Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تحليل الجذعية الصرف في الأعمدة والطبقات

Published: March 23, 2017 doi: 10.3791/55410
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 1
1Section on Neuronal Connectivity, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (NIH), 2Mathematical and Statistical Computing Laboratory, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH), 3Biomedical Imaging Research Services Section, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH)

Summary

هنا، وتبين لنا كيفية تحليل التوجيه شجيري من الخلايا العصبية النخاع ذبابة الفاكهة في الأعمدة وطبقات. يتضمن سير العمل تقنية التصوير المزدوج بغية تحسين جودة الصورة والأدوات الحاسوبية لتعقب وتسجيل العرش الجذعية لمجموعة عمود إشارة ولتحليل الهياكل الجذعية في الفضاء 3D.

Abstract

في مناطق كثيرة من الجهاز العصبي المركزي، مثل الفصوص البصرية الطاير والقشرة الفقاريات، ويتم تنظيم الدوائر متشابك في طبقات والأعمدة لتسهيل الأسلاك الدماغ أثناء التطور ومعالجة المعلومات في الحيوانات المتقدمة. الخلايا العصبية بعد المشبكي التشعبات المعقدة في أنماط نوع معين في طبقات محددة لالمشبك مع محطات قبل المشبكي المناسبة. يتكون neuropil النخاع ذبابة من 10 طبقات ونحو 750 الأعمدة. ومعصب كل عمود من التشعبات أكثر من 38 نوعا من الخلايا العصبية النخاع، والتي تتطابق مع المحطات محور عصبي من بعض 7 أنواع من afferents بطريقة نوع معين. تفاصيل هذا التقرير الإجراءات لصورة وتحليل التشعبات من الخلايا العصبية النخاع. يتضمن العمل ثلاثة أقسام: (ط) قسم التصوير المزدوج عرض يجمع بين اثنين من مداخن صورة متحد البؤر التي تم جمعها في التوجهات المتعامدة في صورة 3D عالية الدقة من التشعبات. (ثانيا) التغصنات البحث عن المفقودين وقسم التسجيل يتتبع شجيريالعرش في 3D وتسجل آثار الجذعية لمجموعة عمود المرجعية؛ (ج) يحلل قسم تحليل شجيري أنماط شجيري فيما يتعلق الأعمدة والطبقات، بما في ذلك إنهاء وإسقاط مستو الاتجاه طبقة محددة العرش الجذعية، ويستمد تقديرات شجيري المتفرعة وإنهاء الترددات. البروتوكولات تستخدم الإضافات مخصصة بنيت على MIPAV مفتوحة المصدر (الطبية المعالجة التصوير، والتحليل، والتصور) منصة والعرف أدوات العمل باللغة مصفوفة المختبر. معا، وهذه البروتوكولات سير العمل الكامل لتحليل التوجيه شجيري من الخلايا العصبية النخاع ذبابة الفاكهة في طبقات والأعمدة، لتحديد أنواع الخلايا، وتحديد العيوب في المسوخ.

Introduction

خلال التنمية، الخلايا العصبية التشعبات المعقدة في أنماط متفرعة معقدة ولكنها نمطية لتشكيل نقاط الاشتباك العصبي مع شركائهم قبل المشبكي. أنماط المتفرعة شجيري ترتبط بالهوية وظائف الخلايا العصبية. المواقع العرش شجيري تحديد نوع المدخلات قبل المشبكي التي يتلقونها، في حين أن شجيري المتفرعة التعقيد والميدان الأحجام تنظم عدد المدخلات. وهكذا، والخصائص المورفولوجية الجذعية هي العوامل الحاسمة في اتصال متشابك وحساب الخلايا العصبية. في العديد من مناطق أدمغة المعقدة، مثل الفصوص البصرية الطاير وشبكية العين الفقارية، ويتم تنظيم الدوائر متشابك في الأعمدة وطبقات لتسهيل معالجة المعلومات 1، 2. في مثل هذه المنظمة عمود وطبقة الخلايا العصبية قبل المشبكي من مميزة لمحاور المشروع طريقة لإنهاء في طبقة معينة (ما يسمى استهداف طبقة معينة)، وتشكل مجموعة منظمة ثنائية الأبعاد (حتى-كاليد خريطة طبوغرافية)، في حين تمتد الخلايا العصبية بعد المشبكي التشعبات من الأحجام المناسبة في طبقات محددة لتلقي المدخلات قبل المشبكي من أنواع الصحيح والأرقام. حين محور عصبي استهداف طبقات والأعمدة ويتم دراستها جيدا 3، 4، لا يعرف الكثير الكثير عن كيفية توجيه التشعبات إلى طبقات محددة وتوسيع بشكل مناسب الحجم حقول تقبلا لتشكيل اتصالات متشابك مع الشركاء قبل المشبكي الصحيح 5. وقد أعاق صعوبة التصوير وقياس شجيري استهداف طبقات والأعمدة دراسة التطور الجذعية في هياكل الدماغ عمودية ومغلفة.

ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية النخاع هي نموذج مثالي لدراسة التوجيه الشجيرية والتجمع الدائرة في الأعمدة وطبقات. ويتم تنظيم neuropil النخاع ذبابة كما شعرية 3D من 10 طبقات ونحو 750 الأعمدة. ومعصب كل عمود من قبل مجموعة من afferents، بما في ذلك عhotoreceptors R7 / R8 والخلايا العصبية الصفيحة L1 - L5، التي تشكل الخرائط الطبوغرافية في طبقة محددة الأزياء 6 محطات المحاور. حوالي 38 أنواع من الخلايا العصبية النخاع موجودة في كل عمود النخاع والتشعبات وضع في طبقات محددة ومع أحجام الحقول المناسبة للحصول على مدخلات من هذه afferents 7. وقد أعيد بناء الدوائر متشابك في النخاع على المستوى المجهري الإلكترون. وبالتالي، فإن الشراكات متشابك راسخة 7، 8. وعلاوة على ذلك، تتوفر 9، 10، 11 الأدوات الوراثية لوصفها أنواع مختلفة من الخلايا العصبية النخاع. من خلال دراسة ثلاثة أنواع من transmedulla (تيم) الخلايا العصبية (TM2، Tm9 وTm20)، حددنا سابقا اثنين من خلية من نوع محدد سمات شجيري: (ط) الخلايا العصبية تيم التشعبات في أي الأمامي أو الخلفي الاتجاه تتوقع (مستو مسقطةالاتجاه ection)، اعتمادا على أنواع الخلايا و (ب) التشعبات من الخلايا العصبية النخاع تنتهي في طبقات النخاع محددة بطريقة خلية من نوع معين (إنهاء طبقة محددة) 12. مستو الاتجاه إسقاط وإنهاء طبقة محددة كافية لتمييز هذه الأنواع الثلاثة من الخلايا العصبية تيم، في حين أن الطفرات التي تعطل الردود تيم لطبقة والعمود العظة تؤثر على جوانب محددة من هذه الصفات.

هنا، نقدم سير العمل كاملا لدراسة الزخرفة الجذعية من الخلايا العصبية النخاع ذبابة الفاكهة في الأعمدة وطبقات (الشكل 1). لأول مرة، وتبين لنا طريقة التصوير المزدوج الرأي، والذي يستخدم برمجيات معدة للجمع بين اثنين من صورة مبائر مداخن لتوليد صور الخواص ذات جودة عالية. هذا الأسلوب يتطلب الوحيد متحد البؤر التقليدية المجهري لتوليد صور عالية الجودة التي تسمح لتتبع موثوق بها من الفروع الشجيرية، دون اللجوء إلى super-قرار المجهري، ومثل هذاالصورة STED (الانبعاث المستحث استنفاد) أو الإضاءة الهيكلية. ثانيا، نحن نقدم وسيلة لتتبع العرش الجذعية ولتسجيل آثار محوار مما أدى إلى مجموعة عمود إشارة. ثالثا، نقدم لك مجموعة من الطرق الحسابية لاستخراج المعلومات حول اتجاه مستو إسقاط وإنهاء طبقة محددة من التشعبات، وكذلك لاشتقاق تقديرات شجيري المتفرعة وإنهاء الترددات. معا، وهذه الأساليب تسمح لتوصيف أنماط الجذعية في 3D، وتصنيف أنواع الخلايا على أساس الأشكال التضاريسية الجذعية، وتحديد العيوب المحتملة في المسوخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: بروتوكول يحتوي على ثلاثة أقسام: ثنائي رأي التصوير (الأقسام 1-3)، تتبع شجيري والتسجيل (الأقسام 4-6)، وتحليل شجيري (الأقسام 7-9) (الشكل 1). وتقدم رموز وملفات سبيل المثال في جدول المواد / المعدات.

1. المزدوج صورة اكتساب

ملاحظة: تم تصميم هذه الخطوة للحصول على اثنين من مداخن صورة من الخلايا العصبية من الاهتمام في توجهات اثنين متعامد (الأفقية والأمامية).

  1. إعداد العقول ذبابة التي تحتوي على المسمى قليلة الخلايا العصبية النخاع (~ 10 خلية / الدماغ الفص) مع علامة غشاء GFP (mCD8GFP)، كما هو موضح سابقا (12). وصمة عار في الدماغ مع الأرنب مكافحة GFP (لالتشعبات العصبية النخاع) والفأرة mAb24B10 (لمحاور مبصرة)، الأجسام المضادة الأولية، والأجسام المضادة الثانوية فلوري (اليكسا 488 المضادة للأرنب واليكسا 568 الأجسام المضادة للماوس)، كما هو موضح سابقا13. مسح الدماغ في 70٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني 1X.
  2. لتركيب الدماغ في الاتجاه الأفقي (2A الأرقام، B)، ونقل الطاير الدماغ مسح الجلسرين إلى انخفاض 20 ميكرولتر من antifade المتوسطة المتزايدة في وسط شريحة.
  3. إرفاق بقع صغيرة من الطين في 4 زوايا ساترة لمنع ساترة من سحق عينة الدماغ أثناء التركيب.
    ملاحظة: توفر بقع الطين توسيد لمنع ساترة من سحق العينة. يجب أن يكون كل التصحيح الطين حوالي 1 ملم في القطر.
  4. تحت المجهر تشريح، ضع العقول في موقف بطني المتابعة ووضع ساترة على رأس لتأمين الدماغ. استخدام السطح الظهري محدب من الدماغ كمعلم لتحديد اتجاه عينة الدماغ (الشكل 2A).
  5. الحصول على صورة كومة الأول (عرض أفقي) مع المجهر متحد البؤر. استخدام عدسة موضوعية عالية NA (مثل 63X 1.3 NA الجلسرين أو الغمر النفط objeعدسة التفاعلية الذي نظمه) وتقريب رقمي 2.5x و (حجم بكسل 0.105 ميكرون لكل بكسل، وعدد المتوسط ​​هو 2). الحصول على أكثر من 180 المقاطع البصرية (512 × 512 بكسل) لتغطية neuropil النخاع مع حجم خطوة من 0.2 ميكرون.
  6. قم بإعادة تحميل الدماغ كما هو موضح في الخطوات 1،3-1،4، ولكن محاذاة الدماغ في موقف الأمامي المتابعة (عرض مباشر).
  7. الحصول على صورة كومة الثاني (عرض مباشر) من نفس الخلايا العصبية، كما هو موضح في الخطوة 1.5.
    ملاحظة: العثور على نفس الخلايا العصبية قد تكون صعبة عندما يكون هناك العديد من الخلايا العصبية المسماة في الفص البصري. للتعرف على نفس الخلايا العصبية من كل التوجهات، المنخفض التكبير مداخن صورة من وجهتي النظر قد تكون هناك حاجة (على سبيل المثال، استخدام التكبير من 0.7، وحجم خطوة من 0.45 ميكرون إلى اكتساب منخفضة الدقة مداخن صورة). إذا كانت الصورة أكبر من 512 × 512، وينبغي اقتصاص الصورة إلى 512 × 512 قبل الجمع الصورة، وحجم البكسل يجب أن تبقي في 0.105 ميكرون لكل بكسل في حين تصوير ميدانية واسعة. فقدان الإشارةمشكلة محتملة للالأنسجة العميقة. إذا كانت الإشارة ضعيفة، صورة النصف بطني من الدماغ. للحد من photobleaching من خلال المسح الضوئي، واستخدام منخفضة كقوة الليزر ممكن. استخدام مؤشر مجموعة للتحقق من التعرض المفرط قبل الحصول مداخن صورة. إذا كان ذلك ممكنا، واستخدام المجهر متحد البؤر مجهزة للكشف عن GaAsP.
  8. تحديد وتسجيل موقع من الخلايا العصبية في المصالح فيما يتعلق neuropil النخاع (يمين / يسار [R / L] وظهري / بطني [D / V]). تحقق مما إذا انتقلت عينة خلال الحصول على الصور عن طريق فحص كومة الصورة.
    ملاحظة: عينة تتحرك في كثير من الأحيان بسبب تصاعد غير لائق. في حالة حدوث حركة عينة، المكدس صورة لا يمكن استخدامها لتسجيل ويجب التخلص. إعادة تحميل العينة والحصول على مداخن صورة من نفس الخلايا العصبية.

2. صورة Deconvolution

ملاحظة: يستخدم خطوة deconvolution البرمجيات صورة deconvolution لاستعادة الصور التي يتم الحصول عليها تدهورت بسبب عدم وضوحوالضوضاء. في حين أن هذا الخطوة اختيارية، ويحسن إلى حد كبير على جودة الصورة. فمن المستحسن استخدام مداخن صورة deconvolved لتسجيل الصورة والجمع في القسم 3.

  1. بدء تشغيل البرنامج deconvolution في الوضع التفاعلي. تحميل كومة صورة (في مغلق أو شكل المجهري معين) عن طريق اختيار القائمة: ملف / فتح (أو Ctrl-س) في النافذة الرئيسية.
  2. انقر لتحديد كومة صورة تحميل واختيار القائمة: العمليات لفتح نافذة تشغيل الصورة. استخدام كلاسيك إمكانية قصوى تقدير (CMLE) خوارزمية الافتراضية.
  3. في إطار العملية صورة، انقر فوق "معلمات" علامة التبويب. أدخل المعلمات المناسبة على المدى المتوسط عدسة الغمر، وتضمين المتوسطة، والفتحة العددية (على سبيل المثال، النفط، الجلسرين، الخ.) (على سبيل المثال، النفط الغمر، الخ.) (NA، وهنا تم استخدام 1.3). تحقق المعلمات المتبقية للتأكد من أنها تعكس ظروف التصوير بشكل صحيح. انقر فوق علامة التبويب "تعيين كافة التحقق" إلى finاليز إعدادات المعلمة.
  4. في إطار العملية صورة، انقر فوق "تشغيل" علامة التبويب. تعيين جهة الإخراج (على سبيل المثال، ج). أدخل الأرقام المناسبة في "الإشارة / الضوضاء في قناة" (على سبيل المثال، "12 12 12 12" هو نقطة انطلاق جيدة، في حين أن الإعداد الافتراضي هو "20 20 20 20"). استخدام الإعدادات الافتراضية للمعلمات المتبقية.
  5. انقر على "تشغيل قيادة" علامة التبويب لبدء deconvoluting كومة الصورة؛ يمكن أن تستغرق هذه العملية تصل إلى عشرات دقائق لإكمال، اعتمادا على الكمبيوتر.
  6. في الإطار الرئيسي، انقر فوق وحدد كومة صورة deconvolved. اختيار القائمة: حفظ باسم لحفظ الصورة deconvolved في شكل ملف صورة ICS (ics. و .ids).
    ملاحظة: كل كومة صورة له ملفين: ملف ICS يحتوي على معلومات رأس وملف هويات يحتوي على معلومات الصورة الخام.
    1. إعادة تسمية ملفات الصور كومة وفقا لتوجهات التصوير (على سبيل المثال، اسم أفقي عرض صورة الصورةالمسامير H.ids وH.ics وأمامي-عرض صورة كومة F.ids وF.ics).

3. ثنائي عرض صورة الجمع

ملاحظة: هذه الخطوة يجمع بين اثنين صورة مداخن لتوليد صور عالية الدقة 3D باستخدام برنامج MIPAV.

  1. توليد المصفوفات لمزيج صورة.
    1. بدء تشغيل البرنامج MIPAV. تحميل H و F مداخن صورة عن طريق اختيار القائمة: ملف / فتح صورة (A) من القرص (أو Ctrl-و) /H.ids وF.ids. سوف تظهر نافذة صورتين.
    2. حدد الصورة H بالنقر على الصورة واختيار القائمة: أدوات المرافق / تحويل / RGB / غرايز. سوف تظهر نافذة GrayG، GrayB، والصور GrayR.
    3. إغلاق GrayR وGrayB، وحفظ فقط GrayG على النافذة.
    4. حدد الصورة F بالنقر على الصورة واختيار القائمة: أدوات المرافق / تحويل / RGB / غرايز. سوف تظهر نافذة GrayG1، GrayB1، والصور GrayR1.
    5. إغلاق GrayR1 وGrayB1 والحفاظ على GrayG1 فقط على النافذة. في هذه الخطوة، غرام فقطAYG وGrayG1 هي على النافذة.
    6. حدد GrayG (تمييز)، اختر القائمة: الخوارزميات / تسجيل / محسن صورة التسجيل التلقائي. سوف مربع الحوار "محسن التلقائي صورة التسجيل 3D" يطفو على السطح.
      1. في خيارات الإدخال، تغيير "درجة من الحرية" من الافتراضي "أفيني-12" إلى "محددة إعادة مقياس-9". في "دوران" المفتاح في -105 إلى 105 في "دوران مجموعة أخذ العينات زاوية" (الافتراضي: -30 إلى 30 درجة)، و 10 في "زيادة زاوية الخشنة" (الافتراضي: 15 درجة)، و 3 في "الجميلة زيادة زاوية "(الافتراضي: 6 درجات).
    7. انقر فوق موافق؛ سيتم إنشاء مصفوفة الأول "GrayG_To_GrayG1.mtx" وحفظها في مجلد الصور. إغلاق جميع النوافذ الصورة وانتقل إلى الخطوة التالية. هذه الخطوة سوف يستغرق 15 دقيقة على الأقل.
    8. تحميل H و F مداخن صورة عن طريق اختيار القائمة: ملف / فتح صورة (A) من القرص (أو Ctrl-و) /H.ids وF.ids، كما في الخطوة 3.1.1.
    9. حدد الصورة H بالنقر على الصورة واختيار القائمة: أدوات المرافق / تحويل / RGB / رمادي. فإن "> RGB- رمادي" مربع الحوار يطفو على السطح. انقر فوق موافق؛ سوف تظهر نافذة الصور "HGray". الحفاظ HGray وإغلاق صورة H.
    10. كرر الخطوة 3.1.9 للصورة F. سوف تظهر "FGray" الصور على النافذة. الحفاظ FGray وإغلاق صورة F. فقط HGray وFGray ستترك على النافذة.
    11. حدد الصورة HGray (تمييز) وانتقل إلى القائمة: أدوات الخوارزميات / تحويل / تحويل. سوف مربع الحوار "تحويل / إعادة تجميع عينة عشوائية صورة" يطفو على السطح. انقر على "إعادة تجميع عينة عشوائية" التبويب وتغيير إعادة تشكيله لحجم "HGray" إلى "FGray". بعد ذلك، انقر على "تحويل" التبويب وتحميل "GrayG_To_GrayG1.mtx" عن طريق اختيار "اقرأ مصفوفة من ملف". انقر فوق موافق؛ سوف تظهر نافذة الصورة HGray_transform. إغلاق صورة HGray يترك ذلك إلا HGray_transform وFGray على النافذة.
    12. حدد "HGray_transform & #34؛ صورة (تمييز) وانتقل إلى القائمة: الخوارزميات / تسجيل / محسن التلقائي صورة التسجيل. سوف مربع الحوار "محسن التلقائي صورة التسجيل 3D" يطفو على السطح. في "دوران" المفتاح في -5 إلى 5 في "دوران مجموعة أخذ العينات زاوية" (الافتراضي: -30 إلى 30 درجة)، و 3 في "زيادة زاوية الخشنة" (الافتراضي: 15 درجة)، و 1 في "الجميلة زيادة زاوية "(الافتراضي: 6 درجات). انقر فوق موافق.
      ملاحظة: أفيني مصفوفة (HGray_transform_To_FGray.mtx) سيتم إنشاء وحفظها في مجلد الصور و"HGray_Transform_register" صورة سيتم عرضها على النافذة. وهذه الخطوة تستغرق 40 دقيقة على الأقل.
    13. إغلاق "HGray_transform" الصورة؛ فقط "HGray_Transform_register" و "FGray" ينبغي أن تترك على النافذة.
    14. حدد "HGray_Transform_register" صورة (تمييز) وانتقل إلى القائمة: الخوارزميات / تسجيل / B-المفتاح التسجيل التلقائي 2D / 3D. و"B-المفتاح تسجيل تلقائيعلى 3D كثافة "سوف مربع الحوار يطفو على السطح. اختر" المربعات "في وظيفة التكلفة (الافتراضي هو نسبة الارتباط).
      1. انقر على "تنفيذ بتمريرين التسجيل". في قسم ممر 1، مفتاح في 2 في "أصل التدرج تصغير الخطوة الحجم (وحدات العينة)" (الافتراضي هو 1) والمفتاح في 10 إلى "الحد الأقصى لعدد تكرارات:" (الافتراضي هو 10). في قسم ممر 2، مفتاح في 1 في "أصل التدرج تصغير الخطوة الحجم (وحدات العينة)" (الافتراضي هو 0.5) والمفتاح في 2 في "الحد الأقصى لعدد تكرارات:" (الافتراضي هو 10).
        ملاحظة: مصفوفة نلت، "HGray_transform_register.nlt،" سيتم حفظها في مجلد الصور وسيظهر "HGray_transform_register_registered" صورة على النافذة. وهذه الخطوة تأخذ 5 دقائق على الأقل.
    15. إغلاق كافة الصور الموجودة على النافذة.
  2. توليد صورة مرجعية لمزيج صورة.
    ملاحظة: ويقصد هذه الخطوة إلى GENERأكلت صورة أفقية مسجل للمجموعة.
    1. تحميل H وصورة F أكوام عن طريق اختيار القائمة: ملف / فتح صورة (A) من القرص (أو Ctrl-و) /H.ids وF.ids. سوف تظهر صورتين على النافذة.
    2. حدد الصورة H (تمييز) وانتقل إلى القائمة: أدوات الخوارزميات / تحويل / تحويل. سوف مربع الحوار "تحويل / إعادة تجميع عينة عشوائية صورة" يطفو على السطح. انقر على "إعادة تجميع عينة عشوائية" التبويب وتغيير إعادة تشكيله من حجم "H" إلى "واو" بعد ذلك، انقر على "تحويل" التبويب وتحميل "GrayG_To_GrayG1.mtx" عن طريق اختيار "اقرأ مصفوفة من ملف". انقر فوق موافق؛ سوف تظهر الصورة H_transform على النافذة. إغلاق صورة H ولكن يبقى H_transform وF في الإطار.
    3. حدد "H_transform" صورة (تمييز) وانتقل إلى القائمة: أدوات الخوارزميات / تحويل / تحويل. سوف مربع الحوار "تحويل / إعادة تجميع عينة عشوائية صورة" يطفو على السطح. انقر على "إعادة تجميع عينة عشوائية" التبويب وتغيير إعادة تشكيله من حجم "H_transform" إلى "F. & #34؛ بعد ذلك، انقر على "تحويل" التبويب وتحميل "HGray_transform_To_FGray.mtx" عن طريق اختيار "اقرأ مصفوفة من ملف". انقر فوق موافق؛ سوف تظهر "H_transform_transform" صورة على النافذة. إغلاق صورة H_transform. عند هذه النقطة، سوف يترك فقط H_transform_transform وF على النافذة.
    4. حدد "H_transform_transform" صورة (تمييز) وانتقل إلى القائمة: أدوات الخوارزميات / تحويل / تحويل غير الخطية. سوف مربع "B-المفتاح غير الخطية التحول" الحوار يطفو على السطح. المقبل، تحميل "HGray_transform_register.nlt" وانقر فوق موافق. سوف تظهر "H_transform_transform_registered" صورة على النافذة. حفظ الصورة كملف ICS. إغلاق كافة الصور الموجودة على النافذة.
  3. الجمع بين أكوام صورة
    ملاحظة: هذه الخطوة هو الجمع بين اثنين من مداخن صورة المكتسبة في التوجهات المتعامدة (الأفقية والأمامية) في واحدة كومة عالية الدقة.
    1. الذهاب إلى القائمة: الإضافات / عام / ذبابة الفاكهة الشبكية ريجistrationl. سوف مربع الحوار "ذبابة الفاكهة الشبكية التسجيل v2.9" يطفو على السطح. تحميل "H.ics" في صورة H "H_transform_transform_registered" من الخطوة 3.2.4 في صورة H-عضو مسجل، "F.ics" في صورة F، "GrayG_To_GrayG1.mtx" من الخطوة 3.1.7 في التحول 1-الأخضر (اختياري )، "HGray_transform_To_FGray.mtx" من الخطوة 3.1.12 في تحويل 2-أفيني، و "HGray_transform_register.nlt" من الخطوة 3.1.14 في تحويل 3-اللاخطية (اختياري).
      1. تحديد الجذر التربيعي (الكثافة ح خ كثافة-F) ولا إعادة مقياس في "إعادة مقياس H إلى واو" إبقاء الخيارات الافتراضية للمعلمات المتبقية. انقر فوق موافق؛ هذه الخطوة سوف يستغرق حوالي 3 دقائق.
        ملاحظة: بعد المعالجة، سيتم إنشاء 3 مجموعات من الصور: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (الصورة معاد النهائية)، greenChannelsImage-Gxreg-غراي-Gcomp.IDS (قناة خضراء لH، F، وصورة معاد النهائية)، وredChannelsImage- Rxreg-ري-Rcomp.ids (القناة الحمراء FOص H، F، وصورة معاد النهائية)؛ سيتم تغيير حجم جميع الملفات الإخراج إلى 512 × 512 × 512.
    2. فتح "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" في إطار برنامج صورة التصور. حفظ كومة الصورة في شكل نظام الرصد الدولي وإعادة تسمية الملف. وسيتم استخدام هذا الملف صورة معاد للبحث عن المفقودين محوار والتسجيل.

4. بحث عن المفقودين Neurite ونقطة مرجعية تعيين

ملاحظة: هذه الخطوة هي لتتبع neurites التي (4.1) وتعيين نقاط مرجعية للتسجيل (4.2) باستخدام برنامج صورة التصور.

  1. تتبع neurites التي
    1. بدء تشغيل البرنامج صورة التصور. فتح ملف الصورة معاد. الذهاب إلى القائمة: تحرير / مشاهدة العرض التعديل وإيقاف القناة مستقبلة للضوء (الأحمر).
    2. تصور الصورة في وضع "تفوق". بدوره على "ستيريو"، واستخدام وضع "رباعية عازلة" لتصور الصور 3D إذا كان الكمبيوتر مكافئuipped مع نظام المجسمة.
    3. الذهاب إلى القائمة: فق / الشعيرات لإضافة خيوط جديدة. انقر على "تخطي إنشاء التلقائي، يدويا تحرير" علامة التبويب.
    4. انقر فوق علامة التبويب "رسم" وحدد "AutoDepth."
    5. حدد "إعدادات"، حدد "الخط"، والمفتاح في عدد بكسل المناسبة لتحسين التصور (يتم استخدام خط 4 بكسل في هذا البروتوكول). اختيار "إظهار التشعبات،" "ابتداء من نقطة"، و "المتفرعة نقاط". تعيين "تقدم الجودة" إلى 100٪.
    6. حدد "رسم" علامة التبويب والبدء في تتبع neurites التي. نبدأ مع محور عصبي ومن ثم الانتقال إلى التشعبات (الشكل 2D). محور عصبي والتشعبات من الخلايا العصبية transmedulla من السهل تمييز.
      ملاحظة: الخلايا العصبية تيم تمتد محور عصبي لها من جسم الخلية والمشاريع على طول الطريق إلى مركز المعالجة البصرية العالي، وlobula. سيقوم النظام تلقائيا تحدد أول خيوط طويلة باعتباره محور عصبي وما تبقى من شعيرات قصيرة كماالتشعبات. إبقاء نقطة الانطلاق في بداية خيوط (عصبي) أثناء البحث عن المفقودين وتأكد من توصيل neurites التي تتبعها. دراسة نقاط المتفرعة ونقطة البداية. إذا لم يتم توصيل التشعبات، وسوف يتم تحديد نقطة بداية جديدة في خيوط غير متصل.
    7. بعد تتبع، انتقل إلى "إعدادات" ازل "ابتداء من نقطة" و "المتفرعة نقطة"، ثم انتقل إلى القائمة: فق / تصدير الكائنات المحددة ../. حفظ خيوط كملف مخترع (* .iv).
  2. تعيين نقاط مرجعية
    1. حدد "عرض تعديل العرض" وبدوره على كل القنوات التصوير. في هذا المثال، قناة 1 هي تلطيخ مبصرة وقناة 2 هو الخلايا العصبية Tm20 (GFP).
    2. الذهاب إلى القائمة: فق / قياس. حدد "تحرير" علامة التبويب وتحقق "قناة محددة:" (حدد القناة مبصرة [الأحمر]).
    3. تعيين نقطة مرجعية للطبقة العليا. الذهاب إلى القائمة: / فق / قياس البوياليلة لخلق نقاط القياس الجديدة. بمناسبة بداية طبقة M1 باعتبارها الطبقة العليا. ترتيب النقاط كما يلي: الاستوائية، الأمامي-الاستوائية، الأمامي، الأمامي-بطني، بطني، الخلفية، بطني، الخلفية،-الخلفي الاستوائية، والمركز (الشكل 3F)؛ تحديد مستقبلة للضوء مركز كما هو المرتبطة بالعمليات الأكثر الجذعية.
    4. تعيين طبقات R8 وR7 كما في الخطوة 4.2.3 (الشكل 3G). يجب إنشاء ثلاث نقاط القياس الفردية في خطوات 4.2.3 و 4.2.4.
    5. تصدير إحداثيات نقاط لكل طبقة. انقر على "الإحصاء" علامة التبويب، حدد "تفصيلا"، "القيم المحددة"، و "الوظيفة"؛ وانقر فوق "تصدير الاحصائيات على تبويب العرض لملف". حفظ باسم "قيم مفصولة بفواصل" (* CSV.).
    6. فتح ملفات csv ثلاثة (من خطوات 4.2.3 - 4.2.4) والجمع بين إحداثيات النقاط المرجعية 27 في ملف CSV جديد من النسخ واللصق (الأمر ه هو الأعلى، R8، وR7). رؤية المواد / الجدول المعدات واتباع نسق ملف سبيل المثال.

5. جامدة للجسم وTPS اللاخطية التسجيل

ملاحظة: هذه الخطوة هي لتسجيل آثار محوار (في شكل د) إلى مرجع عمود مجموعة ولإنشاء ملف SWC المسجلين باستخدام برنامج MIPAV. هذا الجزء يتطلب من الملفات التالية: كومة صورة معاد (.ids) من الخطوة 3.3، ملف نقطة مرجعية (CSV) من الخطوة 4.2، ومحوار ملف التتبع خيوط (.iv) من الخطوة 4.1.

  1. الذهاب إلى القائمة: الإضافات / عام / DrosophilaStandardColumnRegistration. سوف نافذة "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" يطفو على السطح.
  2. تحميل ملفات الصور (.ids)، ملف النقاط المرجعية (CSV)، وملف خيوط (.iv).
  3. حدد 9 نقاط لكل طبقة.
  4. تحديد موقف من الخلايا العصبية المصورة (LV / RD أو RV / LD).
  5. حدد "تسجيل جامدعلى وTPS "و" تسجيل جامد "لغير الخطية والتسجيل جامدة الجسم، على التوالي.
  6. الاختيار "إنشاء ملف SWC" لتوليد الناتج الملفات التالية: ملف تتبع محوار مسجل في شكل SWC (انظر المواد الخاصة / معدات لتعريف)، ملف الرابع مسجلة (.iv)، بتنسيق من محوار موحد (النص)، إحداثيات تحول (النص)، وصورة مشتركة (.ids).
  7. تغيير اسم ملف SWC. تطبيق اختصار الموقع إلى نهاية اسم الملف (الخطوة 1.7). على سبيل المثال، استخدام "Tm20_3_RV.swc" لTm20 الخلايا العصبية رقم 3 تقع في النصف البطنية من النخاع الصحيح.

6. توحيد لتكوين بزر الماوس الأيمن بطني

ملاحظة: هذه الخطوة هي لتحويل آثار محوار (في شكل SWC) إلى RV القياسية (بزر الماوس الأيمن بطني) التكوين باستخدام برنامج نصي مخصص "RV_standardization.m." هنا، وكتب السيناريو باللغة مصفوفة المختبر. اليجب أن تكون أسماء الملفات SWC مساهمة في الشكل التالي: "NeuronName _ _ عدد .swc التكوين" (على سبيل المثال، Tm20_3_LV.swc).

  1. فتح البرنامج النصي "RV_standardization.m".
  2. تحرير المعلمات التالية في قسم "إدخال المستخدم":
    1. اكتب أسماء من الخلايا العصبية دون ترقيم (على سبيل المثال، TM2، Tm20، وما إلى ذلك) في "neuron_names."
      ملاحظة: الافتراضي في "file_end_in" هي "_ * SWC،" الذي يبحث عن الملفات ذات الأسماء التي تحتوي على ( "*" هو البدل مطابقة أي عدد من الأحرف) "_ * SWC". الافتراضي "swc_file_end_out" هو "_f.swc"، والتي سوف تضيف "_f" إلى نهاية اسم الملف بعد التوحيد.
    2. حدد الدليل حيث الملفات SWC هي في "directory_in". حدد الدليل حيث سيذهب ملفات موحدة في "directory_swcout".
  3. تشغيل البرنامج النصي.
  4. Optional: استخدام Vaa3D 14 لتصور ملفات SWC والتحقق من صحة عملية التحويل.

7. حساب الجذعية التشعب وإنهاء الترددات

ملاحظة: يستخدم هذه الخطوة جامدة للجسم تسجيل ملفات SWC لحساب المقدرات كابلان ماير لاحتمال أن شريحة شجيري سيبلغ طول معين دون إنهاء. يستخدم هذا البرنامج النصي وظيفتين Dendritic_Tree_Toolbox: extractDendriticSegmentLengthDistribution وestimateDendriticSegmentLengthProbability.

  1. فتح البرنامج النصي "Branch_term_P.m".
  2. تحرير المعلمات التالية في قسم "إدخال المستخدم":
    1. تحديد مسار الملفات SWC جامدة هيئة مسجلة في "pathToSWCFiles" (على سبيل المثال، / Rigid_Registered_swc /). تحديد المسار الذي سوف يعقد في إخراج الرسومات في "pathToOutput." تحديد اسم الخلايا العصبية أو أنواع العصبية في "neuron_names" (على سبيل المثال، TM2، تيم20، الخ).
  3. تشغيل البرنامج النصي. مخرجات هي منحنى تقدير كابلان ماير لالمتفرعة شجيري وإنهاء الخدمة.
    ملاحظة: اختياري: تطبيق طريقة تركيب وظيفة لاستخراج من كابلان ماير المقدرون احتمال المحلي أن الجزء شجيري سوف تتفرع أو إنهاء.

8. قطعة أرض توزيع إنهاء طبقة معينة من الجذعية العرش

ملاحظة: هذه الخطوة المؤامرات توزيع محطات الجذعية في النخاع طبقات مختلفة مثل رسم بياني شريطي. ويمكن تطبيق هذا إلى الخلايا العصبية واحد، وهي مجموعة من الخلايا العصبية، أو مجموعة من الخلايا العصبية. يستخدم البرنامج النصي وظيفة extractDistributionAlongAxis من Dendritic_Tree_Toolbox.

  1. فتح البرنامج النصي "Layer_term.m".
  2. تحرير المعلمات التالية في قسم "إدخال المستخدم":
    1. حدد الدليل الذي يحتوي على الخطية مسجل ملفات SWC في "pathToSWCFiles" (على سبيل المثال، / Non_linear_Registered_swc /). حدد الدليل لإخراج الرسومات في "pathToOutput." تحديد اسم الخلايا العصبية أو أنواع العصبية في "neuron_names" (على سبيل المثال، TM2، Tm20، وما إلى ذلك).
  3. تشغيل البرنامج النصي البرنامج التعليمي. الإخراج هو رسم بياني لنسبة العقد محطة في طبقات النخاع محددة.

9. مؤامرة إسقاط اتجاه مستو من التشعبات

ملاحظة: هذه الخطوة المؤامرات الاتجاهات إسقاط مستو من التشعبات باعتباره مؤامرة القطبية. يستخدم البرنامج النصي وظيفة extractAngularDistribution من Dendritic_Tree_Toolbox.

  1. فتح البرنامج النصي "Planar_proj.m."
  2. تحرير المعلمات التالية في قسم "إدخال المستخدم".
    1. حدد الدليل الذي يحتوي على الخطية ملفات SWC مسجلة في "pathToSWCFiles" (على سبيل المثال، / Non_linear_Registered_swc /). حدد الدليل لإخراج الرسوم البيانية في "pathToOutput." تحديد اسمالخلايا العصبية أو أنواع العصبية في "neuron_names" (على سبيل المثال، TM2، Tm20، وما إلى ذلك).
  3. تشغيل البرنامج النصي. الإخراج هو مؤامرة القطبية من الاتجاهات إسقاط مستو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام الإجراء التصوير المزدوج عرض المعروضة هنا، تم تصوير دماغ الذبابة التي تحتوي على المسمى قليلة الخلايا العصبية Tm20 في اتجاهين متعامدين. قبل التصوير، كانت ملطخة الدماغ مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية المناسبة لتصور GFP ومستقبلة للضوء المحاور غشاء المربوطة. للتصوير، وشنت الدماغ لأول مرة في الاتجاه الأفقي (الشكل 2A، B). تم تصوير وTm20 الخلايا العصبية GFP المسمى والمحيطة محاور عصبية مستقبلة للضوء باستخدام المجهر متحد البؤر (الشكل 3A). ثم أعيد منحازة الدماغ (الشكل 2A، B)، ونفس الخلايا العصبية Tm20 إعادة تصوير في الاتجاه الأمامي (الشكل 3B). أثناء عملية التصوير، تم تحديد موقع الخلايا العصبية Tm20 كما في النصف بطني من neuropil النخاع الأيمن (التكوين RV). تم deconvolved هذين مداخن صورة باستخدام برنامج صورة deconvolution وتفصيلombined باستخدام MIPAV (الشكل 3C) لإنشاء صورة كومة المؤتلف (الشكل 3C). أظهر كومة صورة المؤتلف انخفاض كبير في تشويه المحوري مقارنة إما كومة الإدخال (الشكل 3A، B ').

باستخدام برنامج التصور صورة، وتتبع محور عصبي والتشعبات من الخلايا العصبية Tm20 (الشكل 3D) وحفظها كملف مخترع (رابعا). تم تعيين 27 نقطة إشارة على محاور مبصرة المحيطة الخلايا العصبية Tm20 (أرقام 3E - H) وحفظها كملف قيمة مفصولة بفواصل (CSV). تم تطبيق الملفات تغصناته تتبع وملف نقطة مرجعية لاحقا إلى المساعد العرف في MIPAV لتوليد آثار تغصناته جامدة الجسم مسجل ومسجلة غير خطيا في شكل ملف SWC. حولت آثار شجيري المسجلة لتكوين RV قياسي باستخدام السيناريو "RV_standardization.m". تيانه مسجل وكانت تصور موحدة ملفات التتبع الجذعية باستخدام Vaa3D للتحقق من صحة عمليات التسجيل والتوحيد (الشكل 3I).

لتحليل شجيري، مسجلة آثار الجذعية لتم جمع 15 الخلايا العصبية Tm20 و 15 الخلايا العصبية TM2. باستخدام "Branch_term_P.m" السيناريو، والمتفرعة وإنهاء احتمال من هذه الخلايا العصبية وقد تم تحليل باستخدام جامدة الجسم مسجل آثار شجيري (الشكل 4A، B). تظهر منحنيات كابلان ماير أن كلا النوعين العصبية لها المتفرعة مماثل والترددات تنتهي. ومع ذلك، TM2 لديه أدنى تردد تنتهي لشرائح طويلة (> 4 ميكرون، الشكل 4A) 12. لتحليل خصائص الجذعية المرتبطة طبقات والأعمدة، استخدمت آثار الجذعية التي تم تسجيلها بواسطة طريقة تسجيل غير الخطية. باستخدام "Layer_term_P.m" النصي مخصصة، وتوزيعحسبت الصورة من إنهاء طبقة محددة شجيري لTM2 وTm20 الخلايا العصبية (الشكل 4C، D). توزيعات متميزة من إنهاء طبقة محددة من TM2 وTm20 التشعبات تتفق مع الشركاء متشابك محددة في طبقات مختلفة: التشعبات TM2 تلقي المدخلات من L2 و L4 محطات محور عصبي في M2 و M5، على التوالي، في حين تتلقى التشعبات Tm20 المدخلات من R8 و L3 في M3 طبقة 8، 15، 16. باستخدام البرنامج النصي "Planar_proj.m"، تم تحليل الاتجاهات إسقاط مستو من TM2 وTm20 التشعبات ووجد أن تكون متميزة عن بعضها البعض: TM2 التشعبات مشروع الخلف بينما Tm20 التشعبات مشروع الأمامية 12 (الشكل 4E، F).

شكل 1
الشكل 1. سير العمل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الرقم إعداد 2. عينة لثنائي رأي التصوير والتماثل من العمود صفيف ذبابة الفاكهة النخاع. (A، B) عينة متزايدة لثنائي رأي التصوير. (A) ويظهر العرض كما لو كان يبحث في الدماغ من خلال ساترة. (ب) الرسوم التخطيطية لعينة المتصاعدة. لالأفق التصويرتل مداخن، تم تركيب المخ ملطخة المناعية الأولى في موقف بطني المتابعة. بعد الحصول على كومة الأول، والدماغ هو إعادة وضعه في موقف الأمامي المتابعة لتصوير كومة أمامي. ج: الأمامي. P: الخلفية. D: الظهري. الخامس: بطني. R: اليمنى. L: يسار. (C - E) والتماثل وتنظيم neuropil النخاع، ينظر في وضع أمامي. (C) محاور مبصرة، وصفت من قبل الأجسام المضادة 24B10 (الحمراء) استخدمت، لتصور تنظيم neuropil النخاع. يظهر الصورة كما لو كان يبحث من الخارج إلى داخل الدماغ. النمل: الأمامي. نقاط البيع: الخلفي. دور: الظهري. فين: بطني. مكافئ: خط الاستواء. (D) وجهة نظر عالية التكبير من (C) في أربعة أجزاء من neuropil النخاع في مستوى طبقة R7. يتم وضع علامة على محطات R7 المركزية النقاط الصفراء. وصفت الأمامي والاستوائية R7S مع النقاط الخضراء والأزرق السماوي، على التوالي. (E) تمثيل تخطيطي للتعاون النخاعمنظمة lumnar. لاحظ أن neuropils النخاع اليسار واليمين هي صورة مرآة، وظهري وبطني نصفين من كل neuropil كما تعكس الصور، مفصولة خط الاستواء. النقاط الحمراء تشير R7S الاستوائية، والتي هي النقاط المرجعية الأولى. الأرقام (1-9) والسهام تشير إلى ترتيب المهام نقطة مرجعية. شريط الحجم: 15 ميكرون في C. 5 ميكرون في D. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. إعادة التركيب صورة والنقطة المرجعية الواجب. (A - C) وصور متحد البؤر لالخلايا العصبية Tm20 واحدة المكتسبة في الأفقي (A) وأمامي الاتجاهات (B). وتظهر الصور كما التوقعات أقصى الشدة. محاور مبصرة وTm20 ن واحدوصفت euron مع Mb24B10 الأجسام المضادة (الأحمر) والمربوطة غشاء GFP (الخضراء) على التوالي. (C) معاد صورة (A، أحمر) و (ب، السماوي). من أجل الوضوح، وتظهر خلايا مستقبلة للضوء فقط. (A '- C') ثنائي التصوير يحسن القرار المحوري. الصورة معاد (A ') لديها من القرار أفضل من تلك التي للعرض أفقي (A') والصور أمامي الرؤية (B '). لوحات السفلي: وجهات عالية التكبير من المناطق محاصر في لوحات العليا. (D) للبحث عن المفقودين محور عصبي (أبيض) من الخلايا العصبية Tm20 واحدة. وأشير إلى نقطة البداية، ونقطة السماوي. (E) والنقاط المرجعية 27 (بقع بيضاء) على محاور عصبية مستقبلة للضوء 9 المحيطة الخلايا العصبية Tm20 تستخدم كما المعالم. النقاط المرجعية هي في ثلاث طبقات: أعلى، R8 وR7. احالة نقطة (F) المرجع في كل طبقة. تعيين نقطة مرجعية يتبع فل أجل خوار: خط الاستواء (المعادلة)، الأمامي-خط الاستواء (AE)، الأمامي (A)، الأمامي بطني (AV)، بطني (V)،-الخلفي البطنية (PV)، الخلفي (P)، الخلفي-خط الاستواء (PE) ، والمركز (C). (G) تمثيل تخطيطي للمجموعة العمود النخاع استخدمته للتسجيل. ويرد الخلايا العصبية Tm20 (الخضراء). طبقات النخاع (M1-6) هي المشار إليها كما. (H) مثال من طبقة وتعيين نقطة مرجعية لعمود واحد. وتستخدم ثلاث طبقات لتعريف كل عمود: أعلى، R8، وR7 (تقاطع M5 / 6 طبقات). (I) مسجلة وموحد محوار أثر تصور باستخدام Vaa3D. مقياس شريط: 5 ميكرون في ألف لAC. 5 ميكرون في A 'لA'-C'؛ 5 ميكرون في D، E، F، وزاي الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

410fig4.jpg "/>
الرقم 4. أمثلة من نتائج من تحليلات الجذعية. (A، B) تم التخطيط تقديرات كابلان-ماير (المحور الصادي) من المتفرعة شجيري (A) وإنهاء (B) في مقياس لوغاريتمي فيما يتعلق طول القطعة (محور س). خطوط الصلبة والمنقطة دلالة المتوسطات ± الانحرافات المعيارية. TM2 (الحمراء)، وTm20 (أسود) مشاركة المتفرعة مماثل والترددات إنهاء لشرائح أقل من 4 ميكرون. (C، D) المدرج الإحصائي تبين نسبة متوسط من العقد الجذعية الطرفية في كل النخاع طبقة (M). يتم احتساب نسبة العقد الطرفية في طبقة النخاع البداية نظرا لكل خلية عصبية من نوع معين، وبعد ذلك بلغ متوسط ​​على كل الخلايا العصبية من هذا النوع. تظهر أشرطة عمودية الانحراف المعياري للنسبة. لاحظ أن لالخلايا العصبية TM2 (C)، وتوزيع العقد الجذعية الطرفية تتركز في طبقة النخاع 2، وبلغت ذروتها طفيفة في طبقة 5، في حين تيم 20 الخلايا العصبية(د)، ويتركز توزيع في جميع أنحاء طبقات M2 و M3. (E، F) المؤامرات القطبية للاتجاه مستو الإسقاط من التشعبات. تم احتساب نسبة العقد النهائية المتوقعة في غضون بن الزاوي (20 درجة) أولا لكل خلية عصبية من نوع معين، وبعد ذلك بمعدل متوسط ​​على جميع الخلايا العصبية من هذا النوع. تظهر المنحنيات الحمراء والزرقاء متوسط ​​نسبة ± الانحراف المعياري. زوايا على منحنيات هي نقاط المنتصف من صناديق الزاوي. تظهر الدوائر السوداء القيم نسبة تدل عليه الأرقام السوداء إلى جانبهم. لاحظ أنه، في المتوسط، وتوجه فئتين من الخلايا العصبية في اتجاهين متعاكسين تقريبا. ج: الأمامي. P: الخلفية. D / V: ظهري / بطني. مكافئ: خط الاستواء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، وتبين لنا كيفية صورة وتحليل العرش الجذعية من الخلايا العصبية النخاع ذبابة الفاكهة. ويصف الجزء الأول، ثنائي رأي التصوير، وdeconvolution والجمع بين اثنين من مداخن صورة إلى كومة صورة عالية الدقة. القسم الثاني، تتبع التغصنات والتسجيل، ويصف تتبع وتسجيل التشعبات من الخلايا العصبية النخاع لمجموعة عمود إشارة. القسم الثالث، تحليل شجيري، يصف استخدام البرامج النصية المخصصة لتحليل أنماط الجذعية. معا توفر هذه البروتوكولات سير العمل الكامل لاستخراج المعلومات عن أنماط شجيري فيما يتعلق طبقات والأعمدة وتحديد المتفرعة شجيري والترددات تنتهي.

طريقة التصوير المزدوج عرض المقدم هنا هو المفهوم مماثل لتقنيات التصوير متعددة بغية تنفيذها مع المجاهر الخفيفة ورقة، في اثنين أو أكثر من مداخن صورة جمعت ومعاد متعامد لتحقيق resolutio محوري عاليةن 17 و 18. ومع ذلك، فمن الصعب فنيا لتنفيذ متعامد على اثنين من ارتفاع NA (الفتحة العددية) العدسات الموضوعية التي مطلوبة من أجل التصوير التشعبات نحيلة. وبالتالي، يتطلب طريقة ثنائي رأي التصوير نفس العينة الدماغ في خطوتين متتاليتين وإعادة ويوجه-العينة بين التصوير. والأكثر احتمالا بسبب الفشل في تركيبة الصورة عن طريق حركة عينة أثناء التصوير أو عينة سحق خلال التلاعب. وعلاوة على ذلك، في حين أن تخفف من صورة عملية إعادة التركيب مشكلة تشويه محوري والنتائج في قرار شبه الخواص، صور معاد لا تزال تحت حد الحيود. لدينا ثنائي عرض طريقة التصوير يحتاج فقط المجهر متحد البؤر القياسية، والذي يتوفر على نطاق واسع. ومع ذلك، فائقة الدقة المجهر، مثل الإضاءة STED أو بنية، إن وجدت، سيكون بديل ممتاز لثنائي عرض طريقة التصوير الحاضرين هنا.

الالتغصنات تتبع وتسجيل مقطع المقدمة هنا يتتبع أشجار شجيري ويسجل أشجار شجيري لمجموعة عمود إشارة. في هذا البروتوكول، يتم استخدام Imaris برنامج تجاري للبحث عن المفقودين شبه الآلي التغصنات وتخصيص النقاط المرجعية. ويمكن تنفيذ مهام مماثلة خارج باستخدام عدد من البدائل المجانية، مثل NeuronJ 19 و 20 و Neurite النوعي الراسم 21. يستخدم بروتوكول لدينا تسجيل البرنامج المساعد مخصصة تنفيذها في MIPAV برنامج مفتوح المصدر لتسجيل آثار تغصناته لمجموعة عمود إشارة. على حد علمنا، هذا الأسلوب تسجيل هو الأسلوب الوحيد الذي يسجل آثار محوار إلى الأعمدة وطبقات. هذا الإجراء يستخدم ترتيب بانتظام محاور مبصرة كما المعالم للتسجيل. آثار الجذعية الناتجة عن طريقة تسجيل غير الخطية مثالية لاستخراج المعلومات عن أنماط الجذعية المتعلقة الأعمدة وطبقات. من جهة أخرىمن جهة، وطريقة تسجيل جامدة الجسم محاذاة المحاور الديكارتية للآثار شجيري إلى محاور أساسية من neuropil دون تغيير أطوال الجذعية أو غيرها من الخصائص الهندسية المحلية. لذلك، سجل للجسم جامد آثار الجذعية هي مناسبة لتحليل المورفومترية القياسية.

تحليل المورفومترية شجيري التقليدية، مثل L-قياس 22، يميز خصائص شجيري المحلية والعالمية دون الرجوع إلى الأنسجة المحيطة بها. لقد أظهرنا سابقا أن العديد من الخلايا العصبية النخاع تتقاسم خصائص هندسية شجيري وأن هذه المقاييس ليست كافية للتمييز بين أنواع الخلايا العصبية النخاع 12. بدلا من ذلك، ترتبط سمات شجيري نوع معين مباشرة مع الطبقات والأعمدة حيث توجد التشعبات. على وجه الخصوص، وأنواع مختلفة من الخلايا العصبية النخاع تتوقع التشعبات في اتجاهات مستو واضحة لإنهاء في طبقات النخاع محددة. هذه سمتان شجيري صeflect وظيفة الجذعية من الخلايا العصبية النخاع لتلقي afferents موجهة retinotopically نظمت في طبقات والأعمدة. لتسهيل استخراج هذه الخصائص، قمنا بتطوير الأدوات شجرة شجيري التي تحتوي على سلسلة من وظائف مخصصة لحساب خصائص الجذعية. في قسم تحليل شجيري، وتبين لنا كيف يمكن تطبيق هذه الوظائف إلى آثار شجيري مسجلة لحساب توزيع إنهاء طبقة محددة والاتجاهات مستو الإسقاط من التشعبات.

توفر الأدوات شجرة شجيري منصة لإضافة وظائف أخرى مخصصة لتحليل شجيري. في قسم تحليل شجيري، ونحن أيضا وصف عملية اشتقاق تقديرات لتنتهي شجيري واضح والترددات المتفرعة. على وجه الخصوص، هذه الوظائف حساب المتفرعة وإنهاء الترددات على أساس مقدر كابلان ماير اللامعلمية لاحتمال أن شريحة شجيري ستمتد إلى lengt معينح دون المتفرعة أو إنهاء 12، 23. من المهم أن نلاحظ أن تسجيل الجسم جامدة (ولكن ليس مسجل لاخطي) ينبغي أن تستخدم آثار الجذعية لهذا الحساب لأن عملية التسجيل غير الخطية يغير أطوال قطاع الجذعية. المتفرعة وإنهاء الترددات الجذعية هي مشتقة الأولى (المنحدر) من منحنيات كم ويمكن حسابها باستخدام طريقة تركيب وظيفة. وعلاوة على ذلك، وحساب دقيق لتشعب والترددات تنتهي غالبا ما يتطلب مجموعة من البيانات لا بأس به (> 10 الخلايا العصبية للخلايا العصبية تيم) لأن الخلايا العصبية واحدة لديها سوى عدد صغير نسبيا من قطاعات الجذعية. في الأمثلة المقدمة، TM2 وTm20 ديك المتفرعة مماثل والترددات تنتهي، ولكن المتفرعة تردد TM2 ليست متجانسة عبر طول المتفرعة، وهي سمة من سمات TM2 التشعبات 12.

في حين بروتوكولات لدينامصممة للعصبونات النخاع ذبابة الفاكهة، ويمكن تكييفها لتحليل الخلايا العصبية الأخرى التي التشعبات وضع في طبقات والأعمدة، مثل فصوص أخرى ذبابة الفاكهة البصرية وشبكية العين الفقارية والقشرة. ان مثل هذه التعديلات تتطلب بناء جديدة مجموعة عمود إشارة على أساس نظام الفائدة 12، فضلا عن تعديلات طفيفة من البرنامج المساعد MIPAV. نحن نقدم جميع برامجنا كما برمجيات المصدر المفتوح لتعزيز التعاون والمشاركة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، ومعهد يونيس كينيدي شرايفر القومي لصحة الطفل والتنمية البشرية (منحة HD008913 إلى جيم-HL)، ومركز لتكنولوجيا المعلومات (PGM، NP، ESM وMM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Huygens Professional Scientific Volume Imaging version 16.05 for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV version 7.3.0 for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila
RetinalRegistration.class		 freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard
ColumnRegistration.class		 freeware
Imaris Bitplane for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab Mathworks R2014b for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14 v1.14 for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox v1.0 For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name Company Catalog number Comments
Sample files
SWC file definition http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example  https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=
1471880596000&api=v2
Name Company Catalog number Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later 3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card Nvidia for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2 Nvidia http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2 http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name Company Catalog number Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody The Developmental Studies Hybridoma Bank 24B10
GFP Tag Antibody Thermofisher Scientific G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488 Thermofisher Scientific A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568 Thermofisher Scientific A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000
Mounting Clay  Fisher S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm Zeiss 474030-9000-000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaas, J. H. Topographic maps are fundamental to sensory processing. Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).
  2. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).
  3. Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. CSH Perspect Biol. 2 (3), a001743 (2010).
  4. Clandinin, T. R., Feldheim, D. A. Making a visual map: mechanisms and molecules. Curr Opin Neurobiol. 19 (2), 174-180 (2009).
  5. Luo, J., McQueen, P. G., Shi, B., Lee, C. H., Ting, C. Y. Wiring dendrites in layers and columns. J Neurogenet. 30 (2), 69-79 (2016).
  6. Meinertzhagen, I. A., Hanson, T. E. The development of the optic lobe. In The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 1363-1491 (1993).
  7. Takemura, S. Y., et al. A visual motion detection circuit suggested by Drosophila connectomics. Nature. 500 (7461), 175-181 (2013).
  8. Takemura, S. Y., et al. Synaptic circuits and their variations within different columns in the visual system of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), 13711-13716 (2015).
  9. Gao, S., et al. The neural substrate of spectral preference in Drosophila. Neuron. 60 (2), 328-342 (2008).
  10. Karuppudurai, T., et al. A hard-wired glutamatergic circuit pools and relays UV signals to mediate spectral preference in Drosophila. Neuron. 81 (3), 603-615 (2014).
  11. Strother, J. A., Nern, A., Reiser, M. B. Direct observation of ON and OFF pathways in the Drosophila visual system. Curr Biol. 24 (9), 976-983 (2014).
  12. Ting, C. Y., et al. Photoreceptor-derived activin promotes dendritic termination and restricts the receptive fields of first-order interneurons in Drosophila. Neuron. 81 (4), 830-846 (2014).
  13. Ting, C. Y., et al. Tiling of R7 axons in the Drosophila visual system is mediated both by transduction of an activin signal to the nucleus and by mutual repulsion. Neuron. 56 (5), 793-806 (2007).
  14. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
  15. Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: the input terminals to the medulla. J Comp Neurol. 509 (5), 493-513 (2008).
  16. Takemura, S. Y., et al. Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway. Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).
  17. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  18. Wu, Y., et al. Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy. Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).
  19. Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. Automated analysis of NeuronJ tracing data. Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).
  20. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  21. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  22. Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).
  23. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. JASA. 53, 457-481 (1958).

Tags

علم الأعصاب، العدد 121، التشعبات، morphometrics، والطبقات والأعمدة، شبكية العين، ثنائي رأي التصوير،
تحليل الجذعية الصرف في الأعمدة والطبقات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ting, C. Y., McQueen, P. G., Pandya, … More

Ting, C. Y., McQueen, P. G., Pandya, N., McCreedy, E. S., McAuliffe, M., Lee, C. H. Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers. J. Vis. Exp. (121), e55410, doi:10.3791/55410 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter