Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Analyse Dendritiske Morfologi i Kolonner og Lag

Published: March 23, 2017 doi: 10.3791/55410
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 1
1Section on Neuronal Connectivity, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (NIH), 2Mathematical and Statistical Computing Laboratory, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH), 3Biomedical Imaging Research Services Section, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH)

Summary

Her viser vi, hvordan man analysere dendritiske routing af Drosophila medulla neuroner i kolonner og lag. Arbejdsprocessen omfatter en dual-view imaging teknik til at forbedre billedkvaliteten og beregningsmæssige værktøjer til opsporing, registrering dendritiske dorne til henvisningen kolonnen array og til at analysere de dendritiske strukturer i 3D-rum.

Abstract

I mange områder af det centrale nervesystem, såsom flyve optiske lapper og hvirveldyr cortex, er synaptiske kredsløb organiseret i lag og kolonner for at lette hjernens ledninger under udvikling og informationsbehandling i udviklede dyr. Postsynaptiske neuroner kunstfærdige dendritter i typespecifikke mønstre i bestemte lag til synapse med passende præsynaptiske terminaler. Den flue medulla neuropil består af 10 lag og omkring 750 søjler; hver kolonne innerveres af dendritter på over 38 typer af medulla neuroner, der matcher med de axonale terminaler nogle 7 typer afferenter i en type-specifik måde. Denne rapport beskriver de procedurer, image og analysere dendritter af medulla neuroner. Arbejdsgangen indeholder tre afsnit: (i) dual-view imaging sektion kombinerer to konfokale billedstakke indsamlet på ortogonale orienteringer i en høj opløsning 3D billede af dendritter; (Ii) dendritceller sporing og sektion registrering spor dendritiskedorne i 3D og registrerer dendritiske spor til henvisningen kolonne matrix; (Iii) den dendritiske analyse afsnit analyseres dendritiske mønstre med hensyn til kolonner og lag, herunder lag-specifikke terminering og plane projektion retning af dendritiske dorne, og udleder estimater af dendritiske forgrening og terminering frekvenser. Protokollerne udnytte brugerdefinerede plugins bygget på open source MIPAV (Medical Imaging behandling, analyse og visualisering) platform og brugerdefinerede værktøjskasser i matricen laboratorium sprog. Tilsammen udgør disse protokoller giver et komplet workflow til at analysere den dendritiske routing af Drosophila medulla neuroner i lag og kolonner, for at identificere celletyper, og til at bestemme defekter i mutanter.

Introduction

Under udvikling, at neuroner kunstfærdige dendritter i komplekse men stereotype forgrenede mønstre danner synapser med deres præsynaptiske partnere. Dendritiske forgrenede mønstre korrelerer med neuronal identitet og funktioner. Placeringen af ​​dendritiske dorne afgøre, hvilken type præsynaptiske indgange, de modtager, mens dendritiske forgrening kompleksitet og markstørrelser regulerer det indtastede tal. Således dendritiske morfologiske egenskaber er kritiske determinanter for synaptisk forbindelse og neuronal beregning. I mange områder af komplekse hjerner, såsom flyve optiske lapper og hvirveldyr nethinden, er synaptiske kredsløb organiseret i kolonner og lag for at lette informationsbehandling 1, 2. I en sådan søjle, og lag organisation, til præsynaptiske neuroner af en bestemt modalitet projekt axoner ender ved et bestemt lag (såkaldte lag målretning) og til at danne en ordnet todimensionalt array (so-called topografisk kort), mens postsynaptiske neuroner udvide dendritter af passende størrelser i bestemte lag for at modtage præsynaptiske indgange de korrekte typer og antal. Mens axonal målretning til lag og kolonner er blevet godt undersøgt 3, 4, er meget mindre kendt om, hvordan dendritter dirigeres til specifikke lag og udvide passende størrelse receptive felter til dannelse synaptiske forbindelser med de korrekte præsynaptiske partnere 5. Vanskeligheden ved billedbehandling og kvantificere dendritiske målretning til lag og kolonner har hindret studiet af dendritiske udvikling i søjleformede og laminerede hjernens strukturer.

Drosophila medulla neuroner er en ideel model til at studere dendritiske routing og kredsløb forsamling i kolonner og lag. Fluen medulla neuropil er organiseret som et 3D gitter af 10 lag og cirka 750 kolonner. Hver kolonne innerveres af et sæt afferente, herunder photoreceptors R7 / R8 og lamina neuroner L1 - L5, hvis axonal terminaler topografiske kort i et lag-specifik mode 6. Omkring 38 typer af medulla neuroner er til stede i hver medulla kolonne og udarbejde dendritter i specifikke lag og med passende markstørrelser at modtage input fra disse afferenter 7. De synaptiske kredsløb i medulla er rekonstrueret på elektronmikroskopisk niveau; Således er de synaptiske samarbejder veletableret 7, 8. Endvidere genetiske værktøjer til mærkning forskellige typer af medulla neuroner findes 9, 10, 11. Ved at undersøge tre typer transmedulla (TM) neuroner (TM2, TM9 og Tm20), har vi tidligere identificeret to celle-typespecifikke dendritiske egenskaber: (i) Tm neuroner projicerer dendritter i enten den forreste eller bageste retning (plane projfdeling retning), afhængigt af celletyper og (ii) dendritter af medulla neuroner ender i specifikke medulla lag i en celle-typespecifik måde (lag-specifik terminering) 12. Planar projektion retning og lag-specifikke opsigelse er tilstrækkelige til at skelne mellem disse tre typer af Tm neuroner, mens mutationer, der forstyrrer Tm reaktioner på lag og kolonne stikord påvirker distinkte aspekter af disse attributter.

Her præsenterer vi et komplet workflow for behandlingen af dendritiske mønster af Drosophila medulla neuroner i kolonner og lag (Figur 1). Først viser vi en dual-view billeddannelse metode, som bruger tilpasset software til at kombinere to konfokal billede stakke at generere høj kvalitet isotrope billeder. Denne metode kræver kun konventionel konfokal mikroskopi til at generere billeder af høj kvalitet, som giver mulighed for pålidelig sporing af dendritiske grene, uden at ty til super-opløsning mikroskopi, sådans STED (stimuleret emission Nedbrydning) eller strukturel belysning. For det andet præsenteres en fremgangsmåde til sporing dendritiske dorne og til registrering de resulterende neurit spor til en reference kolonne array. Tredje, viser vi de beregningsmæssige metoder til ekstraktion oplysninger om den plane projektion retning og lag-specifikke ophør af dendritter, samt til at udlede estimater for dendritiske forgrening og terminering frekvenser. Tilsammen udgør disse metoder tillader karakterisering af dendritiske mønstre i 3D, klassificering af celletyper baseret på dendritiske morfologier, og identifikation af potentielle fejl i mutanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Protokollen indeholder tre afsnit: dual-view imaging (afsnit 1 - 3), dendritiske opsporing og registrering (§§ 4 - 6), og dendritiske analyse (§§ 7 - 9) (Figur 1). De koder og eksempel filer er angivet i tabel Materialer / udstyr.

1. Dual-image Acquisition

BEMÆRK: Dette trin er designet til at erhverve to billedfiler stakke af neuronet af interesse i to ortogonale (vandrette og frontale) orienteringer.

  1. Forbered flyve hjerner, der indeholder tyndt mærkede medulla neuroner (~ 10 celler / hjerne lobe) med en membran GFP markør (mCD8GFP), som tidligere beskrevet 12. Farv hjernen med kanin-anti-GFP (for medulla neuron dendritter) og muse mAb24B10 (for fotoreceptor axoner), primære antistoffer, og fluorescerende sekundære antistoffer (Alexa 488 anti-kanin og Alexa 568 anti-muse-antistoffer), som tidligere beskrevet13. Ryd hjernen i 70% glycerol i 1x PBS.
  2. At montere hjernen i den vandrette retning (figur 2A, B), overføre glycerol-blokerede flue hjernen til en 20 pi dråbe af antifade Mounting Medium i centrum af et objektglas.
  3. Vedhæft små pletter af ler på de 4 hjørner af dækglasset for at forhindre dækglasset knust hjernen prøven under montering.
    BEMÆRK: ler patches giver polstring for at forhindre dækglasset knust prøven. Hver ler plaster bør være omkring 1 mm i diameter.
  4. Under et dissektionsmikroskop, placere hjernerne i den ventrale-up position og placere dækglasset på toppen for at sikre hjernen. Brug konvekse dorsale overflade af hjernen som en milepæl for at identificere orienteringen af hjernen prøve (figur 2A).
  5. Få det første billede stack (vandret visning) med en konfokal mikroskop. Brug en høj NA objektivlinse (såsom en 63X 1.3 NA glycerol eller opblanding olie objective objektiv) og 2,5X digital zoom (pixelstørrelse er 0,105 um per pixel, gennemsnitsberegning nummer er 2). Erhverve mere end 180 optiske sektioner (512 x 512 pixels) til dækning medulla neuropil med en trinstørrelse på 0,2 um.
  6. Monter hjernen som beskrevet i trin 1.3 - 1.4, men justere hjernen i anterior-up position (set forfra).
  7. Erhverve det andet billede stabel (forfra) af det samme neuron, som beskrevet i trin 1.5.
    BEMÆRK: At finde den samme neuron kan være udfordrende, når der er mange neuroner mærket i den optiske lap. For at identificere de samme neuroner fra begge retninger, måske lavere forstørrelse billedstakke fra begge synspunkter kræves (for eksempel bruger en zoom på 0,7, og et skridt størrelse på 0,45 um at erhverve lav opløsning billedstakke). Hvis billedet er større end 512 x 512, bør billedet beskæres til 512 x 512 før billedet kombination, og pixelstørrelse bør holde på 0,105 um per pixel, mens billeddannelse det store felt. Tab af signaler et potentielt problem for dyb væv. Hvis signalet er svagt, billede den ventrale hjernehalvdel. For at reducere fotoblegning under scanningen, bruge så lav en laser magt som muligt. Brug området indikator for at kontrollere for overeksponering, inden du overfører billedstakke. Brug om muligt en konfokal mikroskop udstyret med Gaasp detektorer.
  8. Identificere og registrere placeringen af ​​neuron af interesse med hensyn til medulla neuropil (højre / venstre [R / L] og dorsal / ventral [D / V]). Kontroller, om prøven flyttes under erhvervelse billede ved at undersøge stak billedet.
    BEMÆRK: Prøve bevægelse skyldes ofte forkert montering. Hvis der opstår prøve bevægelse, kan billedet stakken ikke anvendes til registrering og bør kasseres. Re-mount prøven og erhverve billedstakke fra samme neuron.

2. Billede Dekonvolution

BEMÆRK: udfoldning trin bruger billede deconvolution software til at gendanne de erhvervede billeder, der nedbrydes af sløringog støj. Mens dette trin er valgfrit, det forbedrer billedkvaliteten. Det anbefales at bruge udfoldede billedstakke til billedet registrering og kombinationen i afsnit 3.

  1. Start deconvolution program i interaktiv tilstand. Læg stakken billedet (i LSM eller specifik mikroskopisk format) ved at vælge Menu: File / Open (eller Ctrl-o) i hovedvinduet.
  2. Klik for at markere den belastede billedstak og vælg Menu: Ops at åbne billedet operation vinduet. Brug standard Klassisk Maximum Likelihood Estimation (CMLE) algoritme.
  3. I billedet drift vinduet Klik på fanen "Parametre". Indtast de relevante parametre for linsen immersionsmediet, omsluttende medium, og numerisk åbning (fx olie, glycerin osv.) (F.eks nedsænkning olie, osv.) (NA, her, 1.3 blev anvendt). Tjek de resterende parametre for at sikre, at de korrekt afspejler de billeddiagnostiske betingelser. Klik på fanen "Set alt verificeret" at finAlize parameterindstillingerne.
  4. I billedet drift vinduet Klik på "Operation" fanen. Tildel en output destination (f.eks c). Indtast passende antal i "Signal / Noise pr kanal" (fx "12 12 12 12" er et godt udgangspunkt, mens standardindstillingen er "20 20 20 20"). Brug standardindstillinger for de resterende parametre.
  5. Klik på fanen "Kør kommando" for at starte deconvoluting stack billedet; denne proces kan tage op til ti minutter at fuldføre, afhængigt af computeren.
  6. I hovedvinduet, klik og vælg den udfoldede billedstak. Vælg Menu: Gem som for at gemme udfoldede billede i ICS billedfil format (.ics og .ids).
    BEMÆRK: Hvert billede stak har to filer: den ics fil indeholder header information og ids fil indeholder rå billedinformation.
    1. Omdøb billedet stak filer i henhold til det billeddannende orientering (f.eks navngive den horisontale-view billede rtegnestifter H.ids og H.ics og frontal-view billedstak F.ids og F.ics).

3. Dual-view billedkombination

Bemærk: Dette trin kombinerer to billede stakke at generere høj opløsning 3D-billeder ved hjælp af MIPAV software.

  1. Generering matricer til billedbehandling kombination.
    1. Start MIPAV programmet. Indlæs H og F billedstakke ved at vælge Menu: Filer / Åbn billede (A) fra Disk (eller Ctrl-f) /H.ids og F.ids; vinduet vil vise to billeder.
    2. Vælg H billede ved at klikke på billedet og vælge Menu: Hjælpeprogrammer / Conversion Værktøj / RGB / Grays; vinduet vil vise GrayG, GrayB, og GrayR billeder.
    3. Luk GrayR og GrayB, kun holde GrayG på vinduet.
    4. Vælg F-billede ved at klikke på billedet og vælg Menu: Hjælpeprogrammer / Conversion Værktøj / RGB / Grays. Vinduet vil vise GrayG1, GrayB1, og GrayR1 billeder.
    5. Luk GrayR1 og GrayB1 og kun beholde GrayG1 på vinduet. På dette trin, kun GrayG og GrayG1 er på vinduet.
    6. Vælg GrayG (fremhæve), vælge Menu: Algoritmer / Tilmelding / Optimeret Automatic Image Registrering; "Optimeret Automatic Image Registration 3D" dialogboksen vil poppe op.
      1. I inputindstillinger, ændre de "Grader af frihed" fra standard "Affine-12" til "Specifik rescale-9." I "Rotations", indtaster -105 til 105 i "Rotation vinkel sampling interval" (standard: -30 til 30 grader), 10 i "Grov vinkel tilvækst" (standard: 15 grader), og 3 i "Fin vinkel tilvækst "(standard: 6 grader).
    7. Klik på OK; den første Matrix "GrayG_To_GrayG1.mtx" vil blive genereret og gemt i mappen billedet. Luk alle billedvinduer og gå videre til næste trin; dette skridt vil tage mindst 15 minutter.
    8. Indlæs H og F billedstakke ved at vælge Menu: Filer / Åbn billede (A) fra Disk (eller Ctrl-f) /H.ids og F.ids, som i trin 3.1.1.
    9. Vælg H billede ved at klikke på billedet og vælge Menu: Hjælpeprogrammer / Conversion Værktøj / RGB / Gray; den "RGB> Grå" dialogboksen vil poppe op. Klik på OK; vinduet vil vise "HGray" billeder. Hold HGray og luk H billede.
    10. Gentag trin 3.1.9 for F-billedet; de "FGray" billeder vises på vinduet. Hold FGray og luk F billedet; kun HGray og FGray vil blive efterladt på vinduet.
    11. Vælg HGray billede (fremhæve) og gå til Menu: Algoritmer / Transformation værktøjer / Transform. Den "Transform / Nye billeddata" dialogboksen vil poppe op. Klik på "Resample" fanen og ændre resample til størrelsen af ​​"HGray" til "FGray". Næste, klik på fanen "Transform" og belastning "GrayG_To_GrayG1.mtx" ved at vælge "Læs matrix fra fil." Klik på OK; vinduet vil vise HGray_transform billedet. Luk HGray billede, så kun HGray_transform og FGray er tilbage på vinduet.
    12. Vælg "HGray_transform & #34; billede (fremhæve) og gå til Menu: Algoritmer / Tilmelding / Optimeret Automatic Image Registration. Den "Optimeret Automatic Image Registration 3D" dialogboksen vil poppe op. I "Rotations," nøgle i -5 til 5 i "Rotation vinkel sampling interval" (standard: -30 til 30 grader), 3 i "Grov vinkel tilvækst" (standard: 15 grader), og 1 i "Fin vinkel tilvækst "(standard: 6 grader). Klik på OK.
      BEMÆRK: Affine Matrix (HGray_transform_To_FGray.mtx) blive genereret og gemt i billedet mappen og "HGray_Transform_register" billede vil blive vist på vinduet. Dette skridt vil tage mindst 40 min.
    13. Luk "HGray_transform" billede; kun "HGray_Transform_register" og "FGray" bør overlades på vinduet.
    14. Vælg "HGray_Transform_register" billede (fremhæve) og gå til Menu: Algoritmer / Tilmelding / B-Spline Automatisk registrering 2D / 3D. "B-spline Automatisk Registeron-3D intensitet "dialog boks vil poppe op. Vælg" Least Squares "i Cost-funktionen (standard er Correlation Ratio).
      1. Klik på "Udfør to-pass registrering". I afsnittet Pass 1, nøgle i to til "Gradient Descent Minimer Step Size (prøveenheder)" (standard er 1) og indtast 10 i "Maksimum antal iterationer:" (standard er 10). I afsnittet Pass 2, nøglen i en i "Gradient Descent Minimer Step Size (prøveenheder)" (standard er 0,5) og indtast 2 ind "Maksimum antal iterationer:" (standard er 10).
        BEMÆRK: NLT matrix, "HGray_transform_register.nlt," vil blive gemt i mappen billedet og "HGray_transform_register_registered" billede vil blive vist på vinduet. Dette trin vil tage mindst 5 min.
    15. Luk alle billederne på vinduet.
  2. Generering reference billede til billede kombination.
    BEMÆRK: Dette trin er beregnet til at Generspiste et registreret vandret billede til kombination.
    1. Load H og F billedstakke ved at vælge Menu: Filer / Åbn billede (A) fra Disk (eller Ctrl-f) /H.ids og F.ids; to billeder vises på vinduet.
    2. Vælg H billede (fremhæve) og gå til Menu: Algoritmer / Transformation værktøjer / Transform; den "Transform / Nye billeddata" dialogboksen vil poppe op. Klik på "Resample" fanen og ændre resample fra en størrelse på "H" til "F" Næste, klik på fanen "Transform" og belastning "GrayG_To_GrayG1.mtx" ved at vælge "Læs matrix fra fil." Klik på OK; Den H_transform billedet vises på vinduet. Luk H billedet men holde H_transform og F i vinduet.
    3. Vælg "H_transform" billede (fremhæve) og gå til Menu: Algoritmer / Transformation værktøjer / Transform; den "Transform / Nye billeddata" dialogboksen vil poppe op. Klik på "Resample" fanen og ændre resample fra en størrelse på "H_transform" til "F. & #34; Næste, klik på fanen "Transform" og belastning "HGray_transform_To_FGray.mtx" ved at vælge "Læs matrix fra fil." Klik på OK; den "H_transform_transform" billede vises på vinduet. Luk H_transform billede; på dette tidspunkt, vil kun H_transform_transform og F efterlades på vinduet.
    4. Vælg "H_transform_transform" billede (fremhæve) og gå til Menu: Algoritmer / Transformation værktøjer / Transform lineær; den "Nonlinear B-Spline Transformation" dialogboksen vil poppe op. Dernæst belastning "HGray_transform_register.nlt" og klik OK; den "H_transform_transform_registered" billede vises på vinduet. Gem billedet som en ics fil. Luk alle billederne på vinduet.
  3. Kombination billedstakke
    BEMÆRK: Dette trin er at kombinere to billedstakke erhvervet i ortogonale retninger (horisontale og frontale) i en høj opløsning stakken.
    1. Gå til Menu: plugins / Standard / Drosophila Retinal Registrationl; den "Drosophila Retinal Registrering v2.9" dialogboksen vil poppe op. Upload "H.ics" i billedet H, "H_transform_transform_registered" fra trin 3.2.4 i Image H-tilmeldte, "F.ics" i Image F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" fra trin 3.1.7 i Transformation 1-Grøn (valgfri ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" fra trin 3.1.12 i Transformation 2-Affine, og "HGray_transform_register.nlt" fra trin 3.1.14 i Transformation 3-Nonlinear (ekstraudstyr).
      1. Vælg sqrt (Intensitet-H x Intensitet-F) og nr rescale i "rescale H til F." Hold standardindstillinger for de resterende parametre. Klik på OK; dette skridt vil tage omkring 3 min.
        BEMÆRK: Efter behandling, 3 sæt billeder vil blive genereret: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (det endelige rekombineret billede), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (grøn kanal for H, F, og det endelige rekombineret billede), og redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (rød kanal foR H, F, og det endelige rekombinerede billede); alle output-filer vil blive ændret til 512 x 512 x 512.
    2. Åbn "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" under billedet visualisering software. Spar stak billedet i IMS format og omdøbe filen; dette rekombineret billedfil vil blive anvendt til neurit sporing og registrering.

4. neurit Tracing og referencepunkt Assignment

BEMÆRK: Dette trin er at spore neuritter (4.1), og at tildele referencepunkter for registrering (4.2) ved hjælp af billedet visualisering software.

  1. Sporing neuritter
    1. Start billedet visualisering software. Åbn rekombineret billedfil. Gå til Menu: Rediger / Vis Display Justering og slukke for fotoreceptor kanal (rød).
    2. Visualisere billedet i "overgå" mode. Tænd "stereo" og bruge "Quad Buffer" mode for at visualisere 3D-billeder, hvis computeren er equipped med et stereograph system.
    3. Gå til Menu: Overgå / Filaments at tilføje nye tråde. Klik på "Skip automatisk oprettelse, redigere manuelt" fanen.
    4. Klik på fanen "Uafgjort" og vælg "AutoDepth."
    5. Vælg "Indstillinger" check "Linie", og indtast et passende antal pixel for bedre visualisering (en 4-pixel linje bruges i denne protokol). Check "Show dendritter," "Fra Point" og "forgreningspunkter". Indstil "Render Kvalitet" til 100%.
    6. Vælg "Uafgjort" fanen og begynde at spore neuritter. Start med den Axon og derefter flytte til dendritter (Figur 2D). Axon og dendritter af transmedulla neuroner er lette at skelne.
      BEMÆRK: En Tm neuron udvider sin Axon fra cellen kroppen og projekter hele vejen til den højere visuel bearbejdning center, lobula. Systemet vil automatisk definere den første lange filamenter som en axon, og de resterende korte filamenter somdendritter. Hold udgangspunktet i begyndelsen af ​​glødetråden (Axon) under sporing og sørge for, at spores neuritter er tilsluttet. Undersøg forgrenede punkter og begyndelsen punkt. Hvis dendritter ikke er tilsluttet, vil en ny begyndelse punkt defineres på den ikke-tilsluttede glødetråd.
    7. Efter opsporing, gå tilbage til "Indstillinger" fjerne markeringen "Begyndelsen Point" og "Forgrening Point", og gå til Menu: Overgå / Export valgte objekter ../. Gem glødetråden som opfinder fil (* .IV).
  2. Tildeling referencepunkter
    1. Vælg "Vis Display Adjustment" og tænd begge billeddiagnostiske kanaler. I dette eksempel er kanal 1 er fotoreceptor-farvning og kanal 2 er Tm20 neuron (GFP).
    2. Gå til Menu: Overgå / Måling. Vælg fanen "Rediger" og marker "specifik Channel:" (vælg fotoreceptor kanal [rød]).
    3. Tildel referencepunkter for det øverste lag. Gå til Menu: / overgå / Måling PoiNTS at skabe nye målepunkter. Markere begyndelsen af ​​M1 lag som et toplag. Rækkefølgen af punkterne er som følger: ækvatoriale, anterior-ækvatoriale, anterior, anterior-ventrale, ventrale, posterior-ventrale, posterior, posterior-ækvatoriale, og centrum (figur 3F); Definerer centrum fotoreceptor som den, der er forbundet med de mest dendritiske processer.
    4. Tildele R8 og R7 lag som i trin 4.2.3 (figur 3G). Tre individuelle målepunkter bør oprettes i trin 4.2.3 og 4.2.4.
    5. Eksportere koordinaterne for punkterne for hvert lag. Klik på "Statistik" fanen, skal du vælge "Detaljeret", "Specifikke værdier" og "Position" og klik på "Export Statistik på Tab Display til fil." Gem som "Komma separeret værdier" (* .csv).
    6. Åbn de tre CSV-filer (fra trin 4.2.3 - 4.2.4) og kombinere koordinaterne for de 27 referencepunkter i en ny csv-fil ved at kopiere og indsætte (the ordre er Top, R8 og R7). Se Materialer / udstyr Tabel og følge formatet for det eksempel fil.

5. Stiv-krop og TPS Nonlinear Registrering

BEMÆRK: Dette trin er at registrere de neurit spor (i iv-format) til henvisningen kolonnen array og til at generere et registreret SWC fil ved hjælp af MIPAV programmet. Dette afsnit kræver følgende filer: den rekombineret billedstak (.ids) fra trin 3.3, referencepunktet fil (.csv) fra trin 4.2, og neurit glødetråd sporingsfilen (.IV) fra trin 4.1.

  1. Gå til Menu: plugins / Standard / DrosophilaStandardColumnRegistration. Den "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" vindue vil poppe op.
  2. Læg de billedfiler (.ids), den referencepunkter fil (.csv), og glødetråden fil (.IV).
  3. Vælg 9 point pr lag.
  4. Vælg placeringen af ​​det afbildede neuron (LV / RD eller RV / LD).
  5. Vælg "Stiv Registerpå og TPS "og" Rigid Registration "til ikke-lineær og rigid-body registrering hhv.
  6. Check "Opret SWC fil" for at generere de følgende output filer: en registreret neurit sporingsfil i SWC format (se specifikke materialer / Udstyr til definition), en registreret IV fil (.IV), koordinater for standardiserede neurit (.txt), transformerede koordinater (.txt), og det kombinerede billede (.ids).
  7. Ændre navnet på den SWC fil. Påfør forkortelse af den placering til slutningen af ​​filnavnet (trin 1.7). Brug f.eks "Tm20_3_RV.swc" for Tm20 neuron # 3 placeret ved den ventrale halvdel af retten medulla.

6. Standardisering til Højreklik ventrale konfiguration

BEMÆRK: Dette trin er at konvertere neurit spor (i SWC format) til standard RV (højre ventrale) konfiguration ved hjælp af brugerdefinerede script "RV_standardization.m." Her blev script skrevet i matrixen laboratorium sprog. Detnavnene på de input SWC filer skal være i følgende format: "NeuronName _ Antal _ Configuration .swc" (f.eks, Tm20_3_LV.swc).

  1. Åbn "RV_standardization.m" script.
  2. Rediger følgende parametre i afsnittet "Bruger input":
    1. Skriv navnene på de neuroner uden nummerering (f.eks TM2, Tm20, etc.) i "neuron_names."
      BEMÆRK: Standard i "file_end_in" er "_ * SWC,.", Som ser efter filer med navne, der indeholder ( "*" er et wildcard matcher et vilkårligt antal tegn) "_ * SWC.". Standard af "swc_file_end_out" er "_f.swc", som vil tilføje "_F" til slutningen af ​​filnavnet efter standardisering.
    2. Angiv den mappe, hvor SWC filer er i "directory_in". Angiv den mappe, hvor de standardiserede filer vil gå i "directory_swcout".
  3. Kør scriptet.
  4. Ooptional: Brug Vaa3D 14 at visualisere SWC filer og validere konverteringen.

7. Beregn Dendritiske Forgrening og om afslutning Frekvenser

BEMÆRK: Dette trin anvender stive-body registreret SWC filer til at beregne Kaplan-Meier estimatorer for sandsynligheden for, at en dendritisk segment vil nå en given længde uden afslutning. Dette script bruger to Dendritic_Tree_Toolbox funktioner: extractDendriticSegmentLengthDistribution og estimateDendriticSegmentLengthProbability.

  1. Åbn "Branch_term_P.m" script.
  2. Rediger følgende parametre i afsnittet "Bruger input":
    1. Angiv stien til de stive-body registrerede SWC filer i "pathToSWCFiles" (f.eks / Rigid_Registered_swc /). Angiv stien, der vil holde den grafiske output i "pathToOutput." Angiv navnet på de neuroner eller neurale typer i "neuron_names" (f.eks, TM2, Tm20, etc.).
  3. Kør scriptet; udgangene er Kaplan-Meier estimat kurve for dendritiske forgrening og ophør.
    BEMÆRK: Valgfrit: Påfør funktion-montering metode til at udvinde fra Kaplan-Meier estimatorer den lokale sandsynlighed for, at den dendritiske segment vil forgrene eller afslutte.

8. Plot distribution af Layer-specifikke Opsigelse af dendritiske holdere

BEMÆRK: Dette trin afbilder fordelingen af ​​dendritiske terminaler i forskellige medulla lag som et søjlediagram. Dette kan påføres på den ene neuron, en gruppe af neuroner eller grupper af neuroner. Scriptet bruger extractDistributionAlongAxis funktion fra Dendritic_Tree_Toolbox.

  1. Åbn "Layer_term.m" script.
  2. Rediger følgende parametre i afsnittet "Bruger input":
    1. Angiv den mappe, der indeholder ikke-lineære registreret SWC filer i "pathToSWCFiles" (f.eks / Non_linear_Registered_swc /). Angiv mappen til grafik output i "pathToOutput." Angiv navnet på de neuroner eller neurale typer i "neuron_names" (f.eks TM2, Tm20, etc.).
  3. Kør tutorial script. Udgangen er et histogram over andelen af ​​terminal knuder i bestemte medulla lag.

9. Plot Planar Projection Direction af dendritter

BEMÆRK: Dette trin plotter plane projektion retninger af dendritter som en polær plot. Scriptet bruger extractAngularDistribution funktion fra Dendritic_Tree_Toolbox.

  1. Åbn scriptet "Planar_proj.m."
  2. Rediger følgende parametre i afsnittet "Bruger input".
    1. Angiv den mappe, der indeholder den ikke-lineære registrerede SWC filer i "pathToSWCFiles" (f.eks / Non_linear_Registered_swc /). Angiv mappen til grafisk produktion i "pathToOutput." Angiv navnet påde neuroner eller neurale typer i "neuron_names" (f.eks TM2, Tm20, etc.).
  3. Kør scriptet; outputtet er en polær afbildning af plane projektionsretninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Brug af dual-view imaging procedure præsenteres her, blev en flue hjerne indeholder tyndt mærket Tm20 neuroner afbildet i to ortogonale retninger. Forud for billeddannelse, blev hjernen farves med passende primære og sekundære antistoffer til visualisering af membran-tøjret GFP og fotoreceptor axoner. Til billeddannelse, blev hjernen først monteret i vandret retning (figur 2A, B). En GFP-mærkede Tm20 neuron og de omgivende fotoreceptor-axoner blev afbildet under anvendelse af et konfokalt mikroskop (figur 3A). Hjernen blev derefter igen på linie (figur 2A, B) og samme Tm20 neuron blev igen afbildet i frontal orientering (figur 3B). Under billeddannende proces blev placeringen af ​​Tm20 neuron identificeret som på den ventrale halvdel af den højre medulla neuropil (RV konfiguration). Disse to billedstakke blev udfoldede ved hjælp af billedet deconvolution software og recombined hjælp MIPAV (figur 3C) til at generere en rekombinant billedstak (figur 3C). Det rekombinante billedstak viste en signifikant reduktion af aksial forvrængning i forhold til enten input stabel (figur 3A ', B').

Brug af billedet visualisering software, blev Axon og dendritter af Tm20 neuron spores (figur 3D) og gemt som opfinder (iv) fil. 27 referencepunkter på fotoreceptor axoner omkring Tm20 neuron blev tildelt (figur 3E - H) og gemmes som en kommasepareret fil (CSV). De spores dendritceller filer og referencepunkt fil blev efterfølgende anvendt på den brugerdefinerede plugin i MIPAV at generere stiv-body registrerede og ikke-lineært registrerede dendritceller spor i SWC filformat. De registrerede dendritiske spor blev konverteret til standard RV konfiguration ved hjælp af "RV_standardization.m" script. Than registreret og standardiserede dendritiske sporingsfiler blev visualiseret ved hjælp Vaa3D at validere de registrerings- og standardisering processer (figur 3i).

For dendritiske analyse, registreret dendritiske spor for 15 Tm20 neuroner og 15 TM2 neuroner blev indsamlet. Brug af "Branch_term_P.m" script, forgreningen og terminering sandsynlighed af disse neuroner blev analyseret ved anvendelse af stive-legeme registrerede dendritiske spor (figur 4A, B). De Kaplan-Meier kurver viser, at både neuronale typer har lignende forgrening og om afslutning frekvenser. Imidlertid TM2 har en lavere terminerende frekvens for længere segmenter (> 4 um, figur 4A) 12. Til analyse dendritiske egenskaber forbundet med lag og kolonner, blev de dendritiske spor, der er registreret ved ikke-lineær registreringsmetode den anvendes. Brug af brugerdefinerede "Layer_term_P.m" script, distributions af lag-specifikke dendritiske opsigelse for TM2 og Tm20 neuroner blev beregnet (figur 4C, D). De forskellige fordelinger af lag-specifikke opsigelser af TM2 og Tm20 dendritter er i overensstemmelse med deres specifikke synaptiske partnere i forskellige lag: TM2 dendritter modtager input fra L2 og L4 axonale terminaler i M2 og M5 henholdsvis mens Tm20 dendritter modtager input fra R8 og L3 i M3 laget 8, 15, 16. Brug af "Planar_proj.m" script blev de plane projektion retninger af TM2 og Tm20 dendritter analyseret og viste sig at være adskilt fra hinanden: TM2 dendritter projekt posteriort mens Tm20 dendritter projekt anteriort 12 (figur 4E, F).

figur 1
Figur 1. Workflow. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Eksempel på Forberedelse til Dual-view Imaging og Symmetry af Drosophila Medulla Column Array. (A, B) Prøve montering for dual-view billeddannelse. (A) Udsigten vises som hvis man ser på hjernen gennem et dækglas. (B) Skematisk tegning for prøve montering. Til billedbehandling horisonttal stakke, den immunofarvet hjerne monteres først på den ventrale-up position. Efter at have opnået den første stabel, er hjernen omplaceres i anterior-up position til afbildning af frontal stakken. A: anterior; P: posterior; D: dorsal; V: ventral; R: højre; L: venstre. (C - E) Den symmetri og organisering af medulla neuropil, set i den frontale position. (C) fotoreceptor-axoner, der mærkes af 24B10 antistof (rød), blev anvendt til at visualisere organiseringen af medulla neuropil. Billedet vises som hvis leder udefra ind i hjernen. Ant: anterior; Pos: posterior; Dor: dorsal; Ven: ventrale; Eq: ækvator. (D) En høj-forstørrelse af (C) på fire kvadranter af medulla neuropil i R7 laget niveau. De centrale R7 terminaler er markeret med gule prikker. Den forreste og ækvatoriale R7s er mærket med grønne og cyan dots hhv. (E) En skematisk fremstilling af medulla columnar organisation. Bemærk, at venstre og højre medulla neuropils er spejlbilleder, og dorsale og ventrale halvdele af hver neuropil også spejlbilleder, adskilt af ækvator. Røde prikker angiver ækvatoriale R7s, som er de første referencepunkter. Numbers (1 - 9) og pile viser rækkefølgen af ​​henvisningen point opgaver. Målestok: 15 um i C; 5 um i D. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Billede Rekombination og referencepunkt Overdragelse. (A - C) Konfokal billeder for en enkelt Tm20 neuron erhvervet i den vandrette (A) og frontale (B) retninger. Billeder vises som maksimal intensitet fremskrivninger. Fotoreceptor axoner og en enkelt Tm20 neuron er mærket med Mb24B10 antistof (rød) og membran-bundet GFP (grønt), hhv. (C) rekombinerede foto af (A, rød) og (B, cyan). For overskuelighedens skyld vises der kun fotoreceptorer. (A '- C') Dual-imaging forbedrer aksial opløsning. Det rekombineret billede (A ') har en bedre opløsning end den horisontale-view (A') og frontal-visning (B ') billeder. Lavere paneler: stor forstørrelse udsigt over de boxed områder i de øverste paneler. (D) Sporing Axon (hvid) af en enkelt Tm20 neuron. Begyndelsen punkt blev angivet som en cyan prik. (E) De 27 referencepunkter (hvide prikker) på de 9 fotoreceptorer axoner omgiver Tm20 neuroner anvendes som vartegn. De referencepunkter er i tre lag: Top, R8 og R7. (F) Referencepunkt opgave i hvert lag. Referencepunktet Opgaven følger fol gende rækkefølge: ækvator (Eq), anterior-ækvator (AE), anterior (A), anterior-ventrale (AV), ventrale (V), posterior-ventrale (PV), posterior (P), posterior-ækvator (PE) og centrum (C). (G) En skematisk fremstilling af medulla kolonne arrayet brugte ved registreringen. En Tm20 neuron er vist (grøn). Medulla lag (M1-6) er som angivet. (H) Et eksempel på lag og referencepunkt opgave for en enkelt kolonne. Tre lag anvendes til at definere hver kolonne: Top, R8 og R7 (krydset af M5 / 6 lag). (I) En registreret og standardiseret neurit spor visualiseret ved hjælp Vaa3D. Scale bar: 5 um i A for AC; 5 um i A 'for A'-C'; 5 um i D, E, F og G. Klik her for at se en større version af dette tal.

410fig4.jpg "/>
Figur 4. Eksempler på resultater fra dendritiske Analyser. (A, B) Kaplan-Meier-estimater (y-aksen) dendritisk forgrening (A) og afslutning (B) blev plottet i logaritmisk skala i forhold til segment længde (x-aksen). Solid og stiplede linjer angiver gennemsnit ± SDS. TM2 (rød) og Tm20 (sort) deler lignende forgrening og om afslutning frekvenser til segmenter mindre end 4 um. (C, D) Histogrammer der viser den gennemsnitlige andel af terminale dendritiske knudepunkter i hver medulla (M) lag. Andelen af ​​terminale knuder i en given medulla lag beregnes først for hver neuron af en given type og gennemsnittet beregnes derefter over alle neuronerne af denne type. De lodrette søjler viser standardafvigelsen for andelen. Bemærk, at for TM2 neuroner (C), fordelingen af terminal dendritiske noder er koncentreret i medulla lag 2, med en mindre top i lag 5, mens det for Tm 20 neuroner(D), er fordelingen centreret omkring M2 og M3 lag. (E, F) Polar plots af den plane projektion retning af dendritter. Andelen af ​​terminale knuder projiceret inden en vinkelformet beholder (20 °) blev først beregnet for hver neuron af en given type og derefter et gennemsnit for alle neuroner af den type. De røde og blå kurver viser den gennemsnitlige andel ± standardafvigelse. Hjørnerne på kurverne er midtpunkterne i de kantede skraldespande. De sorte cirkler viser andelen værdier angivet af den sorte tal på deres side. Bemærk, at de to klasser af neuroner i gennemsnit, er orienteret i næsten modsatte retninger. A: anterior; P: posterior; D / V: dorsal / ventrale; Eq: ækvator. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi, hvordan du billede og analysere dendritiske dorne af Drosophila medulla neuroner. Det første afsnit, dual-view billeddannelse, beskriver deconvolution og kombinationen af ​​to billedstakke ind i en høj opløsning billede stak. Det andet afsnit, dendritceller sporing og registrering, beskriver opsporing og registrering af dendritter af medulla neuroner til henvisningen kolonnen array. Den tredje del, dendritiske analyse, beskriver brugen af ​​brugerdefinerede scripts til at analysere dendritiske mønstre. Tilsammen disse protokoller levere en komplet arbejdsgang til at udtrække oplysninger om dendritiske mønstre med hensyn til lag og søjler og til at bestemme dendritiske forgrening og om afslutning frekvenser.

Den dual-view imaging metode præsenteret her er begrebsmæssigt svarer til de multi-view billedbehandling er indført, med lys-ark mikroskoper, hvor to eller flere billedstakke indsamlet vinkelret er rekombineret at opnå en høj aksial resolution 17, 18. Men det er teknisk udfordrende at ortogonalt gennemføre de to høje NA (blændetal) objektive linser, der er nødvendige til billeddannelse slanke dendritter. Således dual-view metode kræver billeddannelse af samme hjerne prøve i to på hinanden følgende trin og re-orientere prøven mellem billeddannelse. Fejl i billedet kombination er mest sandsynligt forårsaget af prøven bevægelse under billedbehandling eller prøve Squashing under manipulation. Endvidere mens billedet rekombinationsprocessen afbøder den aksiale forvrængning problemet og resulterer i nær-isotrope opløsning, de rekombinerede billeder er stadig under en diffraktionsgrænsen. Vores dual-view imaging metode behøver kun standard konfokal mikroskopi, som er bredt tilgængelige. Men super opløsning mikroskopi, såsom STED eller struktur belysning, hvis de er tilgængelige, vil være et glimrende alternativ til dual-view imaging metode til stede her.

Detdendrit opsporing og registrering sektion præsenteres her spor dendritiske træer og registrerer dendritiske træer til referencen kolonnen array. I denne protokol, er det kommercielt program Imaris anvendt til halvautomatisk dendritceller opsporing og til at tildele referencepunkter. Lignende opgaver kan udføres ved hjælp af en række freeware alternativer, såsom NeuronJ 19, 20 og neurit Tracer 21. Vores registrering protokollen bruger en brugerdefineret plugin implementeret i open source program MIPAV at registrere dendritceller spor til referencen kolonnen array. Til vores viden, denne registrering metode er den eneste metode, der registrerer neurit spor til søjler og lag. Denne procedure bruger arrangeret regelmæssigt fotoreceptor axoner som vartegn for registrering. De dendritiske spor genereret af det ikke-lineære registreringsmetode er ideelle til ekstraktion oplysninger om dendritiske mønstre vedrørende søjler og lag. På den andenhånd, stift-legeme registreringsmetode den justerer kartesiske akser dendritiske spor til kardinale akser i neuropil uden at ændre de dendritiske længder eller andre lokale geometriske egenskaber. Derfor er den stive legeme registreret dendritiske spor er egnede til standard morfometriske analyser.

Traditionelle dendritiske morfometrisk analyse, såsom L-foranstaltning 22, karakteriserer lokale og globale dendritiske egenskaber uden at indrykke omgivende væv. Vi har tidligere vist, at mange medulla neuroner deler dendritiske geometriske egenskaber, og at sådanne målinger er utilstrækkelige til at differentiere medulla neuron typer 12. I stedet er typespecifikke dendritiske attributter direkte forbundet med lagene og kolonner, hvor dendritter bor. Især forskellige typer af medulla neuroner projicerer dendritter i forskellige plane retninger for at afslutte i bestemte medulla lag. Disse to dendritiske attributter reflect den dendritiske funktion medulla neuroner til at modtage retinotopically rettet afferente organiseret i lag og kolonner. For at lette udvindingen af ​​disse egenskaber, vi udviklede den dendritiske træ værktøjskasse, som indeholder en række brugerdefinerede funktioner til beregning af dendritiske egenskaber. I den dendritiske analyse sektion, viser vi, hvordan disse funktioner kan anvendes til registrerede dendritiske spor at beregne fordelingen af ​​laget-specifikke terminering og plane projektion retninger af dendritter.

Den dendritiske træ værktøjskasse giver en platform for at tilføje andre brugerdefinerede funktioner til dendritiske analyse. I den dendritiske analyse afsnittet beskriver vi også processen at udlede estimater for tilsyneladende dendritiske terminerende og forgrenede frekvenser. Især disse funktioner beregne forgreningspunkterne og afslutning frekvenser baseret på en Kaplan-Meier-parametrisk estimator for sandsynligheden for, at en dendritisk segment vil strække sig til en vis lengtt uden forgrening eller afslutning 12, 23. Det er vigtigt at bemærke, at den stive-legeme registreret (men ikke ulineært opgivet) dendritiske spor bør anvendes til denne beregning, fordi det ikke-lineære registreringsproces ændrer længder dendritiske segment. De dendritiske forgrening og opsigelse frekvenser er den første afledede (hældningen) af KM kurver og kan beregnes ved hjælp af funktionen-montering metode. Endvidere nøjagtig beregning af forgreningen og terminering frekvenser kræver ofte en anselig datasæt (> 10 neuroner TM neuroner), fordi enlige neuroner har kun et relativt lille antal dendritiske segmenter. I de medfølgende eksempler, TM2 og Tm20 har lignende forgrening og om afslutning frekvenser, men TM2 forgrening frekvensen ikke er homogen på tværs forgrening længde, et karakteristisk træk ved TM2 dendritter 12.

Mens vores protokollerer designet til Drosophila medulla neuroner, kan de tilpasses til at analysere andre neuroner, omfattende dendritter i lag og kolonner, såsom andre Drosophila optiske lapper og hvirveldyr nethinden og cortex. Sådanne tilpasninger ville kræve at bygge en ny henvisning kolonne vifte baseret på systemet af interesse 12, samt mindre ændringer af MIPAV plugin. Vi leverer alle vores programmer som open source-software til at fremme samarbejde og udveksling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Intramural Research Program for National Institutes of Health, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (tilskud HD008913 til C.-HL), og Center for Informationsteknologi (PGM, NP, ESM og MM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Huygens Professional Scientific Volume Imaging version 16.05 for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV version 7.3.0 for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila
RetinalRegistration.class		 freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard
ColumnRegistration.class		 freeware
Imaris Bitplane for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab Mathworks R2014b for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14 v1.14 for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox v1.0 For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name Company Catalog number Comments
Sample files
SWC file definition http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example  https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=
1471880596000&api=v2
Name Company Catalog number Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later 3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card Nvidia for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2 Nvidia http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2 http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name Company Catalog number Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody The Developmental Studies Hybridoma Bank 24B10
GFP Tag Antibody Thermofisher Scientific G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488 Thermofisher Scientific A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568 Thermofisher Scientific A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000
Mounting Clay  Fisher S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm Zeiss 474030-9000-000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaas, J. H. Topographic maps are fundamental to sensory processing. Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).
  2. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).
  3. Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. CSH Perspect Biol. 2 (3), a001743 (2010).
  4. Clandinin, T. R., Feldheim, D. A. Making a visual map: mechanisms and molecules. Curr Opin Neurobiol. 19 (2), 174-180 (2009).
  5. Luo, J., McQueen, P. G., Shi, B., Lee, C. H., Ting, C. Y. Wiring dendrites in layers and columns. J Neurogenet. 30 (2), 69-79 (2016).
  6. Meinertzhagen, I. A., Hanson, T. E. The development of the optic lobe. In The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 1363-1491 (1993).
  7. Takemura, S. Y., et al. A visual motion detection circuit suggested by Drosophila connectomics. Nature. 500 (7461), 175-181 (2013).
  8. Takemura, S. Y., et al. Synaptic circuits and their variations within different columns in the visual system of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), 13711-13716 (2015).
  9. Gao, S., et al. The neural substrate of spectral preference in Drosophila. Neuron. 60 (2), 328-342 (2008).
  10. Karuppudurai, T., et al. A hard-wired glutamatergic circuit pools and relays UV signals to mediate spectral preference in Drosophila. Neuron. 81 (3), 603-615 (2014).
  11. Strother, J. A., Nern, A., Reiser, M. B. Direct observation of ON and OFF pathways in the Drosophila visual system. Curr Biol. 24 (9), 976-983 (2014).
  12. Ting, C. Y., et al. Photoreceptor-derived activin promotes dendritic termination and restricts the receptive fields of first-order interneurons in Drosophila. Neuron. 81 (4), 830-846 (2014).
  13. Ting, C. Y., et al. Tiling of R7 axons in the Drosophila visual system is mediated both by transduction of an activin signal to the nucleus and by mutual repulsion. Neuron. 56 (5), 793-806 (2007).
  14. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
  15. Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: the input terminals to the medulla. J Comp Neurol. 509 (5), 493-513 (2008).
  16. Takemura, S. Y., et al. Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway. Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).
  17. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  18. Wu, Y., et al. Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy. Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).
  19. Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. Automated analysis of NeuronJ tracing data. Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).
  20. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  21. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  22. Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).
  23. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. JASA. 53, 457-481 (1958).

Tags

Neuroscience dendritter morphometrics lag og kolonner nethinden dual-view imaging,
Analyse Dendritiske Morfologi i Kolonner og Lag
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ting, C. Y., McQueen, P. G., Pandya, … More

Ting, C. Y., McQueen, P. G., Pandya, N., McCreedy, E. S., McAuliffe, M., Lee, C. H. Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers. J. Vis. Exp. (121), e55410, doi:10.3791/55410 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter