enlace de los complejos grandes. Este método puede ser empleado para evaluar la función de individuales subunidades o dominios en la total afinidad de una proteína compleja a la cromatina.
Abstract
Elucidación de las propiedades de enlace de las proteínas dirigida a la cromatina puede ser muy difícil debido a la complejidad de la cromatina y la naturaleza heterogénea de los mamíferos más complejos modificadores de la cromatina. Para superar estos obstáculos, hemos adaptado un análisis de extracción secuencial de la sal (SSE) para la evaluación de las afinidades de unión relativa de complejos enlazados a la cromatina. Este análisis fácil y sencillo pueden utilizarse por usuarios no expertos para evaluar la diferencia relativa en atar afinidad de dos complejos relacionados con los cambios en la afinidad de un complejo cuando una subunidad se pierde o se inactiva un dominio individual y el cambio en afinidad de unión después de alteraciones en el paisaje de la cromatina. Suspendiendo secuencialmente a la cromatina a granel en cantidades crecientes de sal, que son capaces de Perfil de la elución de una proteína particular de cromatina. Con estos perfiles, que son capaces de determinar cómo alteraciones en un conjunto de modificadores de la cromatina o alteraciones en el entorno de cromatina afectan las interacciones de los Unión. SSE de acoplamiento con otros ensayos in vitro e in vivo , podemos determinar las funciones de dominios individuales y proteínas en la funcionalidad de un complejo en una variedad de entornos de cromatina.
Introduction
Regulación de ADN en las células eucariotas es un sistema complejo y sofisticado que está firmemente controlado por una variedad de proteínas que coordinan las respuestas a estímulos intracelulares y extracelulares. ADN se envuelve alrededor de histona octamers a nucleosomas forma, que pueden ser libremente distribuidos a lo largo del ADN o compactados en bobinas apretados1. Este arreglo estructural del ADN y las histonas se conoce como cromatina, que es reglamentada por una red de proteínas que leer, escribir y borrar post traslacional modificaciones (PTM) en histonas2. Algunas histonas MPa, como acetilación, cambiar la carga del aminoácido se depositan, alterando las interacciones entre las histonas y ADN2. PTMs histonas también sirven para contratar los reguladores transcripcionales, remodeladores de la cromatina, maquinaria de reparación del daño de ADN y maquinaria de replicación del ADN en regiones específicas del genoma3.
Mayoría de los métodos para el estudio de las interacciones de la cromatina o sonda interacciones a pequeña escala o implica grandes análisis de genoma. Estudios de Unión in vitro a menudo utilizan dominios recombinantes individuales con péptidos histona o DNA en ensayos como análisis de cambio de movilidad de electroforesis (EMSA), calorimetría isotérmica de titulación, polarización de fluorescencia y jalones de péptido. Porque estos análisis suelen centran en un dominio de proteínas individuales, facilitar la comprensión de una pequeña pieza del rompecabezas, pero no nos permiten comprender la naturaleza cooperativa del multi-dominio proteínas, por no hablar de su papel en múltiples proteínas complejos. Se añade otra capa de complejidad de la composición heterogénea de los mamíferos más complejos modificadores de la cromatina. Esta heterogeneidad de proteína, en combinación con el carácter dinámico del paisaje de la cromatina, es difícil para recapitular el en vivo vinculantes las interacciones de las proteínas de la cromatina de cromatina in vitro.
Métodos in vivo han hecho avances significativos; sin embargo, son a menudo costoso, desperdiciador de tiempo y un desafío técnico. Inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación (ChIP-seq) es muy útil para determinar la localización de proteínas y modificaciones de las histonas en el genoma, sin embargo requiere optimización considerable4. Las proteínas son a menudo reticulado a cromatina para preservar las interacciones; sin embargo, esto puede producir interacciones artificiales y puede causar del epítopo enmascarar5. Además, el immunoprecipitations (IP) requieren anticuerpos altamente específicos y extensa optimización de corte de DNA y condiciones IP por ChIP-qPCR utilizando un sitio de Unión conocido, que a menudo no es disponible a priori. Después de la optimización de las condiciones de la viruta, procesamiento de las muestras es costoso y requiere de varias semanas a meses secuenciar y analizar. Aunque este método es muy valioso para identificar la localización de la cromatina enlazado a proteínas en el genoma, el costo y compromiso de tiempo que sea prohibitivo para utilizar este método para generar hipótesis acerca de cómo pequeños cambios pueden afectar propiedades de enlace global .
En este papel, describimos cómo se puede utilizar un análisis de extracción secuencial de la sal (SSE) para examinar los perfiles de enlace mundial de proteínas de la cromatina-limite y distinguir cómo cambios en un perfil PTM proteínas, complejo o global pueden alterar las interacciones. Aunque la extracción de sal es una técnica común y ampliamente utilizada, demostramos cómo este método secuencial es altamente reproducible y versátil. SSE nos permite caracterizar cómo una sola subunidad de un complejo o incluso un único dominio contribuye a afinidad general del complejo de la cromatina a granel. SSE puede utilizarse también para determinar si la Unión de una proteína está influenciada por cambios en el paisaje de la cromatina, proporciona hipótesis interesantes para histonas marca apuntar que pueden confirmarse mediante ChIP-seq y otros estudios de genoma amplio.
Originalmente adaptado este método de Wu et al., para examinar la función de Polybromo1 (PBRM1) en la Unión de la cromatina PBAF remodelador6,7. Usando esta técnica, determinó el papel de PBRM1 para el atascamiento de la cromatina dentro de la cromatina PBAF remodelación complejo y determina la contribución relativa de los seis bromodomains individuales a esta función7.
Aquí describimos cómo optimizar este método para explorar el atascamiento de la cromatina en diferentes tipos celulares, para evaluar la afinidad relativa de la cromatina similar modificando complejos, para examinar el desplazamiento de una proteína de la cromatina de un inhibidor químico, y para determinar los efectos de la Unión de la cromatina tras alteraciones en el paisaje de la cromatina.
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Protocol
1. preparaciones
- preparar 100 mL de solución hipotónica tampón A: 0.3m sacarosa, 60 mM KCl, 60 mM Tris, pH 8.0, EDTA, de 2 mM y 0,5% NP-40. Almacenar a 4 º c.
Nota: Algunas líneas celulares, tales como HEK293T, requieren condiciones menos estrictas de lisis. Si los núcleos se Lisan fácilmente, usar pH HEPES Buffer modificado A: 25 mM 7.6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, EDTA 0,05 mM, 0.1% NP-40 y 10% glicerol. - Preparar una solución stock de 250 mL de solución x mRIPA 2: 100 mM Tris, pH 8.0, desoxicolato del sodio 2% NP-40 y el 0,5%.
- Prepare una solución de 5 M NaCl 100 mL.
- La x mRIPA y soluciones de NaCl de 5 M, 2 preparar 50 mL de solución de x mRIPA 1 para cada uno de las seis concentraciones de la sal: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM y 500 mM de NaCl. Antes de comenzar el experimento, enfriar todas las soluciones en hielo.
- Crecer células bajo condiciones deseadas.
Nota: Al determinar los efectos de derribar una proteína, SSE para la línea de precipitación debe ser comparado con las células de tipo salvaje. Estas SSE debe realizarse al lado del otro. Ejemplos de uso de inhibidores químicos o estímulos, consulte las secciones 3-5.
2. Extracción secuencial básica de la sal
- cosecha de 8 millones de células de cada Estado y lavar dos veces con 5 mL de PBS frío hielo.
Nota: Es crítico contar con igual número de las células a concentraciones de proteína equivalente. El número exacto de células deben optimizarse para las líneas individuales de la célula o proteínas particulares. Es importante no tener demasiados, ya que el aumento de las concentraciones de proteína impedirá la observación de la curva de elución, que depende de la Unión de equilibrio. Sin embargo, con demasiado pocas células puede no haber suficiente proteína para detectar la curva, y la pelotilla de la cromatina es más difícil de aislar y se puede perder entre fracciones de. - Resuspenda las células en 1 mL de tampón A + inhibidores de la proteasa, transferir a tubos de micro centrífuga de 1,5 mL y parte superior gira sobre la parte inferior a 4 º c durante 10 minutos
- Aislar los núcleos por centrifugación a 6000 x g durante 5 min a 4 º c.
Nota: Después de este paso el sobre nuclear debe estar intacto. Si la envoltura nuclear está intacta, el sedimento se resuspender completamente; sin embargo, cuando la envoltura es lisada y la cromatina se libera, la pelotilla no se vuelva a suspender. Si la envoltura nuclear no está intacta después de la incubación de tampón A, utilizar A. Buffer modificado - Añadir 200 μL de mRIPA 0 mM NaCl + proteasa inhibidores a cada pellet de núcleos antes de volver a suspender el pellet. Homogeneizar cada muestra por 15 veces el pipeteo con una pipeta de 1 mL. El diábolo debe resuspender fácilmente, sin embargo, los núcleos se Lisan y se pipetea la muestra será espesa y pegajosa y difícil de pipetear.
- Con el fin de elaborar de la pelotilla en la punta, golpee suavemente el extremo de la punta de la pipeta contra la parte inferior del tubo de centrífuga. El pellet no se disolverá completamente una vez que el ADN es liberado de los núcleos, pero pipeteando lo romperá arriba
- Cuando todas las muestras han sido homogeneizadas, Incube todas las muestras en hielo durante 3 min
Nota: El tiempo de incubación deba ser optimizada según la proteína de interés. - Pellets de cromatina aislado por centrifugación de las muestras por 3 min a 6500 x g a 4 º c.
- Transferencia de sobrenadante a una centrífuga de 1,5 mL limpia el tubo. Se trata de la fracción de 0 mM. Esta solución de mRIPA 0 mM puede actuar como un paso de lavado para lisis los núcleos y quitar cualquier sueltas proteínas no asociadas a cromatina.
- Añadir 200 μL de mRIPA 100 mM NaCl + proteasa inhibidores a cada pellet de cromatina antes de volver a suspender el pellet. Romper la pastilla de cromatina mediante pipeteo el diábolo hacia arriba y abajo 15 veces.
Nota: Es fundamental para estar acorde con el número de veces el sedimento en pipeta. - Incubar en hielo por 3 minutos. Este paso de incubación permite que todas las muestras para llegar a un estado de equilibrio, que es particularmente importante cuando hay múltiples muestras.
- Centrifugar a 6500 x g durante 3 min a 4 º c y transferir sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 mL.
- Repetir 2.6 2.10 para las restantes concentraciones de sal.
Nota: Después de 400 mM NaCl, mRIPA el pellet debe ser claro y gloopy y no se queda en la parte inferior del tubo. El pellet puede ser colocado en la tapa del tubo de la centrífuga mientras el sobrenadante aislado. - Añadir 70 μl de 4 x carga de proteína colorante a cada fracción y carga 30 μl de cada fracción en un gel de acrilamida SDS para la mancha blanca /negra occidental análisis.
Nota: Para determinar el perfil de unión de la proteína, es esencial cargar volúmenes equivalentes de las concentraciones de proteína igual lisado, en lugar de carga de. - Una mancha blanca /negra occidental estándar mediante la transferencia a una membrana y anticuerpos primarios para las proteínas de interés.
- Para cuantificar la proteína eluida de la cromatina, incubar el blot en secundarios anticuerpos de fluorescencia infrarroja IRDye y mancha blanca /negra en la imagen con un reproductor de imágenes. Aunque pueden utilizarse otros métodos de desarrollo, se recomienda la fluorescencia o la proyección de imagen infrarroja, ya que es más cuantitativa de la naturaleza.
- Uso ImageJ o software similar para calcular la intensidad para la proteína eluida a cada concentración de la sal. Graficando la intensidad de la banda contra la concentración de sal, se puede determinar el patrón de elución de la proteína de interés.
3. Extracción secuencial de la sal en presencia de un " lector de " inhibidor de la
- cosecha dos conjuntos de células (4 millones) y aislar a los núcleos como en un estándar SSE.
- Vuelva a suspender ambos conjuntos en 200 μL de mRIPA 0 mM NaCl e incubar durante 3 minutos. Esto permitirá la eliminación de cualquier proteína libre en el núcleo.
- Agregar 200 μL mRIPA 0 mM NaCl a cada pellet. Añadir el inhibidor (2 μl de 1 mM (+) JQ1) a una muestra y DMSO para el conjunto de controles.
- Agite el sedimento pipeteado por 15 veces e incubar en hielo por 5 min
- Centrifugar a 6500 x g durante 3 min a 4 º c y transferir sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 mL.
- 3.3-4 para todas las concentraciones de sal y realizar un estándar inmunoblot.
4. Extracción secuencial de la sal en presencia de un " escritor " inhibidor de la
- tratar las células con el inhibidor (10 μm SAHA) o DMSO para 3 h.
- Cosecha de 4 millones de células para cada tratamiento.
- Realizar una SSE estándar para las muestras con el inhibidor añadido a todos los buffers de.
5. Secuencial sal extracción siguientes daños en el ADN
- tratar las células con 1 doxorrubicina μm por 1 h.
- Cambiar los medios de comunicación en las células y permitirles recuperar para 3 h.
- Cosecha de 8 millones de células y realizar la básica SSE.
6. Extracción de la sal no-secuencial
- cosecha de 12 millones de células y lavar con PBS.
- División de las células por lo que hay 2 millones de células por el tubo de centrífuga micro.
- Vuelva a suspender en 500 μl de tampón A e incube por 10 min.
- Aislar los núcleos por centrifugación a 6000 x g.
- Vuelva a suspender las pelotillas en una 200 μL de cada uno de los búferes mRIPA + NaCl.
- Homogeneizar cada muestra por 15 veces el pipeteo con una pipeta de 1 mL.
- Incubar en hielo durante 3 min.
- Aislar la cromatina por centrifugación a 6500 x g y transferir el sobrenadante para limpiar tubos. Añadir 70 μl de colorante de carga y ejecutar 30 μL en un gel de SDS-page para la mancha blanca /negra occidental análisis.
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Representative Results
En este papel demostramos las ventajas y aplicaciones del método de extracción secuencial utilizado de la sal (SSE) que hemos adaptado de la literatura6. En la figura 1, se compara la reproducibilidad de SSE para extraer proteínas no secuencialmente mediante la detección de los patrones de elución de ARID1a y PBRM1. Constantemente observamos que ARID1a, una subunidad BAF, elutes principalmente a 200 mM NaCl y PBRM1, una subunidad PBAF exclusivo, elutes principalmente a 300 mM de NaCl. Figura 1a muestra tres repeticiones independientes de SSE con 8 millones de las células OVCA429. Figura 1b representa una extracción de la sal no secuencial donde se suspende de nuevo en un tampón salino solo núcleos aislados de células 2 millones. Aunque ambos métodos concluyen que ARID1a elutes a 200 mM y PBRM1 elutes en 300 mM, la SSE produce un perfil de enlace definidas y permite una clara distinción de la Unión de estos dos complejos. Además, en el método no secuencial, la cantidad de proteína eluida en los buffers de 400 mM y 500 mM de NaCl es menor que 300 mM y es coherente entre las tres repeticiones. Aunque este problema puede resolverse con más optimización de velocidad tiempo y centrifugación de incubación, esto ilustra la ventaja de la reproducibilidad de SSE.
A través de la optimización, encontramos que otros complejos de la cromatina pueden requerir más tiempo para ser eluidos. En la figura 2, nos demuestran que el activador transcripcional, PBAF, elutes de cromatina constantemente entre contribuyeron con tiempos de incubación de 3 min y 10 min. Por el contrario, elución del represor transcripcional, 1 complejo represivo de Polycomb (PRC1), indicado por BMI-1, requiere un tiempo de incubación para ser liberado de cromatina8. Este fenómeno podría ser debido a PRC1 está localizado en más compactas e inaccesibles regiones del genoma, o podría ser debido a la cinética de atascamiento diferencial de los dos complejos.
Después de la optimización para una proteína particular, contribuyeron puede utilizarse para estudiar cómo cambia la fuerza de unión a proteínas en diferentes condiciones. SSE puede utilizarse para examinar la efectividad de un inhibidor de las interacciones proteína-proteína. Para demostrar este concepto, utilizamos (+) JQ1, que es un inhibidor de BRD4 bromodominios, examinar cómo alterado BRD4 enlace (figura 3a)9. Se aislaron los núcleos de las células de OVCA429 4 millones. Para quitar cualquier BRD4 unbound, un lavado inicial 0 mM fue realizado en ambas muestras. Entonces un estándar que SSE realizó con DMSO o 1 μm (+) JQ1 añadido a cada fracción. Las muestras se incubaron durante 5 minutos. Observamos que BRD4 elutes antes en presencia del inhibidor en comparación con el DMSO. Para mostrar que (+) JQ1 es específico para BRD4, borrado para ARID1a y no vio ningún cambio en la elución (figura 3b).
A continuación examinamos cómo Unión a proteínas puede ser alterado cuando se modifica el paisaje de la cromatina. BRD4 contiene dos bromodomains que reconocen residuos de lisina acetilado histonas colas10. Para aumentar el nivel de acetilación de histonas, tratamos a las células de OVCA429 con el μm 10 del histona deacetilasa inhibidor suberanilohydroxamic ácido (SAHA) h. 3 SAHA (10 μm) se agregó a todos los búferes en el SSE. Al aumentar los niveles de acetilación de histonas global, hemos observado un incremento en BRD4 vinculante (figura 4a). Cuando borrar para ARID1a, observamos un atascamiento de ARID1a así, que no es de extrañar porque las subunidades de lo complejo, como el gen BRG1, BRM y BRD9, BAF todas contienen bromodomains10,11 (Figura 4b).
Por último, para exhibir cómo SSE se puede utilizar para mirar cómo la Unión a proteínas cambia cuando las células experimentan alteraciones genómicas, nos indujo a doble trenzado DNA rompe con el inhibidor de la topoisomerasa II, doxorrubicina12. Tratados las células HEK293T con 1 μm de doxorrubicina durante una hora y permite a las células para recuperarse durante tres horas. Después de realizar el SSE, hemos borrado de PBRM1, que participa en la de reparación de daños de ADN13. Observamos dos picos para el enlace de PBRM1: uno en 300 mM y uno en 500 mM NaCl (figura 5). Esto sugiere que parte de la población PBRM1 es obligatorio normalmente, pero un subconjunto de PBRM1 está más bien destinado a después de daño de la DNA de la cromatina. Esto es sólo un ejemplo de cómo utilizar SSE para examinar cómo las interacciones de cromatina se alteran en respuesta a diferentes estímulos externos.
Figura 1: No secuencial en comparación con extracciones secuenciales de sal en las células OVCA429
A) Immunoblots de y la cuantificación de la independiente tres réplicas de perfiles de elución ARID1a y PBRM1 por el método de extracción secuencial de la sal. B) Immunoblots y cuantificación de tres repeticiones independientes de perfiles de elución ARID1a y PBRM1 en el método de extracción de sal no secuencial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Comparación de tiempos de incubación de perfiles de elución PBAF y PRC1
A) comparación de perfiles de elución PBAF (PBRM1) con tiempos de incubación de 3 y 10 minutos. B) comparación de PRC1 perfiles de elución (BMI-1) con tiempos de incubación de 3 y 10 minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efectividad de (+) JQ1 en inhibición BRD4 enlace
A) patrón elución de BRD4 en presencia de 1 μm (+) JQ1 en comparación con el control de DMSO en las células OVCA429. B) Perfil de elución de ARID1a en presencia de 1 μm (+) JQ1 en comparación con el control de DMSO en las células OVCA429. Intensidad de la banda está indicado para 0 mM 500 mM fracción con DMSO o (+) JQ1.
Figura 4: Alteraciones en la Unión cuando se modifica la cromatina jardines
A) comparación de BRD4 elución de OVCA429 las células tratadas con 10 μm SAHA durante 3 horas en comparación con el tratamiento de DMSO. B) perfiles elución de ARID1a de OVCA429 células tratan with10 μm SAHA comparado con DMSO. Intensidad de la banda está indicado en la fracción de 0 mM - 500 mM con DMSO o SAHA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cambios en el atascamiento de PBRM1 después de daño de la DNA
Resultados de la SSE para PBRM1 Unión de las células HEK293T trataron con 1 μm doxorrubicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Caracterización de las interacciones proteína y cromatina mediante extracciones de sal es un método común que ha sido empleado durante décadas14,15; sin embargo, se ha no sido sistemáticamente optimizado antes de revelar su completa utilidad. Demostramos cómo este método secuencial proporciona una manera rápida y barata de distinguir cambios en el atascamiento de la cromatina cuando se altera la proteína o el medio ambiente. SSE es altamente adaptable y optimizable, y lo importante, es técnicamente simple y no requiere ningún equipo especializado. Son los aspectos clave que deben optimizarse antes de comenzar: a partir de numero de celular, tampón hipotónico condiciones y tiempo de incubación.
El aspecto más importante del numero de celular es que es constante entre todas las muestras. Al examinar complejos BAF, utilizando células 8 millones da un buen perfil de cómo estos complejos son vinculantes; sin embargo, el número de células (o la cantidad de búfer) deba ser ajustado dependiendo de la abundancia de la proteína de interés. Es importante tener en cuenta que con menos células es difícil porque en 400 mM y 500 mM de NaCl es difícil visualizar la pelotilla de la cromatina. Es vital para asegurarse de que la pastilla no se transfiere con el sobrenadante después de 400 mM de NaCl.
Para evaluar con precisión las proteínas nucleares, los núcleos deben permanecer intacto hasta que son lisis con 0 mM NaCl mRipa solución. Muchas soluciones hipotónicas utilizadas son demasiado duras para líneas celulares como las células HEK293T y HeLa. Para estas líneas celulares, se recomienda utilizar el búfer modificado A.
Por último, el tiempo de incubación puede variar según el experimento. Para las subunidades BAF el patrón de elución no cambia entre 3 min y 10 min de incubación; sin embargo, la elución del complejo PRC1 cambia drásticamente dependiendo de cuánto tiempo se incuban las muestras. Además, al evaluar el efecto de un inhibidor en la Unión de su destino, el tiempo de incubación necesitará optimizarse según cinética de inhibidores.
Al realizar el experimento, es importante ser lo más consistente posible con el tratamiento de las muestras. Para cada fracción, el tampón salino se debe agregar a cada muestra antes de homogeneización para que cada muestra es igualmente expuesto. El punto de pipeteo es romper para arriba el lanzamiento de cromatina y ayuda las proteínas encuadernadas. Es importante para asegurarse de que los pellets pasa por la punta de la pipeta. Especialmente cuando se utiliza un mayor número de células, la pelotilla de la cromatina es difícil pasar la punta de las primeras veces. Hemos encontrado que una punta de 1 mL funciona mejor para esto, ya que con pequeños golpecitos de la punta contra el fondo del tubo de centrífuga micro, somos capaces de elaborar de la pelotilla en la punta. Después de pasar el balín de la cromatina a través de la punta quince veces, el pellet debe moverse suavemente a través de la punta, aunque no se disolverá. Después de incubar las muestras en hielo y aislar la cromatina por centrifugación, eliminar el sobrenadante con una pipeta de 200 μL permite máxima eliminación sin perturbar el pellet de cromatina.
Aunque SSE requiere consistencia técnica, es simple, sencillo y puede realizarse con recursos comunes de laboratorio. Es importante tener en cuenta que el verdadero poder de este método es cuando se junta con otros exámenes fenotípicas. Por ejemplo, usando esta técnica, se compararon los perfiles de unión de PBRM1 cuando cada uno de sus seis bromodomains fueron transformados, se determinó que todos sino uno de los bromodomains estuvieron implicados en el enlace de PBRM1 a diferentes grados7. Curiosamente, encontramos que el bromodomains que eran los más importantes para atar también eran esenciales para PBRM1 regulación de la expresión génica y la proliferación de células de control7. También Validamos los cambios en el atascamiento de estos mutantes a un locus genómico discreto cuantitativo qPCR ChIP7.
Mostramos sólo algunos ejemplos de cómo puede utilizarse esta técnica para el estudio de las interacciones proteína-cromatina; sin embargo, en nuestro laboratorio hemos encontrado que SSE es una herramienta versátil para investigar una amplia gama de preguntas sobre la cromatina lector proteínas. En combinación con otros análisis, esta técnica facilita nuestra capacidad de dilucidar la funcionalidad de los componentes que comprende estos elaborar complejos de la proteína. Mediante la comprensión de la importancia de dominios individuales, podemos identificar si son potenciales dianas terapéuticas para el desarrollo de un inhibidor que bloquea Asociación de cromatina.
Hemos demostrado cómo SSE puede ampliarse para evaluar la efectividad de un inhibidor de molécula pequeña de proteínas de unión a cromatina. Además, mediante la inhibición de escritores epigenéticos y gomas de borrar, SSE puede determinar la relación entre los niveles de la PTM y proteínas del lector. También hemos demostrado que el SSE puede utilizarse para determinar los cambios en el atascamiento en respuesta a estímulos externos tales como daños en el ADN. Aunque se trata de una técnica sencilla, cuando se aplica en las condiciones adecuadas, puede avanzar enormemente nuestro conocimiento de cromatina y sus proteínas reguladoras.
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Disclosures
Los autores tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por un premio de erudito de V (V2014-004) y un erudito V plus (D2016-030) Premio de la Fundación V para la investigación del cáncer y un americano cáncer institucional investigación beca Society (ACS IRG Grant 58-006-53) al centro de la Universidad de Purdue para el cáncer Investigación. E. G. P. fue apoyado por el Borch posgrado Premio de dotación al Departamento de Farmacología Molecular y Química Medicinal de la Universidad de Purdue.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
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