Summary
Tuz çıkarımı sıralı bağlı Kromatin proteinleri büyük protein kompleksleri bağlama özelliklerini belirlemek için yararlı bir araçtır. Bu yöntem tek tek alt birimleri veya etki alanlarında bulunan genel benzeşme Kromatin toplu olarak karmaşık bir proteinin rolü değerlendirmek için istihdam edilebilir.
Abstract
Aydınlatma proteinleri Kromatin hedefleme bağlama özellikleri Kromatin karmaşık doğası ve en memeli Kromatin değiştirme kompleksleri türdeş olmayan doğası nedeniyle çok zor olabilir. Bu engelleri aşmak için Kromatin-bağlı kompleksleri göreli bağlama benzeşim değerlendirmek için bir sıralı tuz ayıklama (SSE) tahlil adapte olması. Bu kolay ve basit tahlil sigara-uzmanlar tarafından benzeşme iki ilgili kompleksleri, benzeşim bir kompleks bir alt birim kaybolur veya bir etki alanı denetleyicisindeki inaktive değişimler ve değişikliği bağlama göreli farkı değerlendirmek için kullanılabilir bağlama benzeşme Kromatin manzara için değişiklik sonra. Sırayla tuz miktarda artan toplu Kromatin yeniden askıya tarafından biz Kromatin belirli bir protein elüsyon profil edebiliyoruz. Bu profilleri kullanarak, biz değişiklikler Kromatin değiştirme karmaşık veya değişiklikler Kromatin ortamına bağlama etkileşimleri etkilemesi tespit edebiliyoruz. SSE diğer içinde in vitro ve in vivo deneyleri ile kaplin, biz bireysel etki alanları ve proteinleri Kromatin ortamlarda çeşitli bir kompleks işlevselliğinin rolleri belirleyebilirsiniz.
Introduction
DNA düzenlemesi ökaryotik hücrelerde hücre içi ve hücre dışı uyaranlara yanıt koordine proteinler bir ürün yelpazesine tarafından sıkı bir şekilde kontrol karmaşık ve sofistike bir sistemdir. DNA Histon octamers gevşek DNA dağıtılmış veya sıkı bobinleri1sıkıştırılmış form oluşturarlar için etrafında sarılır. Bu Yapısal düzenleme DNA ve Histon okumanıza, yazmanıza ve sonrası translasyonel modifikasyonlar (PTM) Histon2silmek proteinlerin bir ağ tarafından düzenlenen Kromatin olarak bilinir. Asetilasyon gibi bazı Histon PTMs, amino asit onlar, Histon ve DNA2arasındaki etkileşim değiştiren yatırılan ücret değiştirin. Histon PTMs aynı zamanda transkripsiyon regülatör, Kromatin remodelers, DNA hasar onarım makineleri ve DNA çoğaltma makineleri genom3özel bölgeler için recruit hizmet.
Kromatin etkileşimleri çalışmak için pek çok yöntem küçük ölçekli etkileşimleri soruşturma veya büyük genom çapında analizleri dahil. Vitro bağlama çalışmalar genellikle bireysel rekombinant etki alanlarında Histon peptidler veya DNA deneyleri Elektroforez hareketlilik shift deneyleri (EMSAN), izotermal titrasyon Kalorimetre, Floresans polarizasyon ve peptid pulldowns gibi kullanmak. Bu deneyleri genellikle bir bireysel protein etki alanında odaklanmak çünkü onlar bulmaca küçük bir parça anlayış kolaylaştırmak, ama çok protein rollerini bırak, birden çok etki alanı proteinler kooperatif doğasını anlamak için bize izin verme kompleksleri. Başka tabaka-in karışıklık en memeli Kromatin değiştirme kompleksleri heterojen bileşimi tarafından eklenir. Bu protein heterojenite Kromatin peyzaj dinamik yapısı ile birlikte bu etkileşimleri Kromatin proteinleri Kromatin içinde vitroiçin bağlama vivo özetlemek için zor yapar.
Vivo yöntemler önemli gelişmeler yaptık; Ancak, pahalı, zaman alıcı ve teknik olarak zor çoğu zaman. Önemli optimizasyon4gerektirir ancak Kromatin immunoprecipitation (ChIP-seq) sıralama tarafından takip çok arasında soykırım, proteinler ve Histon değişiklikleri yerelleştirilmesini belirlemek için kullanışlıdır. Proteinler çoğu kez çapraz Kromatin etkileşimleri korumak için; Ancak, bu yapay etkileşimler oluşturabilir ve5maskeleme epitope neden olabilir. Ayrıca, immunoprecipitations (IP) çok özel antikorlar ve DNA kesme ve ChIP-qPCR genellikle kullanılabilir bir temanındeğildir bilinen bağlama sitesini kullanarak IP koşulları geniş optimizasyonu gerektirir. Optimizasyon çip koşullardan sonra işleme örnekleri maliyetlidir ve ay sıra ve analiz için birkaç hafta gerektirir. Bu yöntem çok değerli olmasına rağmen Kromatin lokalizasyonu tanımlamak için proteinler bağlı genom maliyet ve süre taahhüdü engelleyici küçük değişiklikler küresel bağlama özellikleri etkilemesi hakkında hipotezler oluşturmak için bu yöntemi kullanmak için yapmak .
Bu yazıda, sıralı tuz ayıklama (SSE) tahlil küresel bağlama profilleri Kromatin bağlı proteinlerin incelemek ve bir protein, karmaşık veya genel PTM profil değişiklikleri etkileşimleri nasıl değiştirebilir ayırt etmek için nasıl kullanılabileceği açıklanmaktadır. Tuz çekimi geniş ve yaygın olarak kullanılan bir teknik olmasına rağmen nasıl sıralı bu yöntem son derece tekrarlanabilir ve çok yönlü olduğunu göstermektedir. SSE için toplu Kromatin kompleksi'nın genel ilgi nasıl bir kompleks veya hatta tek bir etki alanında tek bir alt birim katkıda karakterize için bize izin verir. SSE bağlama bir protein Kromatin ortamındaki değişikliklerden ChIP-seq ve diğer genom geniş çalışmaları kullanarak doğruladı Histon işareti hedefleme için ilginç hipotezler sağlayan etkilenir eğer belirlemek için de kullanılabilir.
Aslında bu yöntem--dan Wu Polybromo1 işlevinin incelemek için vd., uyarlanmış (PBRM1) bağlama PBAF Kromatin remodeler6,7. Bu tekniği kullanarak, biz PBRM1 rolü için karmaşık remodeling PBAF Kromatin içinde Kromatin bağlamasını belirlenir ve bu işlev7altı bireysel bromodomains göreli katkısını belirledi.
Burada nasıl bir protein Kromatin çıkarılması bir kimyasal inhibitörü incelemek için benzer Kromatin kompleksleri, değiştirme göreli bağlama benzeşme değerlendirmek için farklı hücre tipleri bağlamasında Kromatin keşfetmek için bu yöntem en iyi duruma getirmek için açıklamak ve Kromatin bağlama Kromatin manzara için değişiklik sonra etkilerini belirlemek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlıklar
- Hipotonik eriyik arabellek A: 0,3 M hazırlamak 100 mL sukroz, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA ve % 0,5 NP-40. 4 ºC mağaza.
Not: HEK293T gibi bazı hücre hatları daha az sıkı lysing koşullar gereklidir. Çekirdeği kolayca parçalayıcı, değiştirilme tarihi arabellek A: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0.05 mM EDTA, % 0,1 NP-40 ve %10 gliserol kullanın. - 2 x mRIPA çözüm 250 mL stok çözeltisi hazırlamak: 100 mM Tris pH 8.0, % 2 NP-40 ve %0,5 sodyum deoxycholate.
- 100 mL stok 5 M NaCl çözeltisi hazırlamak.
- 2 x mRIPA ve 5 M NaCl çözümleri, kullanarak hazırlamak 50 mL 1 x mRIPA çözeltisi her altı tuz konsantrasyonu için: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM ve 500 mM NaCl. Denemeyi başlatmadan önce serin buz üzerinde tüm çözümler
- Grow hücre satırları istenen koşullar altında.
Not: bir protein vurma etkilerini belirlerken, SSE devirme satırı için wildtype hücrelere kıyasla gerekir. Bu SSE yan yana gerçekleştirilmelidir. Kimyasal inhibitörleri ya da bir çekim gücü kullanan örnekler için 3-5 bölümlerine bakın.
2. Temel sıralı tuz çıkarımı
her- hasat 8 milyon hücre durumu ve yıkama buz soğuk PBS ile iki kez 5 mL.
Not: Eşit eşdeğer protein konsantrasyonları için hücre sayısı için önemlidir. Sayısına sahip hücreleri tek hücre satırları veya belirli proteinler için optimize edilmiş olması gerekir. Yok ki çok fazla protein konsantrasyonları artış gözlem denge bağlama üzerinde bağlıdır elüsyon eğrinin engeller gibi. Ancak, çok az hücrelerle olabilir eğri algılamak için yeterli protein ve Kromatin Pelet için zordur yalıtmak ve kesirler arasında kaybolabilir. - Hücreleri arabelleği A 1 mL + proteaz inhibitörleri yeniden askıya alma, 1,5 mL mikro santrifüj tüpleri ve 10 dakika süreyle 4 ° C'nin altındaki döndürme üstünden içine transfer
- Tarafından Santrifüjü 6000 x g 4 ºC, 5 min için de çekirdeklerin yalıtmak.
Not: bu adımdan sonra nükleer zarf hala bozulmamış olması gerekir. Nükleer zarf sağlamsa, pelet tamamen yeniden askıya alacak; Ancak, zaman zarfı lysed ve Kromatin yayımlanır, pelet yeniden askıya alacak değil. Nükleer zarf arabellek A kuluçka sonra sağlam değilse, modifiye tampon A. kullanmak
Her hücre çekirdeği pelet pelet yeniden askıya almadan önce için - eklemek 200 µL mRIPA 0 mM NaCl + proteaz inhibitörleri. Her örnek 1 mL pipet ile 15 kez pipetting tarafından lunaparkçı. Pelet kolayca yeniden askıya, ancak, çekirdekleri gibi bu pipetted ve örnek olacak kalın ve yapışkan ve pipet zor koşullar.
- Kadar Pelet ucunu çekmek, pipet ucu santrifüj tüpü dibine karşı sonuna dokunun için
- . Pelet tam olarak bir kez DNA çekirdeklerin serbest, ama pipetting kıracak o yukarıya eriyecektir değil
- Ne zaman tüm örnekleri homojenize, kuluçkaya buz 3 dakika süreyle tüm örnekleri
Not: Kuluçka zaman faiz protein bağlı olarak en iyi duruma getirilmiş gerekebilir. - Örnekleri için 4 ºC de 6500 x g, 3 dk centrifuging tarafından ayrı tut moduyla Kromatin Pelet.
- Transfer süpernatant temiz 1.5 mL santrifüj için tüp. Bu 0 mM kesir olacak. Bu 0 mM mRIPA çözüm çekirdeklerin lizis bir yıkama adım olarak hareket edebilir ve herhangi bir gevşek proteinleri Kromatin ile ilişkili olmayan kaldırmak.
- Eklemek 200 µL mRIPA 100 mM NaCl + proteaz inhibitörleri her Kromatin pelet pelet yeniden askıya almadan önce için. Kromatin pelet pelet yukarı ve aşağı 15 kez pipetting tarafından kırmak.
Not: Bu kaç kez Pelet içinde pipetted ile tutarlı olacak şekilde önemlidir. - Incubate 3 dakika buzda. Bu kuluçka adım ne zaman birden çok örnekleri var özellikle önemli olan bir denge durumu ulaşmak tüm örneklerini sağlar.
- 3 dk 4 ºC ve süpernatant temiz 1.5 mL tüp transferi için 6500 x g, santrifüj.
- Tekrar 2.6-2,10 için kalan tuz konsantrasyonları.
Not: 400 mM NaCl sonra mRIPA Pelet aptallar ve açık olmalı ve tüp alt kısmında kalmak olmaz. Pelet santrifüj tüpü izole süpernatant süre kapağı yerleştirilebilir. - 4 protein yükleme x 70 eklemek µL boya her bölümü için ve her kesir bir SDS Akrilamid jel western blot analizi için üzerine 30 µL yük.
Not: bağlama profil protein belirlemek için bu lysate yerine, yükleme eşit protein konsantrasyonları eşdeğer miktarda yüklemek için önemlidir. - Standart bir western blot bir membran transfer ederek gerçekleştirmek ve faiz proteinler için birincil antikorlar kullanın. Kromatin eluted protein quantitate
- kuluçkaya kızılötesi floresan IRDye ikincil antikorlar blot ve görüntü leke bir Görüntüleyici ile. Diğer yöntemleri geliştirme kullanılabilir ise, doğada daha nicel olarak floresan veya kızılötesi görüntüleme öneririz.
- Kullanım ImageJ veya benzer yazılım yoğunluğu her tuz konsantrasyonu eluted protein için hesaplamak için. Grup yoğunluğu tuz konsantrasyonu karşı grafiklerini çizerek, elüsyon desen senin protein ilgi belirlenebilir.
3. Sıralı tuz çıkarımı varlığı bir " okuyucu " inhibitörü
- iki hücre (4 milyon) hasat ve çekirdeklerin olduğu gibi standart bir SSE yalıtmak.
- Her iki mRIPA 0 mM NaCl 200 µL içinde yeniden askıya alma ve kuluçkaya 3 dakikadır. Bu çekirdeklerin ücretsiz herhangi bir protein kaldırılması için sağlayacaktır.
- Eklemek 200 µL mRIPA 0 mM NaCl her Pelet için. İnhibitörü (1 mm (+) JQ1 2 µL) bir örnek ve DMSO denetim kümesine ekleme.
- Propaganda pelet tarafından 15 kez pipetting ve 5 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya
- 3 dk 4 ºC ve süpernatant temiz 1.5 mL tüp transferi için 6500 x g, santrifüj.
- 3.3-4 için tuz konsantrasyonları tekrarlayın ve standart Batı leke gerçekleştirmek.
4. Sıralı tuz çıkarımı varlığı bir " yazar " inhibitörü
- tedavi inhibitörü (10 µM SAHA) içeren hücreleri veya DMSO 3 h. için
- Her tedavi için 4 milyon hücre hasat.
- İçin tüm arabellekleri eklendi inhibitörü ile örnekleri için standart bir SSE gerçekleştirmek.
5. Sıralı tuz ayıklama aşağıdaki DNA hasar
- 1 µM doksorubisin 1 h. için hücrelerle tedavi
- Hücreleri medyada değiştirmek ve onları için 3 h. kurtarmak izin
- 8 milyon hücre hasat ve temel SSE gerçekleştirmek.
6. Sigara sıralı tuz çıkarma
- 12 milyon hücre hasat ve yıkama PBS ile.
- Bölmek hücreleri böylece mikro santrifüj tüpü başına 2 milyon hücre.
- Arabellek A 500 µL içinde yeniden askıya alma ve 10 dk. için kuluçkaya
- Çekirdeklerin Santrifüjü 6000 x g. adlı tarafından izole
- Yeniden askıya 200 bir µL her mRIPA arabellekleri + NaCl unsurlardandır.
- 1 mL pipet ucu ile 15 kez pipetting tarafından her örnek lunaparkçı.
- Incubate on Ice 3 dakika süreyle
- Tarafından Santrifüjü 6500 x g, Kromatin yalıtmak ve tüpler temizlemek için süpernatant aktarın. Boya yükleme 70 µL ekleyin ve western blot analizi için SDS-sayfa jel 30 µL çalıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yazıda, avantajları ve uygulamaları edebiyat6adapte olması sık kullanılan sıralı tuz ayıklama (SSE) yöntemi göstermektedir. Şekil 1' de, biz proteinler ardışık olarak sigara ARID1a ve PBRM1 elüsyon şekillerinin algılayarak ayıklama SSE tekrarlanabilirlik karşılaştırın. Biz sürekli olarak ARID1a, BAF alt birimi, öncelikle 200 mM NaCl ve PBRM1, bir özel PBAF alt birim elutes, öncelikle 300 mM NaCl elutes görmekteyiz. Şekil 1a SSE üç bağımsız çoğaltır 8 milyon OVCA429 hücreleri ile gösterir. Şekil 1b sıralı olmayan bir tuz çıkarma nerede 2 milyon hücreleri izole çekirdekleri tek bir tuz arabelleğe yeniden askıya alınmış olduğunu gösteriyor. Her iki yöntem ARID1a 200 mM elutes ve PBRM1 300 mM elutes sonucuna rağmen SSE iyi tanımlanmış bağlama profil üretir ve bu iki komplekslerin bağlama net bir ayrım için sağlar. Ayrıca, Birbirini izlemeyen yöntemde, 400 mM ve 500 mM NaCl arabellekleri eluted protein miktarı 300 mM daha düşüktür ve üç çoğaltır arasında tutarlı değil. Bu sorunu daha da kuluçka süresi ve Santrifüjü hız optimizasyonu ile çözülmüş olabilir ama bu SSE tekrarlanabilirlik avantajı göstermektedir.
Bizim optimizasyon ile bulduk diğer Kromatin kompleksleri eluted için daha fazla zaman gerekebilir. Şekil 2' de, transkripsiyon harekete geçirmek, PBAF, Kromatin SSEs 3 dk ve 10 dk kuluçka süreleri ile arasında tutarlı bir şekilde elutes göstermektedir. Buna ek olarak, BMI-1 tarafından belirtilen elüsyon, transkripsiyon önleyici, Polycomb baskıcı karmaşık 1 (PRC1), Kromatin8yayımlanması için daha uzun bir kuluçka zaman gerektirir. Bu olay nedeniyle PRC1 genom, daha kompakt ve ulaşılmaz bölgelerinde lokalize ya da iki kompleksleri için fark bağlama Kinetik nedeniyle olabilir.
Belirli bir protein için optimizasyon sonra SSEs nasıl değiştiğini protein bağlayıcı gücü farklı koşullarda çalışmak için kullanılabilir. SSE protein-protein etkileşimlerinin bir inhibitörü etkinliğini incelemek için kullanılabilir. Biz bu kavramı göstermek için (+) BRD4 bromodomain inhibitörü olan JQ1 nasıl BRD4 bağlama (şekil 3a)9değişmiş incelemek için kullanılan. Çekirdeklerin 4 milyon OVCA429 hücreleri izole. İlişkisiz herhangi bir BRD4 kaldırmak için bir ilk 0 mM yıkama her iki örnekleri üzerinde gerçekleştirildi. Sonra SSE DMSO veya 1 µM (+) ile gerçekleştirilen bir standart JQ1 her kesir için ekledi. Örnekleri için 5 dakika inkübe. Biz BRD4 daha önce DMSO için karşılaştırıldığında inhibitörü huzurunda elutes görmekteyiz. O (+) JQ1 BRD4 için özel olduğunu göstermek için ARID1a için deyimiyle ve elüsyon (3b şekil) bir değişiklik gördüm.
Sonraki Kromatin peyzaj değiştirildiğinde protein bağlayıcı nasıl değiştirilebilir inceledi. BRD4 acetylated lizin artıkları Histon kuyrukları10tarihinde tanımak iki bromodomains içerir. Histon asetilasyon düzeyini artırmak için biz 10 µM Histon deacetylase inhibitörü suberanilohydroxamic asit (SAHA) 3 h. SAHA OVCA429 hücrelerle tedavi (10 µM) sırasında SSE için tüm arabellekleri eklendi. Küresel Histon asetilasyon düzeylerini artırarak, biz (şekil 4a) bağlama BRD4 bir artış gözlendi. ARID1a için kurutma, biz de, ARID1a daha sıkı bağlama BAF BRG1, BRM ve BRD9, gibi karmaşık alt birimleri tüm bromodomains10,11 (şekil 4b) içerdiğinden hangi şaşırtıcı değil gözlemleyebilirsiniz.
Son olarak, biz çift telli DNA sonları topoizomeraz II inhibitörü, doksorubisin12ile indüklenen SSE hücreleri genomik değişiklikler karşılaştığınızda ne kadar protein bağlayıcı değiştirir bakmak için nasıl kullanılabileceğini sergilemek. Bir saattir doksorubisin 1 µM HEK293T hücrelerle tedavi ve hücreleri üç saat boyunca kurtarmak izin verdi. SSE gerçekleştirdikten sonra DNA hasar onarım13' te yer PBRM1 için deyimiyle. Biz PBRM1 bağlama için iki doruklarına gözlenen: 300 mM ve bir 500 mm NaCl (şekil 5). Bu normalde PBRM1 nüfus bazıları bağlama ancak bir alt kümesini PBRM1 daha sıkı DNA hasar takip Kromatin bağlı göstermektedir. Bu nasıl Kromatin etkileşimleri farklı dış uyaranlara yanıt olarak değiştirilmiş incelemek için SSE kullanmayı gösteren bir örnektir.
Resim 1: Sıralı tuz çekimi OVCA429 hücrelere göre sıralı olmayan
A) Immunoblots ve miktar üç bağımsız sıralı tuz ayıklama yöntemi tarafından ARID1a ve PBRM1 elüsyon profilleri çoğaltır. B) Immunoblots ve miktar üç bağımsız çoğaltır ARID1a ve PBRM1 elüsyon profilleri olmayan tuz çıkarma yöntemi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: PBAF ve PRC1 elüsyon profilleri kuluçka zamanlarında karşılaştırılması
A) PBAF (PBRM1) elüsyon profilleri 3 ve 10 dakika kuluçka kez ile karşılaştırılması. B) PRC1 karşılaştırılması (BMI-1) elüsyon profilleri ile 3 ve 10 dakika kuluçka kez. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: BRD4 bağlama inhibe üzerinde (+) JQ1 verimliliğini
A) BRD4 elüsyon paterni 1 µM (+) DMSO denetim OVCA429 hücrelere kıyasla JQ1 huzurunda. B) ARID1a elüsyon profil 1 µM (+) DMSO denetim OVCA429 hücrelere kıyasla JQ1 huzurunda. Grup yoğunluğu 0 mM - 500 mM kesir DMSO veya (+) JQ1 ile için endikedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Değişiklikler çevre düzenlemesi Kromatin değiştirildiğinde bağlamada
A) BRD4 elüsyon OVCA429 hücrelerden karşılaştırılması için 3 saat DMSO tedavisi için karşılaştırıldığında 10 µM SAHA ile tedavi. B) ARID1a OVCA429 hücrelerden elüsyon profilleri Tahrik tamburu 10 µM DMSO için karşılaştırıldığında SAHA tedavi. Grup yoğunluğu 0 mM - 500 mM kesir DMSO veya SAHA için endikedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Değişiklikler PBRM1 bağlamayı sonra DNA hasarı
SSE sonuçları PBRM1 bağlama HEK293T hücrelerden için tedavi ile 1 µM doksorubisin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein ve Kromatin etkileşimleri aracılığıyla tuz çekimi karakterizasyonu istihdam edilmiş bir ortak için onlarca yıl14,15yöntemidir; Ancak, bu sistematik olarak daha önce nedeniyle ortaya çıkarmak için optimize edilmiştir değil. Biz göstermek ne kadar hızlı ve ucuz bir şekilde protein veya çevre değiştirildiğinde Kromatin bağlama değişiklikleri ayırt etmek için sıralı bu yöntemi sağlar. Son derece uyumlu ve en iyi hale getirilebilen SSE ve önemlisi, bu teknik olarak basit ve hiçbir özel ekipman gerektirir. Başlatmadan önce optimize edilmiş olması gerekir önemli yönleri vardır: cep numarası, Hipotonik arabellek koşulları ve kuluçka süresi başlangıç.
Cep numarası en önemli özelliği tüm örnekleri arasında tutarlı olmasıdır. BAF kompleksleri ararken, 8 milyon hücre kullanarak iyi bir profilin nasıl bu komplekslerin bağlama verir; Ancak, hücre sayısı (veya arabellek miktarı) faiz protein bereket bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. 400 mM ve 500 mM NaCl Kromatin Pelet görselleştirmek zor çünkü az sayıda hücre kullanarak zordur unutmamak gerekir. Pelet süpernatant ile 400 mM NaCl sonra transfer edilmez emin olmak çok önemlidir.
Doğru nükleer proteinler değerlendirmek için çekirdek onlar 0 mM NaCl mRipa çözüm lysed kadar bozulmamış kalmak gerekir. Çok sık kullanılan Hipotonik çözüm HEK293T ve HeLa hücreleri gibi hücre hatları için çok sert. Bu hücre hatlarında değiştirilmiş arabellek A. kullanılması önerilir
Son olarak, kuluçka zaman deneme bağlı olarak değişebilir. BAF alt birimleri için 3 dk arasında 10 dk kuluçka elüsyon desen değiştirmez; Ancak, PRC1 kompleks elüsyon büyük ölçüde örnekleri ne kadar inkübe bağlı olarak değişir. Ayrıca, hedefine bağlama bir inhibitör etkisini değerlendirirken, kuluçka süresi inhibitörü Kinetik bağlı olarak optimize edilmiş olması gerekebilir.
Deney gerçekleştirirken, mümkün olduğu kadar tutarlı örnekleri tedaviyle olmanız önemlidir. Böylece her örnek aynı derecede maruz her kesir için salt arabellek her örnek homojenizasyon önce eklenmelidir. Pipetting amacı ilişkili proteinler kadar Kromatin ve yardım yayın parçalamanızdır. Pelet pipet ucu geçer emin olmak önemlidir. Özellikle hücreleri daha çok sayıda kullanırken, Kromatin Pelet ilk birkaç kez pipet ucu geçmek zordur. İpucu mikro santrifüj tüpü dibine karşı küçük dokunarak ile biz kadar Pelet ucunu çekmek edebiliyoruz olarak bulduk 1 mL bahşiş bunun için en iyi çalışır. Değil eriyecektir rağmen Kromatin Pelet ucu üzerinden on beş kez geçtikten sonra Pelet sorunsuz ipucu taşımak gerekir. Buz üzerinde örnekleri kuluçka ve Kromatin Santrifüjü tarafından izole sonra süpernatant 200 µL pipet ucu ile kaldırmak Kromatin Pelet aksatmadan için maksimal kaldırma sağlar.
SSE teknik tutarlılık gerektirir rağmen basit, kolay ve yaygın laboratuar kaynaklarını ile gerçekleştirilebilir. Diğer phenotypical sınavları ile birleştiğinde bu yöntemin gerçek güç olduğunu unutmamak gerekir. Örneğin, bu tekniği kullanarak, her biri kendi altı bromodomains mutasyona uğramış ne zaman biz PBRM1 bağlama profilleri karşılaştırıldığında, bromodomains biri dışındaki tüm derece7değişen için PBRM1 bağlamasında karıştığını belirledi. Çoğu intriguingly konularda, biz bağlama için önemli olduğunu bromodomains da gen ekspresyonu ve denetim Hücre proliferasyonu7PBRM1 düzenlenmesi için gerekli bulundu. Ayrıca nicel ChIP-qPCR7tarafından bağlama için ayrı bir genomik odağı bu mutantların değişimler geçerliliği.
Biz sadece birkaç örnek bu teknik protein-Kromatin etkileşimleri çalışmaya nasıl kullanılabileceğini göstermiştir; Ancak, bizim laboratuarımızda SSE soru Kromatin okuyucu proteinler ile ilgili geniş bir dizi araştırma için çok yönlü bir araç olduğunu bulduk. Diğer analizler ile birlikte, bu teknik yeteneğimizi kolaylaştırır bunlar oluşan bileşenlerin işlevselliğini aydınlatmak ayrıntılı protein kompleksleri. Kromatin Derneği engeller bir inhibitörü gelişimi için potansiyel tedavi hedefleri olup bireysel etki alanları önemini anlayarak, biz belirleyebilir.
Biz nasıl SSE protein bağlayıcı Kromatin için bir küçük molekül engelleyici etkinliğini değerlendirmek için Genişletilebilir gösterdi. Ayrıca, epigenetik yazarlar ve silgi engelleyerek, SSE PTM düzeyleri ve okuyucu proteinler arasındaki ilişkiyi belirleyebilirsiniz. SSE bağlama DNA hasarı gibi dış uyaranlara yanıt olarak değişiklikleri belirlemek için kullanılabilir da göstermiştir. Bu basit bir teknik, uygun koşullarda uygulandığında olmasına rağmen büyük ölçüde Kromatin ve onun düzenleyici proteinler ile ilgili bilgilerimizi ilerletebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.
Acknowledgments
Bu eser kanser için bir V bilim adamı Ödülü (V2014-004) ve V bilim adamı artı Ödülü (D2016-030) kanser araştırmaları için V Vakfı ve bir Amerikan Kanser Derneği kurumsal araştırma bursu (ACS IRG Grant 58-006-53) Purdue Üniversitesi Merkezi tarafından desteklenmiştir Araştırma. E. G. s. Borch lisansüstü Bağış Ödülü Purdue Üniversitesi tıbbi kimya ve moleküler Farmakoloji bölümü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes--many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -H., Kim, S., Park, E. -J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
