Summary
在这里，我们将展示如何分析列和层果蝇髓质神经元树突路由。该工作流包括一个双视图成像技术，以改善跟踪，登记树突乔木于基准列数组以及用于分析在三维空间中的树枝状结构的图像质量和计算工具。
Abstract
在中枢神经系统中，如苍蝇视叶和脊椎动物皮质许多地区，突触电路中的层和列组织发达的动物发展和信息处理中，以促进脑布线。突触后神经元精心树突在特定层的型特异性模式与适当的突触前末梢到突触。飞髓质神经毡是由10层到约750列;每一列是通过在38种髓质的神经元，配合部分7种类型的传入的在一个特定类型的方式终末其中树突支配。该报告详细介绍了程序，图像和分析延髓神经元树突。该工作流包括三个部分：（i）该双视图成像部分结合在正交取向成树突的高分辨率三维图像收集整理二共焦图像堆栈; （二）树突追踪和登记部分树突状痕迹在3D乔木和树突注册痕迹，参考列数组; （ⅲ）该树枝状分析部分分析的树突状图案相对于列和层，包括树突乔木层特定的终止和平面投影的方向，并导出树枝状分支和终止频率的估计。该协议利用建立在开源MIPAV（医学影像处理，分析和可视化）平台和自定义工具箱中的矩阵实验室语言自定义插件。总之，这些协议提供一个完整的工作流来分析层和列果蝇髓质神经元的树突的路由，以确定细胞类型，并确定在突变体的缺陷。
Introduction
在开发过程中，神经元在复杂的，但千篇一律的分支图案精致的树突形成与突触前伙伴突触。树突分枝模式相关与神经元的身份和功能。树突乔木的位置确定的，他们收到的突触前输入的类型，而树枝状分枝的复杂性和字段大小支配输入号码。因此，树突形态属性是突触连接和神经元计算的关键因素。在复杂的大脑，诸如苍蝇视叶和脊椎动物视网膜许多地区，突触电路中的列和层组织，以促进信息处理1,2。在这样的列和层的组织，一个独特的形态项目轴突突触前神经元在一个特定层（所谓的特定层的定位）终止，并形成一个有序的两维阵列（所谓的卡勒ð地形图），而突触后神经元延长特定层适当大小的树突接收到正确的类型和数量的突触前输入。而轴突靶向层和列已经得到很好的研究3，4，较少被知道关于树突如何路由到特定层和扩大适当大小感受域，以形成具有正确的突触前伙伴5突触连接。成像和量化树突靶向层和列的困难阻碍了柱状和夹层的大脑结构树突发育的研究。
果蝇神经髓质是研究在列和树突状层路由和电路组件的理想模型。苍蝇髓质神经纤维组织为10层的3D格与约750列。每列由一组传入，的p支配hotoreceptors R7 / R 8和薄层神经元L1 - L5，其终末形成层特定的方式6的地形图。约38种髓质的神经元存在于每髓质列和特定层和具有适当字段大小精细树突从这些传入7接收输入。在延髓的突触电路，在电子显微镜水平得到重建;因此，突触的伙伴关系已经非常成熟7,8。此外，用于标记各种类型髓质神经元的遗传工具可用9，10，11。通过检查三种transmedulla（Tm）为神经元（TM2，TM9和TM20），我们先前已经确定两种细胞类型特异性树突属性：（一）以旧换新神经元投射无论是在向前或向后方向树突（平面PROJ挠度方向），这取决于细胞类型和（ii）延髓神经元的树突终止于特定髓质层中的细胞类型特异性的方式（层特定的终端）12。平面投影方向和特定层的终止足以区分这三种类型的Tm的神经元，而扰乱的Tm反应层和列线索突变影响这些属性的不同的方面。
这里，我们提出用于检查果蝇髓质神经元的列和层（ 图1）的树枝状图案形成一个完整的工作流程。首先，我们展示了双景成像方法，它采用定制的软件合并两个共焦图像叠加产生高品质的图像各向同性。此方法只需要常规共焦显微镜，以产生高质量的图像，其允许树枝状分枝的可靠跟踪，而不诉诸超分辨率显微镜，这样的小号STED（受激发射损耗）或结构照明。第二，我们提出了跟踪树突乔木和用于登记所得突起痕迹到参考列阵列的方法。第三，我们显示了用于推导估计树枝状分支和终止频率提取的平面投影方向和树突的特定层的终端信息，以及作为计算方法。总之，这些方法允许在3D，基于树枝状形态的细胞类型的分类树枝状型态的表征，和潜在缺陷的突变体的鉴定。
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Protocol
注意：该协议包含三个部分：双视图成像（部分1 - 3），树突跟踪和登记（第4 - 6），和树突分析（第7 - 9）（ 图1）。在材料/设备的表中提供的代码和示例文件。
1.双图像采集
注意：此步骤是为了获得所关注的神经元的两个图像栈在两个正交（水平和额叶）取向。
- 制备该含有疏标记髓质神经元飞大脑（〜10个细胞/脑叶）用膜GFP标记（mCD8GFP），如前所述12。染色用兔抗GFP（为髓质神经元树突）和小鼠mAb24B10（对感光体的轴突），初级抗体和荧光二抗（Alexa的488抗兔和Alexa 568抗小鼠抗体）的脑，如前所述13。清除在1×PBS中的70％甘油的大脑。
- 到安装在水平方向脑（ 图2A，B）中 ，甘油清除飞脑转移到在滑动的中心的抗褪色封固剂20μL的下降。
- 在4个角盖玻片附上粘土小补丁，以防止盖玻片从安装过程中破碎的大脑样本。
注：粘土补丁提供缓冲，以防止盖玻片从破碎的样本。每个粘土贴片应在直径约为1毫米。 - 在解剖显微镜下，在腹侧上位置定位大脑，并放置盖玻片放在上面，以确保大脑。用脑的凸背表面作为地标来识别脑样品（ 图2A）的方向。
- 获得具有共焦显微镜的第一图像堆栈（水平视图）。使用高NA物镜（如63X 1.3 NA甘油或浸油OBJE莫如透镜）和2.5X数字变焦（像素尺寸是0.105微米每像素;平均数目为2）。获得超过180的光学部分（512×512象素），以覆盖0.2μm的步长髓质神经纤维。
- 重新安装脑如步骤1.3中所述 - 1.4，但对准大脑中的前上位置（前视图）。
- 获得相同的神经元的第二图像叠层（前视图），如在步骤1.5中描述。
注意：当有标记的视叶神经元大量发现相同的神经元可能是具有挑战性的。从两个方向标识相同的神经元，从两个视图低倍率图像堆栈可能需要（例如，使用0.7的变焦，和0.45微米的步长大小，以获得低分辨率图像栈）。如果超过512×512的影像越大，图像应该被裁剪为512×512像素的图像组合之前，像素大小应保持在0.105微米每像素成像时的大视场。信号丢失为深部组织的潜在问题。如果信号较弱，图像脑的腹侧一半。为了减少漂白扫描过程中，用尽可能低的激光功率成为可能。使用范围指示灯获取图像栈之前检查曝光过度。如果可能的话，使用配的GaAsP探测器共聚焦显微镜。 - 确定并相对于所述髓质神经毡（右/左[R / L]和背/腹[D / V]）记录所关注的神经元的位置。检查样品通过检查图像堆栈图像采集期间移动。
注：采样运动往往是由于安装不当造成的。如果发生样品的运动，所述图像堆栈不能用于登记和应该被丢弃。重新装入样品和来自同一神经元获得的图像栈。
2.图像反卷积
注：卷积步骤使用图像解卷积软件，以便恢复由模糊降解获得的图像和噪声。虽然此步骤是可选的，它显著提高了图像质量。它建议使用用于图像配准和结合反褶积图像堆栈中部分3。
- 开始在交互模式下的反褶积程序。负载通过选择菜单中的图像堆栈（LSM中或特定的微观格式）：在主窗口中的文件/打开（或Ctrl-O）。
- 单击以选中加载图像堆栈和选择菜单：OPS打开图像操作窗口。使用默认的经典最大似然估计（CMLE）算法。
- 在图像操作窗口中，单击“参数”选项卡。输入透镜浸入介质中的适当的参数，包埋剂，和数值孔径（ 例如，油，甘油等 ）（ 例如，浸油， 等 ）（NA;在这里，1.3被使用）。检查剩余参数，以确保它们正确地反映成像条件。点击“设置所有验证”选项卡鳍ALIZE参数设置。
- 在图像操作窗口中，单击“操作”选项卡。指定输出目标（ 例如，C）。在“每信道信号/噪音”（如 “12 12 12 12”是一个很好的起点，而默认设置为“20 20 20 20”）中输入相应的数字。使用默认设置为剩余的参数。
- 点击“运行命令”选项卡，开始去卷积的图像堆栈;这个过程可能需要长达几十分钟才能完成，具体在计算机上。
- 在主窗口中，单击并选择反褶积图像堆栈。选择菜单：另存为的反褶积图像保存在ICS图像文件格式（的.ics和.ids）。
注意：每个图像堆叠具有两个文件：ICS文件中包含的标题信息和IDS文件包含的原始图像信息。- 根据成像方向重命名图像堆栈文件（如姓名，水平视角图像S大头针H.ids和H.ics和正面视图图像堆栈F.ids和F.ics）。
3.双视角图像组合
注意：此步骤将两个图像叠加产生使用MIPAV软件的高分辨率3D图像。
- 生成图像组合矩阵。
- 启动MIPAV程序。通过选择菜单加载H和F图像的堆栈：从磁盘（或Ctrl-F）/H.ids和F.ids文件/打开图像（A）;窗口将显示两个图像。
- 通过单击图像选择轰图片，然后选择菜单：工具/转换工具/ RGB /灰色;该窗口将显示GrayG，GrayB和GrayR图像。
- 靠近GrayR和GrayB，只保留在窗口上GrayG。
- 通过单击图像选择F图片，然后选择菜单：工具/转换工具/ RGB /灰色。该窗口将显示GrayG1，GrayB1和GrayR1图像。
- 关闭GrayR1和GrayB1，只保留GrayG1在窗口上。在此步骤中，只的GrAYG和GrayG1是在窗口上。
- 选择GrayG（高亮显示），选择菜单：算法/报名/自动优化图像配准;在“自动优化图像配准3D”对话框会弹出。
- 在输入选项，从默认的“仿射-12”改变“自由度”到“具体的重新调整-9”。在“旋转，”键-105到105，在“旋转角度采样范围”（默认值：-30〜30度），10中的“粗角度增量”（默认为15度），和3“精角度增量“（默认值：6度）。
- 点击确定;第一矩阵“GrayG_To_GrayG1.mtx”将被生成并保存在图像文件夹中。关闭所有图像窗口并继续下一步;这一步将至少需要15分钟。
- 通过选择菜单加载H和F图像的堆栈：从磁盘（或Ctrl-F）/H.ids和F.ids，文件/打开图像（A），如步骤3.1.1。
- 通过单击图像选择轰图片，然后选择菜单：工具/转换工具/ RGB /灰色;在“RGB->灰色”对话框会弹出。点击确定;该窗口上会显示“HGray”的图像。保持HGray并关闭轰形象。
- 为F图像重复步骤3.1.9;在“FGray”图像将出现在窗口上。保持FGray并关闭F图像的;仅HGray和FGray将留在窗口上。
- 选择HGray图像（高亮显示），然后转到菜单：算法/转换工具/变换。 “转换/重定图像像素”对话框会弹出。点击“重新取样”选项卡并更改重采样为“HGray”到“FGray”的大小。接下来，通过选择点击“转换”选项卡，并加载“GrayG_To_GrayG1.mtx”，“从文件中读取矩阵”。点击确定;窗口将显示HGray_transform图像。关闭HGray图像所以只有HGray_transform和FGray留在窗口上。
- 选择“HGray_transform＆＃34;图像（高亮显示），并进入菜单：算法/报名/自动优化图像配准。在“自动优化图像配准3D”对话框会弹出。在“旋转，”键-5中的“旋转角度采样范围”5（默认值：-30〜30度），3中的“粗角度增量”（默认为15度），以及1中的“精角度增量“（默认值：6度）。点击OK。
注：仿射矩阵（HGray_transform_To_FGray.mtx）会生成并保存在图像文件夹和“HGray_Transform_register”的图像将在窗口上显示。这一步将至少需要40分钟。 - 关闭“HGray_transform”的形象;只有“HGray_Transform_register”和“FGray”应留在窗口上。
- 选择“HGray_Transform_register”图像（高亮显示），然后转到菜单：算法/注册/ B样条曲线自动配准的2D / 3D。在“B样条自动Registrati在-3D亮度“对话框会弹出，选择”在成本函数最小二乘“（默认为相关比）。
- 点击“执行两次通过注册”。中通1节，键2到“梯度下降最小化步长（样本单位）”（默认为1），并输入10为“最大迭代次数”（默认为10）。中通2部分，重点在进入1“梯度下降最小化步长（样本单位）”（默认为0.5），并键入2成“最大迭代次数”（默认为10）。
注：NLT矩阵，“HGray_transform_register.nlt”将被保存在图像文件夹和“HGray_transform_register_registered”的形象将在窗口中显示。这个步骤将至少需要5分钟。
- 点击“执行两次通过注册”。中通1节，键2到“梯度下降最小化步长（样本单位）”（默认为1），并输入10为“最大迭代次数”（默认为10）。中通2部分，重点在进入1“梯度下降最小化步长（样本单位）”（默认为0.5），并键入2成“最大迭代次数”（默认为10）。
- 在窗口关闭所有图像。
- 产生用于图像组合的基准图像。
注意：此步骤是为了GENER吃了组合的注册水平图像。- 加载H和F图像的堆栈选择菜单：从磁盘（或Ctrl-F）/H.ids和F.ids文件/打开图像（A）;两个图像将出现在窗口上。
- 选择轰图像（高亮显示），然后转到菜单：算法/转换工具/变换; “转换/重定图像像素”对话框会弹出。点击“重新取样”选项卡，并从大小“H”到“F”的改变重采样接下来，通过选择点击“转换”选项卡，并加载“GrayG_To_GrayG1.mtx”，“从文件中读取矩阵”。点击确定;该H_transform图像会出现在窗口上。关闭轰图像，但保持H_transform和F在窗口中。
- 选择“H_transform”图像（高亮显示），然后转到菜单：算法/转换工具/变换; “转换/重定图像像素”对话框会弹出。点击“重新取样”选项卡，并从大小“H_transform”到“F＆＃改变重采样34;接下来，通过选择点击“转换”选项卡，并加载“HGray_transform_To_FGray.mtx”，“从文件中读取矩阵”。点击确定;在“H_transform_transform”的形象将出现在窗口上。关闭H_transform形象;在这一点上，仅H_transform_transform和F将被留在窗口上。
- 选择“H_transform_transform”图像（高亮显示），然后转到菜单：算法/转换工具/变换非线性;在“非线性B样条转型”对话框会弹出。接下来，负荷“HGray_transform_register.nlt”，然后点击确定;在“H_transform_transform_registered”的形象将出现在窗口上。图像另存为ICS文件。在窗口关闭所有图像。
- 结合图像堆栈
注意：此步骤是在正交方向（水平和额叶）获取的两个图像堆栈组合成一个高分辨率栈。- 进入菜单：插件/通用/果蝇视网膜注册istrationl;在“果蝇视网膜登记V2.9”对话框会弹出。从步骤3.2.4在图像H-注册转型1 - 格林在图像f“F.ics”，“GrayG_To_GrayG1.mtx”从步骤3.1.7上传图像H“，H_transform_transform_registered”“H.ics”（可选），“HGray_transform_To_FGray.mtx”在转换步骤3.1.12转型2仿射和“HGray_transform_register.nlt”步骤3.1.14 3非线性（可选）。
- 选择的sqrt（强度，高x强度-F），并在“重缩放H键F.”不重新调整保留其余参数的默认选项。点击确定;这一步将需要大约3分钟。
注：在处理之后，将产生3套图片数量：combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids（最终重组图像），greenChannelsImage-Gxreg-GY-Gcomp.IDS（为H，F绿色通道，并最终重新组合图像），和redChannelsImage- RXREG-RY-Rcomp.ids（红色通道FOR H，F和最后的重组图像）;所有输出文件将被调整为512×512×512。
- 选择的sqrt（强度，高x强度-F），并在“重缩放H键F.”不重新调整保留其余参数的默认选项。点击确定;这一步将需要大约3分钟。
- 打开“combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids”图像可视化软件下。保存在IMS格式的图像堆栈和重命名文件;此重组的图像文件将被用于神经突的跟踪和注册。
- 进入菜单：插件/通用/果蝇视网膜注册istrationl;在“果蝇视网膜登记V2.9”对话框会弹出。从步骤3.2.4在图像H-注册转型1 - 格林在图像f“F.ics”，“GrayG_To_GrayG1.mtx”从步骤3.1.7上传图像H“，H_transform_transform_registered”“H.ics”（可选），“HGray_transform_To_FGray.mtx”在转换步骤3.1.12转型2仿射和“HGray_transform_register.nlt”步骤3.1.14 3非线性（可选）。
4.轴突跟踪和参考点分配
注：此步骤是使用图像可视化软件来跟踪突起（4.1）和指定的参考点报名（4.2）。
- 跟踪突起
- 启动图像可视化软件。打开重组图像文件。进入菜单：编辑/显示显示调整和关闭感光通道（红色）。
- 在“超越”模式下的可视化图像。打开“立体”，并使用了“四缓冲区”模式，以可视化的三维图像如果计算机是EQuipped具有立体画系统。
- 进入菜单：超越/花丝增加新的细丝。点击“跳过自动创建，手动编辑”选项卡。
- 点击“绘图”选项卡，选择“AutoDepth”。
- 选择“设置”，勾选“线”，并输入一个合适的像素数为更好的可视化（4像素线在本协议中使用）。勾选“显示树突”，“起点”和“分支点”。将“渲染质量”为100％。
- 选择“绘图”选项卡，并开始跟踪突起。先从轴突，然后移动到树突（ 图2D）。轴突和transmedulla神经元树突很容易区分。
注：A TM神经细胞从细胞体延伸，其轴突和项目一路较高的视觉处理中心，小叶。系统会自动确定第一长丝作为一个轴突和剩余的短长丝树突。保持在灯丝（轴突）开始的起点追踪期间和确保跟踪突起相连。检查分支点和开始点。如果树突未连接，新的开始点将在非连接的灯丝来限定。 - 追查后，返回到“设置”，取消选中“起点”和“分支点”，并转到菜单：超越/导出选定的对象../。保存长丝作为一个发明家文件（* .IV）。
- 分配基准点
- 选择“显示画面调整”，把两个成像通道。在这个例子中，信道1是感光体染色和通道2是TM20神经元（GFP）。
- 进入菜单：超越/测量。选择“编辑”选项卡，并选中“特定声道：”（选择感光通道[红色]）。
- 分配的参考点为顶层。进入菜单：/超越/测量浦二NTS以创建新的测量点。标记M1层作为顶层的开始。点的顺序如下：赤道，前-赤道，前壁，前腹，腹侧，后腹，后侧，后部赤道和中心（ 图3F）;定义中心感光体作为具有最树枝状突起相关联的一个。
- 分配R8和R7层按步骤4.2.3（ 图3G）。三个独立的测量点应在步骤4.2.3和4.2.4进行创建。
- 导出点的坐标为每个层。点击“统计信息”选项卡，选择“详细”，“特定值”和“位置;”并单击“导出统计上的标签显示为文件”。另存为“逗号分隔值”（* .CSV）。
- （从步骤4.2.3 - 4.2.4）打开三个CSV文件，并复制和粘贴27基准点的坐标合并成一个新的csv文件（THË依次为上，R8和R7）。请参阅材料/设备表 ，并按照示例文件的格式。
5.刚体和TPS非线性注册
注意：此步骤是注册轴突迹线（在四格式）参考列阵列和使用MIPAV程序生成的注册SWC文件。此部分需要以下文件：从3.3步重组图像堆栈（.ids），步骤4.2参考点文件（.csv）和神经纤维跟踪文件从步骤4.1（.IV）。
- 进入菜单：插件/通用/ DrosophilaStandardColumnRegistration。在“DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1”窗口会弹出。
- 加载图像文件（.ids），参考点档（.csv），与灯丝文件（.IV）。
- 选择每层9分。
- 选择成像神经元（LV / RD或RV / LD）的位置。
- 选择“刚性Registrati并TPS“和”刚性登记“分别为非线性刚体登记。
- 选中“创建SWC文件”生成以下输出文件：在SWC格式的注册轴突跟踪文件（参见定义特定的材料/设备），注册IV文件（.IV），配合标准化突起（.TXT）的，变换后的坐标（.txt）的，合并的图像（.ids）。
- 更改SWC文件的名称。适用的位置的缩写来的文件名（步骤1.7）的端部。例如，使用“Tm20_3_RV.swc”为TM20神经元＃3位于右髓质腹侧一半。
6.标准化为右腹配置
注：此步骤是使用自定义脚本转换的突起痕迹（以SWC格式）标准RV（右腹）配置“RV_standardization.m”。在这里，剧本写于矩阵实验室语言。该输入SWC文件的名称应该采用以下格式：“NeuronName _ _ 数名为.swc 配置 ”（ 例如，Tm20_3_LV.swc）。
- 打开“RV_standardization.m”脚本。
- 编辑“用户输入”部分中的以下参数：
- 键入神经元的名称，而不在编号（ 例如，TM2，TM20， 等等 ）“neuron_names”。
注：“file_end_in”默认为“_ *深港西部通道，”这看起来的文件包含名称（“*”是匹配任意数目的字符一个通配符）“_ *深港西部通道。” “swc_file_end_out”的默认值是“_f.swc”，这将“_f”添加到标准化后的文件名的末尾。 - 指定的SWC文件中的“directory_in”的目录。指定目录，标准化的文件将在“directory_swcout”走。
- 键入神经元的名称，而不在编号（ 例如，TM2，TM20， 等等 ）“neuron_names”。
- 运行脚本。
- Øptional：使用Vaa3D 14以可视化的SWC文件和验证的转换。
7.计算树突分枝和终止频率
注：此步骤使用刚体注册SWC文件来计算，一个树突段将达到给定的长度而不终止的概率的Kaplan-Meier估计。该脚本使用两个Dendritic_Tree_Toolbox功能：extractDendriticSegmentLengthDistribution和estimateDendriticSegmentLengthProbability。
- 打开“Branch_term_P.m”脚本。
- 编辑“用户输入”部分中的以下参数：
- 指定“pathToSWCFiles”的路径刚体注册SWC文件（ 例如，/ Rigid_Registered_swc /）。指定将持有的图形输出路径“pathToOutput”。指定的神经元或神经类型“neuron_names”的名称（ 例如，TM2，Tm为20， 等等 ）。
- 运行该脚本;输出是树突分枝和终止的Kaplan-Meier估计曲线。
注：可选的：应用函数拟合方法来提取的Kaplan-Meier估计器的局部概率树枝状段将跳转或终止。
8.情节树突状乔木层特定终端的分布
注意：此步骤图表树突终端在不同髓质层中的分布的柱状图。这可以应用到一个神经元，一组神经元，或神经元的组。该脚本使用从Dendritic_Tree_Toolbox的extractDistributionAlongAxis功能。
- 打开“Layer_term.m”脚本。
- 编辑“用户输入”部分中的以下参数：
- 指定包含在“pathToSWCFiles”非线性注册SWC文件的目录（例如 / Non_linear_Registered_swc /）。指定图形输出目录“pathToOutput”。在“neuron_names”（ 例如，TM2，TM20， 等等 ）指定的神经元或神经类型的名称。
- 运行教程脚本。输出是终端节点的特定髓质层的比例的柱状图。
9.情节树突的平面投影方向
注：此步骤树突绘制的平面投影方向为极坐标图。该脚本使用从Dendritic_Tree_Toolbox的extractAngularDistribution功能。
- 打开脚本“Planar_proj.m”。
- 编辑“用户输入”部分中的下列参数。
- 指定包含非线性的“pathToSWCFiles”（ 例如，/ Non_linear_Registered_swc /）注册SWC文件的目录。指定在图形输出目录“pathToOutput”。指定的名称神经元或神经类型“neuron_names”（ 例如，TM2，TM20， 等等 ）。
- 运行该脚本;输出为平面投影方向的极坐标图。
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Representative Results
利用这里提出的双视图成像过程，含有疏标记TM20神经元蝇脑在两个正交的方向被成像。成像之前，将脑与用于可视化膜 - 拴系的GFP和感光体轴突适当初级和次级抗体染色。用于成像，大脑首次安装在水平方向（ 图2A，B）。一个GFP标记TM20神经和周围感光体轴突使用共聚焦显微镜（ 图3A）成像。大脑，然后重新对准（ 图2A，B）和在正面方向（ 图3B）相同的TM20神经元被重新成像。在成像过程中，TM20神经元的位置被确定为在合适的髓质神经毡（RV配置）的腹侧一半。这两个图像堆栈用图像去卷积软件和REC反褶积使用MIPAV（ 图3C），以产生重组图像堆栈（ 图3C'）ombined。相比于任一输入堆栈（ 图3A'，B'）的所述重组的图像堆栈表明轴向畸变的显著减少。
使用图像可视化软件，轴突和神经元的TM20树突被追踪（ 图3D），并保存为一个发明家（四）文件。对周围的神经元TM20轴突感光器27的参考点被分配（ 图3E - H）和保存为一个逗号分隔值（CSV）文件。跟踪的树突文件和参考点文件随后被应用到自定义插件在MIPAV以生成SWC文件格式刚体登记和未登记的线性枝蔓痕迹。注册的树突状痕迹被转换为使用“RV_standardization.m”剧本的标准配置RV。 ŧ他注册并使用Vaa3D验证登记和标准化进程（ 图3I）标准化树突跟踪文件进行可视化。
对于树突状分析，注册树突状痕迹为收集15 TM20神经元和15元Tm2的。使用刚体注册树突痕迹使用“Branch_term_P.m”脚本，支化和终止这些神经元的概率进行分析（ 图4A，B）。的Kaplan-Meier曲线表明，这两种神经元类型具有类似的支化和终止频率。然而，Tm2的具有更长的段的下部终止频率（> 4微米; 图4A）12。用于分析使用层和列相关联的树突性能，使用由非线性注册方法中注册的树突状痕迹。使用自定义“Layer_term_P.m”的剧本，分布为Tm2的和TM20神经元特定层的树突终止第计算（ 图4C，D）。 Tm2的和TM20树突层特定终端的不同分布是在不同的层其特定突触的合作伙伴是一致的：Tm2的树突分别接收来自L2和L4终末投入在M2和M5，而TM20树突接收来自R8和L3输入在M3层8，15，16。使用“Planar_proj.m”脚本，Tm2的和TM20树突的平面投影方向进行了分析，并发现是从彼此不同：Tm2的树突项目后方而TM20树突项目前方12（ 图4E中的F）。
图1的工作流程。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.样品制备双视角成像和果蝇延髓列数组的对称性。 （A，B）：试样安装了双画面成像。 （A）的视图显示仿佛在寻找通过盖玻片大脑。 （B）逻辑示意图样品安装。成像视野TAL栈，免疫染色脑安装首先在腹上位置。获取第一堆叠后，脑重新定位在成像额叶堆的前上位置。答：前;病人：后路; D：背;五：腹; R：右; L：离开了。 （C - E）延髓神经纤维的对称性和组织，在前腰位置查看。 （C）的光感受器轴突，由24B10抗体（红色）标记的，被用来可视化髓质神经纤维的组织。该图像被显示为如果从外部进入脑寻找。蚂蚁：前;波什：后;多尔：背; VEN：腹; EQ：赤道。 （D）在延髓神经纤维的四个象限A（C）的高倍率视图在R7层水平。中央R7终端由黄色圆点标记。前部和赤道R7S分别标记有绿色和青色的点，。 （ 五 ）髓质共同的示意图lumnar组织。需要注意的是左，右髓质髓互为镜像，并且每个神经纤维的背侧和腹侧半部也镜像图像，通过赤道分离。红色圆点表示赤道R7S，这是第一个参考点。数字（1 - 9）和箭头指示的参考点分配顺序。比例尺：15微米℃; 5微米D. 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.图像重组和参考点分配。 （A - C）的水平（A）获得单一神经元TM20和额叶（B）方向的共聚焦图像。图像显示为最大强度的预测。感光器轴突和一个TM20ñeuron标以分别Mb24B10抗体（红色）和膜 - 拴系的GFP（绿色），。 （C）重组（A，红色）和（B，青色）的图像。为清楚起见，仅感光体被示出。 （A' - C'）双成像提高轴向分辨率。该重组图像（A'）具有比横向视图（A更好的解决'）和正面视图（B'）的图像。较低的面板：在上面板的盒装地区的高倍率的看法。 （D）的跟踪单个TM20神经元的轴突（白色）。起点被表示为青色点。 （E）在包围TM20神经元9感光体的轴突27的参考点（白点）被用作标。参考点是三层：顶部，R8和R7。 （F）参考点分配在每一层。参考点分配如下FOL降脂顺序：赤道（EQ），前-赤道（AE），前（A），前腹（AV），腹面（V），后腹（PV），后（P），后-赤道（PE）和中央（C）的。 （G）用于注册的髓质柱阵列的示意图。一个神经元的TM20显示（绿色）。髓质层（M1-6）是所示。 （H）层和参考点分配为一列的一个例子。三层被用来定义每个列：顶部，R8和R7（M5 / 6层的交界处）。 （i）注册并使用Vaa3D标准化突起痕迹显现。比例尺：5微米的一种交流; 5微米的A'A'为-C'; 5微米，D，E，F和G 请点击此处查看该图的放大版本。
410fig4.jpg“/>
图4.从树突状分析结果的例子。 （A，B）树突分枝（A）和终止（B）中的Kaplan-Meier估计值（Y轴）对数刻度绘制相对于段长度（X轴）。实线和虚线表示平均值±SDS。 TM2（红色）和TM20（黑色）共享相似的分支和终止频率段小于4微米。 （C，D）的直方图表示终端树突节点在每个髓质（M）的层的平均比例。终端节点的在一个给定的髓质层的比例首先计算对于给定类型的每个神经元，然后平均该类型的所有神经元上。竖条显示比例的标准偏差。请注意，对于Tm2的神经元（C）中 ，终端树突节点的分布集中在髓质层2，在层5一较小的峰，而Tm为20元（D）所示，分布的M2和M3的层为中心。 （E，F）树突的平面投影方向的极坐标图。角槽（20°）内投影终端节点的比例是首先计算对于给定类型的每个神经元，然后平均该类型的所有神经元。红色和蓝色曲线显示平均值比例±标准偏差。曲线上的角是角箱的中点。黑色圆圈表示由黑色数字对他们的边指示的比例值。需要注意的是，平均来说，这两个类神经元在几乎相反的方向上定向。答：前;病人：后路; D / V：背/腹; EQ：赤道。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这里，我们将展示如何图像和分析果蝇神经髓质树突乔木。第一部分，双视图成像，描述了去卷积和两个图像栈的组合成一个高分辨率的图像栈。第二部分，枝晶追踪和登记，介绍髓质神经元的参考列数组的树突的追查和登记。第三部分，树突状分析，介绍了使用自定义脚本来分析树突状图案。总之这些协议提供了一个完整的工作流中提取树突状模式的信息相对于图层和列，并确定树突分枝和终止频率。
这里提出的双视图成像方法在概念上类似于与光片显微镜实现多视点的成像技术，其中两个或更多个图像栈收集正交被重新组合，实现了高的轴向resolutioñ17，18。然而，它在技术上是挑战性的正交实现所需要的成像细长树突两个高NA（数值孔径）物镜。因此，该双视图方法需要在两个连续的步骤成象的脑样品和重新定向成像之间的样本。在图像组合的失败很可能是由样本移动操作过程中成像或样品压扁过程中造成的。此外，虽然在图像重组过程减轻轴向失真问题和在近各向同性分辨率的结果，该重组的图像仍在一个衍射极限。我们的双视图成像方法只需要标准共焦显微镜，这是广泛使用的。然而，超分辨率显微镜，如受激发射损耗或结构照明，如果有的话，将是双视图成像在座方法的理想替代品。
该这里提出树突追踪和登记部分追溯树突树和树突注册树木参考列阵列。在这个协议中，该商业程序了Imaris用于半自动树突跟踪和分配的参考点。类似的任务可以使用多个免费软件替代品，如NeuronJ 19,20和神经突示踪21的来进行。我们的注册协议使用的开源程序MIPAV枝晶的痕迹注册到基准列数组实现了自定义插件。据我们所知，这种注册方法是注册突起痕迹，列和层的唯一方法。此过程使用规则排列的光感受器轴突作为标志登记。通过非线性登记方法生成的树突状痕迹是理想的提取关于与列和层的树突模式的信息。在另一另一方面，刚体准方法对齐树突痕迹的神经纤维的基本轴的笛卡尔轴而不改变枝晶的长度或其他地方的几何性质。因此，在刚体注册树突痕迹是适合标准形态学分析。
传统的树突状形态测定分析，如L-度量22，表征局部和全局的树突状属性，而无需引用周围的组织。之前我们已经表明，许多神经元髓质树突共享几何性质，此类指标不足以区分延髓神经类型12。相反，特定类型的树突属性直接与在树突驻留在层和列相关联。特别是，不同类型的神经元髓质的项目在不同的平面方向树突具体髓质层终止。这两个树突属性R影响及其髓质神经元的树突功能，接收层和列组织指挥retinotopically传入。为了方便这些属性的提取，我们开发了树突树工具箱包含计算树突性质一系列自定义功能。在树枝状分析部分，我们表明这些功能如何可以应用到注册树突迹线来计算特定层的终止和树突的平面投影方向的分布。
树突状树工具箱提供用于添加其他自定义函数树突分析的平台。在树突分析部分，我们还描述的过程中推导出明显的树突终端和分支的频率估计。特别是，这些功能计算基于所述概率的Kaplan-Meier非参数估计的支化和终止频率，一个树枝状段将延伸到一定lengt1h而不需分支或终止12，23。值得注意的是，刚体注册（但不是非线性注册）的树突状痕迹应该用于该计算，因为非线性注册过程改变树突段长度是很重要的。树枝状分支和终止频率对KM曲线的第一导数（斜率），并且可以使用该函数拟合的方法来计算。此外，支化和终止频率的精确计算往往需要一个相当大的数据集（> 10神经元的Tm神经元），因为单个神经元仅具有数量相对较少的树突状段。在所提供的实施例中，时间戳Tm2和TM20具有相似的支化和终止频率，但Tm2的支化频率不跨越分枝长度均匀，Tm2的的特征树突12。
虽然我们的协议被设计用于果蝇髓质神经元，它们可以适合于分析其他神经元精心树突层和列，如其他果蝇视叶和脊椎动物视网膜和皮质。这种调整需要构建基于感兴趣12的系统，以及MIPAV插件稍作修改上一个新的参考列阵列。我们提供我们作为开源软件，以促进合作和共享的所有程序。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院院内研究计划的支持，儿童健康和人类发展（授予HD008913到C-HL）的尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国立研究所和信息技术中心（PGM，NP，ESM ，和MM）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | version 16.05 | for image deconvolution (https://svi.nl). commercial software |
| MIPAV | version 7.3.0 | for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware | |
| MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class |
freeware | ||
| MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class |
freeware | ||
| Imaris | Bitplane | for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software | |
| Vaa3D | for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware | ||
| Matlab | Mathworks | R2014b | for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software |
| Matlab toolbox: TREES1.14 | v1.14 | for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware | |
| Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox | v1.0 | For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Sample files | |||
| SWC file definition | http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html | ||
| The codes and sample files for image combination and registration | https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration | ||
| Reference point example | https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2 |
||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Computer system | |||
| MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later | 3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal) | ||
| Optional: Quadro4000 (or above) graphic card | Nvidia | for stereographic visualization of dendrites. | |
| Optional: NVIDIA 3D vision2 | Nvidia | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html | |
| Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2 | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html | ||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Reagents for imaging | |||
| 24B10 antibody | The Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
| GFP Tag Antibody | Thermofisher Scientific | G10362 | |
| Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermofisher Scientific | A11034 | |
| Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568 | Thermofisher Scientific | A21124 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mounting Clay | Fisher | S04179 | |
| 70% glycerol in 1x PBS | |||
| Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9000-000 |
References
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