Summary
Ici, nous montrons comment analyser dendritique routage des neurones médullaires drosophile dans des colonnes et des couches. Le flux de travail comprend une technique d'imagerie à double vue d'améliorer la qualité de l'image et des outils informatiques pour le traçage, l'enregistrement arborisation dendritique à la matrice de la colonne de référence et pour l'analyse des structures dendritiques dans l'espace 3D.
Abstract
Dans de nombreuses régions du système nerveux central, tels que les mouches lobes optiques et le cortex des vertébrés, des circuits synaptiques sont organisés en couches et des colonnes pour faciliter le câblage du cerveau au cours du développement et de traitement de l'information chez les animaux développés. neurones postsynaptiques dendrites élaborés dans les modèles spécifiques de type dans des couches spécifiques à synapse avec des terminaux présynaptiques appropriés. Le neuropile mouche rachidien est composé de 10 couches et environ 750 colonnes; chaque colonne est innervée par dendrites de plus de 38 types de neurones médullaires, qui correspondent avec les terminaisons axonales de certains types de 7 afférences dans un mode spécifique de type. Ce rapport détaille les procédures à l'image et analyser les dendrites des neurones médullaires. Le flux de travail comprend trois sections: (i) la section d'imagerie à double vue combine deux piles d'images confocale collectées à des orientations orthogonales en une image 3D à haute résolution de dendrites; (Ii) la dendrite traçage et de la section d'enregistrement des traces dendritiquetonnelles en 3D et enregistre des traces dendritiques à la matrice de la colonne de référence; (Iii) la section d'analyse dendritique analyse des motifs dendritiques par rapport à des colonnes et des couches, y compris la terminaison et projection plane direction de tonnelles dendritiques spécifiques de la couche, et calcule les estimations du branchement et de terminaison des fréquences dendritiques. Les protocoles utilisent des plugins personnalisés construits sur le MIPAV open-source (Medical Imaging Processing, l'analyse et la visualisation) plate-forme et personnalisés toolboxes dans la langue de laboratoire de la matrice. Ensemble, ces protocoles fournissent un flux complet pour analyser le routage dendritique des neurones dans les couches médulla de Drosophila et de colonnes, afin d' identifier les types de cellules, et pour déterminer des défauts dans les mutants.
Introduction
Au cours du développement, les neurones dendrites élaborés dans les modèles ramifiés complexes mais stéréotypés pour former des synapses avec leurs partenaires présynaptiques. des motifs de ramification dendritique sont en corrélation avec l'identité et la fonction neuronale. Les emplacements des arbres dendritiques déterminent le type d'entrées présynaptiques qu'ils reçoivent, tandis que le dendritique ramification complexité et sur le terrain tailles régissent le nombre d'entrée. Ainsi, les propriétés morphologiques dendritiques sont des facteurs déterminants pour la connectivité synaptique et calcul neuronal. Dans de nombreuses régions de cerveaux complexes, tels que les mouches lobes optiques et la rétine des vertébrés, des circuits synaptiques sont organisés en colonnes et en couches pour faciliter le traitement des informations 1, 2. Dans une telle organisation de la colonne et de la couche, les neurones présynaptiques d'un distinctes axones du projet de modalité de mettre fin à une couche spécifique (que l'on appelle le ciblage spécifique de la couche) et pour former un tableau à deux dimensions ordonnée (soi-called carte topographique), tandis que les neurones post-synaptiques étendent dendrites de tailles appropriées dans les couches spécifiques pour recevoir des entrées présynaptiques des types et nombres corrects. Alors que axonale ciblage des couches et des colonnes a été bien étudié 3, 4, on sait beaucoup moins sur la façon dont les dendrites sont acheminés vers des couches spécifiques et à développer de manière appropriée dimensionnées champs récepteurs pour former des connexions synaptiques avec les partenaires présynaptiques corrects 5. La difficulté de l'imagerie et dendritique quantifier le ciblage des couches et des colonnes a entravé l'étude du développement dendritique dans les structures cérébrales colonnaires et stratifiés.
Neurones médullaires drosophile sont un modèle idéal pour étudier le routage dendritique et assemblage de circuits dans les colonnes et les couches. Neuropile mouche rachidien est organisé en un réseau 3D de 10 couches et approximativement 750 colonnes. Chaque colonne est innervé par un ensemble de afférences, y compris photoreceptors R7 / R8 et les neurones de lamina L1 - L5, dont les bornes axonale former des cartes topographiques d'une manière spécifique à la couche 6. Environ 38 types de neurones médullaires sont présents dans chaque colonne rachidien et dendrites élaborées dans des couches spécifiques et avec des tailles de champs appropriés pour recevoir des entrées de ces afférences 7. Les circuits synaptiques dans les rachidien ont été reconstruits à l'échelle microscopique électronique; ainsi, les partenariats synaptiques sont bien établis 7, 8. En outre, des outils génétiques pour le marquage de différents types de neurones sont disponibles médulla 9, 10, 11. En examinant les trois types de transmedulla (TM), les neurones (Tm2, et TM9 TM20), nous avons précédemment identifié deux attributs type de cellule spécifique dendritiques: (i) neurones Tm projettent dendrites soit dans la direction antérieure ou postérieure (plane projdirection d'ection), en fonction des types cellulaires et de (ii) dendrites des neurones médulla se terminent dans les couches de la médulla spécifiques de façon type de cellule spécifique (terminaison spécifique couche) 12. Planar direction de projection et de terminaison spécifique à couche sont suffisantes pour différencier ces trois types de neurones Tm, alors que les mutations qui perturbent les réponses Tm à la couche et de colonne indices affectent aspects distincts de ces attributs.
Ici, nous présentons un flux de travail complet pour l' analyse de la structuration dendritique des neurones médullaires drosophile dans les colonnes et les couches (figure 1). Tout d'abord, nous montrons une méthode d'imagerie à double sens, qui utilise un logiciel personnalisé pour combiner deux images confocal piles pour générer des images isotropes de haute qualité. Cette méthode ne nécessite que la microscopie confocale conventionnelle pour produire des images de haute qualité qui permettent la traçabilité fiable des branches dendritiques, sans avoir recours à la microscopie de super-résolution, une telles STED (émission stimulée Depletion) ou illumination structurelle. Deuxièmement, nous présentons une méthode pour le traçage des tonnelles dendritiques et pour enregistrer les traces de neurites résultant à une matrice de colonne de référence. Troisièmement, nous montrons les méthodes de calcul permettant d'extraire des informations sur la direction de projection plane et la terminaison spécifique de la couche de dendrites, ainsi que pour dériver des estimations pour ramifier et de terminaison de fréquences dendritiques. Ensemble, ces procédés permettent la caractérisation des modèles en 3D dendritiques, la classification des types de cellules sur la base des morphologies dendritiques, ainsi que l'identification des éventuels défauts dans les mutants.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Remarque: Le protocole contient trois sections: double vue imagerie (sections 1 - 3), le traçage et l' enregistrement dendritique (sections 4 - 6), et l' analyse dendritique (sections 7 - 9) (figure 1). Les codes et les fichiers d' exemples sont fournis dans le tableau des matériaux / équipement.
1. Double image Acquisition
REMARQUE: Cette étape est conçue pour l'acquisition de deux piles d'images du neurone d'intérêt dans les orientations deux orthogonale (horizontale et frontale).
- Préparer les cerveaux de braguette qui contiennent peu de neurones marqués médulla (~ 10 cellules / lobe cérébral) avec un marqueur GFP membrane (mCD8GFP), 12 comme décrit précédemment. Teindre le cerveau de lapin anti-GFP (pour les dendrites rachidien de neurones) et de la souris mAb24B10 (pour les axones photorécepteurs), les anticorps primaires et des anticorps secondaires fluorescents (Alexa 488 anti-lapin et Alexa 568 Les anticorps anti-souris), comme décrit précédemment13. Effacer le cerveau dans 70% de glycérol dans PBS 1x.
- Pour monter le cerveau dans l'orientation horizontale (Figures 2A, B), transférer la volée cerveau de glycérol-autorisé à une baisse de 20 pi de antifade milieu de montage dans le centre d'une lame.
- Attachez de petites parcelles d'argile aux 4 coins de la lamelle pour empêcher la lamelle d'écraser l'échantillon du cerveau pendant le montage.
NOTE: Les patchs d'argile fournissent un amorti pour empêcher la lamelle de l'écrasement de l'échantillon. Chaque pastille d'argile doit être d'environ 1 mm de diamètre. - Sous un microscope de dissection, positionner les cerveaux en position ventrale et placer la lamelle sur le dessus pour fixer le cerveau. Utiliser la surface dorsale convexe du cerveau comme repère pour identifier l'orientation de l'échantillon du cerveau (figure 2A).
- Obtenir la première pile d'image (vue horizontale) avec un microscope confocal. Utiliser une lentille d'objectif à grande NA (tel qu'un 63X 1,3 NA glycérol ou immersion dans l'huile objelentille ctive) et zoom numérique 2.5X (la taille du pixel est de 0,105 um par pixel, le nombre de la moyenne est de 2). Acquérir plus de 180 sections optiques (512 x 512 pixels) pour couvrir le neuropile rachidien avec une taille de pas de 0,2 pm.
- Remontez le cerveau comme décrit dans les étapes 1.3 - 1.4, mais aligner le cerveau dans la position antérieure-up (vue frontale).
- Acquérir la seconde pile d'image (vue frontale) du même neurone, tel que décrit dans l'étape 1.5.
NOTE: Trouver le même neurone peut être difficile quand il y a de nombreux neurones marqués dans le lobe optique. Pour identifier les mêmes neurones des deux orientations, inférieure grossissement piles d'images à partir de deux points de vue peuvent être nécessaires (par exemple, utiliser un zoom de 0,7, et une taille de pas de 0,45 um pour acquérir l'image basse résolution des piles). Si l'image plus grande que 512 x 512, l'image doit être coupée à 512 x 512 avant combinaison d'image, et la taille de pixel doit garder à 0,105 um par pixel en imagerie du grand champ. La perte du signalest un problème potentiel pour les tissus profonds. Si le signal est faible, l'image de la moitié ventrale du cerveau. Pour réduire photoblanchiment lors de la numérisation, utilisez aussi bas une puissance laser que possible. Utilisez l'indicateur de plage pour vérifier la surexposition avant d'acquérir des piles d'images. Si possible, utilisez un microscope confocal équipé de détecteurs GaAsP. - Identifier et enregistrer l'emplacement du neurone d'intérêt par rapport à la neuropile rachidien (droite / gauche [R / L] et dorsale / ventrale [D / V]). Vérifiez si l'échantillon déplacé lors de l'acquisition d'image en examinant la pile d'images.
REMARQUE: déplacement de l'échantillon est souvent due à un mauvais montage. Si le mouvement de l'échantillon se produit, la pile d'image ne peut pas être utilisé pour l'enregistrement et doit être jeté. Remettre en place l'échantillon, et acquérir des piles d'images à partir du même neurone.
2. image Déconvolution
NOTE: L'étape de déconvolution utilise un logiciel d'image de déconvolution pour restaurer les images acquises qui sont dégradées par le flouet le bruit. Bien que cette étape est facultative, elle améliore considérablement la qualité de l'image. Il est recommandé d'utiliser des piles d'images déconvoluées pour l'enregistrement de l'image et la combinaison à l'article 3.
- Démarrez le programme de déconvolution dans le mode interactif. Charger la pile d'images (en LSM ou au format microscopique spécifique) en choisissant Menu: Fichier / Ouvrir (ou Ctrl-o) dans la fenêtre principale.
- Cliquez pour sélectionner la pile d'image chargée et choisissez Menu: Ops pour ouvrir la fenêtre d'opération d'image. Utilisez le classique Estimation du maximum de vraisemblance (CMLE) algorithme par défaut.
- Dans la fenêtre de commande d'image, cliquez sur l'onglet "Paramètres". Entrez les paramètres appropriés pour le moyen lentille à immersion, milieu d' inclusion, et l' ouverture numérique (par exemple, l' huile, la glycérine, etc.) (Par exemple, l' huile d'immersion, etc.) (NA; ici, 1.3 a été utilisé). Vérifiez les autres paramètres pour vous assurer qu'ils reflètent correctement les conditions d'imagerie. Cliquez sur l'onglet "Définir tout vérifié" à nageoirealize les réglages des paramètres.
- Dans la fenêtre de commande d'image, cliquez sur l'onglet "Utilisation". Attribuer une destination de sortie (par exemple, c). Entrez les numéros appropriés dans "Signal / bruit par canal" (par exemple, "12 12 12 12" est un bon point de départ, tandis que le réglage par défaut est "20 20 20 20"). Utiliser les paramètres par défaut pour les autres paramètres.
- Cliquez sur l'onglet "Run Command" pour démarrer déconvolution la pile d'image; ce processus pourrait prendre jusqu'à plusieurs dizaines de minutes pour terminer, en fonction de l'ordinateur.
- Dans la fenêtre principale, cliquez sur et sélectionnez la pile d'images déconvoluée. Choisissez Menu: Enregistrer sous pour enregistrer l'image déconvoluée dans le format de fichier d'image ICS (.ics et .ids).
NOTE: Chaque pile d'images a deux fichiers: le fichier ics contient les informations d'en-tête et le fichier ids contient les informations d'image brute.- Renommez les fichiers d' image de la pile en fonction de l'orientation de l' image (par exemple, le nom du horizontal image vue spunaises H.ids et H.ics et le frontal-image vue pile F.ids et F.ics).
3. Double-view Combinaison d'images
Remarque: Cette étape combine deux piles d'images pour générer des images 3D haute résolution en utilisant le logiciel MIPAV.
- Générer des matrices pour la combinaison de l'image.
- Démarrez le programme MIPAV. Charger les H et F piles d'images en choisissant Menu: Fichier / Ouvrir l'image (A) à partir du disque (ou Ctrl-f) /H.ids et F.ids; la fenêtre affiche deux images.
- Sélectionnez l'image H en cliquant sur l'image et choisissez Menu: Outils Utilitaires / Conversion / RGB / Grays; la fenêtre affiche GrayG, GrayB et images GrayR.
- Et fermer GrayR GrayB, ne gardant GrayG sur la fenêtre.
- Sélectionnez l'image F en cliquant sur l'image et choisissez Menu: Outils Utilitaires / Conversion / RGB / Grays. La fenêtre affiche GrayG1, GrayB1 et images GrayR1.
- Fermer GrayR1 et GrayB1 et ne garder que GrayG1 sur la fenêtre. A ce stade, seul GrJAJ et GrayG1 sont sur la fenêtre.
- Sélectionnez le GrayG (point culminant), choisissez Menu: Algorithmes / Enregistrement / Optimisé Enregistrement automatique de l'image; la boîte de dialogue "Optimisation de l'enregistrement automatique de l'image 3D" apparaîtra.
- Dans les Options d'entrée, changer les "degrés de liberté" de défaut "Affine-12" à "spécifique rescale-9." Dans clés -105 à 105 dans la "Plage de rotation angle d'échantillonnage" "Rotations" (liste par défaut: -30 à 30 degrés), 10 dans le "incrément angulaire grossier" (par défaut: 15 degrés), et 3 dans la "fine incrément angulaire "(par défaut: 6 degrés).
- Cliquez sur OK; le premier Matrix "GrayG_To_GrayG1.mtx" sera généré et enregistré dans le dossier d'image. Fermez toutes les fenêtres d'image et de passer à l'étape suivante; cette étape prendra au moins 15 min.
- Charger les H et F piles d'images en choisissant Menu: Fichier / Ouvrir l'image (A) à partir du disque (ou Ctrl-f) /H.ids et F.ids, comme à l'étape 3.1.1.
- Sélectionnez l'image H en cliquant sur l'image et choisissez Menu: Outils Utilitaires / Conversion / RGB / Gris; le "> RGB Gray" boîte de dialogue pop up. Cliquez sur OK; la fenêtre affiche des images "HGray". Gardez HGray et fermer l'image de H.
- Répétez l'étape 3.1.9 pour l'image F; les images "FGray" apparaîtront sur la fenêtre. Gardez FGray et fermer l'image F; seulement HGray et FGray seront laissés sur la fenêtre.
- Sélectionnez l'image HGray (sélectionner) et allez dans Menu: Outils Algorithmes / Transformation / Transformation. La boîte "Transform / Rééchantillonnage" de dialogue apparaîtra. Cliquez sur l'onglet "Resample" et changer le resample à la taille de "HGray" à "FGray". Ensuite, cliquez sur l'onglet "Transform" et la charge "GrayG_To_GrayG1.mtx" en sélectionnant "Lire la matrice à partir du fichier." Cliquez sur OK; la fenêtre affiche l'image HGray_transform. Fermez l'image HGray afin que HGray_transform et FGray sont laissés sur la fenêtre.
- Sélectionnez l'option "HGray_transform & #34; l'image (point culminant) et allez dans Menu: Algorithmes / Enregistrement / Optimisé Enregistrement automatique de l'image. La boîte de dialogue "Optimisation de l'enregistrement automatique de l'image 3D" apparaîtra. Dans "Rotations," clé de -5 à 5 dans la "Plage de rotation angle d'échantillonnage" (par défaut: -30 à 30 degrés), 3 dans le "incrément angulaire grossier" (par défaut: 15 degrés), et 1 dans le "Beaux incrément angulaire "(par défaut: 6 degrés). Cliquez sur OK.
NOTE: Le Affine Matrix (HGray_transform_To_FGray.mtx) sera générée et enregistrée dans le dossier de l'image et l'image "HGray_Transform_register" sera affiché sur la fenêtre. Cette étape prendra au moins 40 min. - Fermez l'image "HGray_transform"; seulement "HGray_Transform_register" et "FGray" devraient être laissés sur la fenêtre.
- Sélectionnez l'image "HGray_Transform_register" (sélectionner) et aller à Menu: Algorithmes / Enregistrement / B-Spline Enregistrement automatique 2D / 3D. Le "B-Spline automatique Registratisur-3D intensité "boîte de dialogue apparaîtra. Sélectionnez" moindres carrés "dans la fonction de coût (la valeur par défaut est Ratio de corrélation).
- Cliquez sur "Effectuer deux passes d'enregistrement". Dans la section Col 1, entrez 2 dans "descente de gradient Réduire Étape Taille (unités d'échantillonnage)" (la valeur par défaut est 1) et entrez 10 dans «Nombre maximal de Iterations:" (la valeur par défaut est 10). Dans la section Col 2, entrez 1 dans "Descent Gradient Réduire Étape Taille (unités d'échantillonnage)" (la valeur par défaut est de 0,5) et saisissez 2 dans «Nombre maximal de Iterations:" (la valeur par défaut est 10).
NOTE: La matrice de NLT, "HGray_transform_register.nlt," sera enregistré dans le dossier de l'image et l'image "HGray_transform_register_registered" sera affiché sur la fenêtre. Cette étape prendra au moins 5 min.
- Cliquez sur "Effectuer deux passes d'enregistrement". Dans la section Col 1, entrez 2 dans "descente de gradient Réduire Étape Taille (unités d'échantillonnage)" (la valeur par défaut est 1) et entrez 10 dans «Nombre maximal de Iterations:" (la valeur par défaut est 10). Dans la section Col 2, entrez 1 dans "Descent Gradient Réduire Étape Taille (unités d'échantillonnage)" (la valeur par défaut est de 0,5) et saisissez 2 dans «Nombre maximal de Iterations:" (la valeur par défaut est 10).
- Fermez toutes les images de la fenêtre.
- Générer l'image de référence pour la combinaison de l'image.
REMARQUE: Cette étape est destinée à Genermangé une image horizontale enregistrée pour la combinaison.- F l'image de charge H et des piles en choisissant Menu: Fichier / Ouvrir l'image (A) à partir du disque (ou Ctrl-f) /H.ids et F.ids; deux images apparaîtront sur la fenêtre.
- Sélectionnez l'image de H (sélectionner) et allez dans Menu: Outils Algorithmes / Transformation / Transformation; la boîte "Transform / Rééchantillonnage" de dialogue apparaîtra. Cliquez sur l'onglet "Resample" et changer le resample à partir d'une taille de "H" à "F." Ensuite, cliquez sur l'onglet "Transform" et la charge "GrayG_To_GrayG1.mtx" en sélectionnant "Lire la matrice à partir du fichier." Cliquez sur OK; l'image H_transform apparaîtra sur la fenêtre. Fermez l'image de H, mais garder H_transform et F dans la fenêtre.
- Sélectionnez l'image "H_transform" (sélectionner) et allez dans Menu: Outils Algorithmes / Transformation / Transformation; la boîte "Transform / Rééchantillonnage" de dialogue apparaîtra. Cliquez sur l'onglet "Resample" et changer le resample à partir d'une taille de "H_transform" à "F. & #34; Ensuite, cliquez sur l'onglet "Transform" et la charge "HGray_transform_To_FGray.mtx" en sélectionnant "Lire la matrice à partir du fichier." Cliquez sur OK; l'image "H_transform_transform" apparaît sur la fenêtre. Fermez l'image H_transform; à ce stade, que H_transform_transform et F seront laissés sur la fenêtre.
- Sélectionnez l'image "H_transform_transform" (sélectionner) et allez dans Menu: Outils Algorithmes / Transformation / Transformation non linéaire; la case «Transformation non linéaire B-Spline" boîte de dialogue apparaîtra. Ensuite, la charge "HGray_transform_register.nlt" et cliquez sur OK; l'image "H_transform_transform_registered" apparaît sur la fenêtre. Enregistrer l'image sous forme de fichier ics. Fermez toutes les images de la fenêtre.
- La combinaison de piles d'images
NOTE: Cette étape consiste à combiner deux piles d'images acquises dans des orientations orthogonales (horizontales et frontales) dans une pile à haute résolution.- Allez dans Menu: Plugins / Générique / Drosophila Retinal Registrationl; la boîte de dialogue "Drosophila Retinal Enregistrement v2.9" pop up. Upload "H.ics" dans l'image H, "H_transform_transform_registered" de l'étape 3.2.4 dans l'image H-enregistré ", F.ics" dans l'image F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" de l'étape 3.1.7 dans la transformation 1-Green (optionnel ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" de l'étape 3.1.12 dans la transformation de 2-affines, et "HGray_transform_register.nlt" de l'étape 3.1.14 dans la transformation de 3-Nonlinear (en option).
- Sélectionnez sqrt (Intensité-H x Intensité-F) et n ° rescale dans «Rescale H à F." Conservez les options par défaut pour les autres paramètres. Cliquez sur OK; cette étape prendra environ 3 min.
NOTE: Après le traitement, 3 séries d'images sera généré: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (l'image finale recombiné), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (canal vert pour H, F, et l'image finale recombiné), et redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (canal rouge for H, F et l'image finale recombinée); tous les fichiers de sortie seront redimensionnées à 512 x 512 x 512.
- Sélectionnez sqrt (Intensité-H x Intensité-F) et n ° rescale dans «Rescale H à F." Conservez les options par défaut pour les autres paramètres. Cliquez sur OK; cette étape prendra environ 3 min.
- Ouvrez "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" sous le logiciel d'image de visualisation. Enregistrez la pile d'images dans le format ims et renommez le fichier; ce fichier image recombinée sera utilisé pour le traçage des neurites et l'enregistrement.
- Allez dans Menu: Plugins / Générique / Drosophila Retinal Registrationl; la boîte de dialogue "Drosophila Retinal Enregistrement v2.9" pop up. Upload "H.ics" dans l'image H, "H_transform_transform_registered" de l'étape 3.2.4 dans l'image H-enregistré ", F.ics" dans l'image F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" de l'étape 3.1.7 dans la transformation 1-Green (optionnel ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" de l'étape 3.1.12 dans la transformation de 2-affines, et "HGray_transform_register.nlt" de l'étape 3.1.14 dans la transformation de 3-Nonlinear (en option).
4. neurites Tracing et Point de référence Affectation
REMARQUE: Cette étape consiste à tracer neurites (4.1) et pour attribuer des points de référence pour l'enregistrement (4.2) à l'aide du logiciel de visualisation d'image.
- Tracing neurites
- Démarrez le logiciel d'image de visualisation. Ouvrez le fichier image recombinée. Allez dans Menu: Modifier / Afficher Réglage de l'affichage et de désactiver le canal de photorécepteur (rouge).
- Visualisez l'image en mode "Surpass". Allumez "stéréo" et utiliser le mode "Quad Buffer" pour visualiser des images en 3D si l'ordinateur est equipped avec un système de stéréogramme.
- Allez dans Menu: Surpass / Filaments pour ajouter de nouveaux filaments. Cliquez sur le "Passer la création automatique, modifier manuellement" onglet.
- Cliquez sur l'onglet "Dessiner" et sélectionnez "AutoDepth."
- Sélectionnez "Paramètres" vérifier "Line" et entrez un numéro de pixel approprié pour une meilleure visualisation (une ligne 4-pixel est utilisé dans ce protocole). Cochez la case "Afficher dendrites", "Beginning Point," et "Points de branchement". Set "Qualité de rendu" à 100%.
- Sélectionnez l'onglet "Dessiner" et commencer à tracer neurites. Commencez avec l'axone et de passer ensuite aux dendrites (Figure 2D). L'axone et les dendrites des neurones transmedulla sont faciles à différencier.
NOTE: Un neurone Tm étend son axone du corps cellulaire et projette tout le chemin vers le centre supérieur de traitement visuel, le lobula. Le système définit automatiquement le premier filament pourvu que l'axone et les filaments restants courts quedendrites. Gardez le point de départ au début du filament (axone) pendant le traçage et assurez-vous que les neurites tracés sont connectés. Examiner les points de branchement et le point de départ. Si les dendrites ne sont pas connectés, un nouveau point de départ sera définie au filament non-connecté. - Après avoir tracé, revenir à "Paramètres", décochez "Commençant Point" et "Branching Point," et aller à Menu: Surpass / Export objets sélectionnés ../. Enregistrez le filament comme un fichier inventeur (* .iv).
- Attribution des points de référence
- Sélectionnez "Afficher Réglage de l'affichage" et tourner sur les deux canaux d'imagerie. Dans cet exemple, le canal 1 est la coloration du photorécepteur et le canal 2 est le neurone TM20 (GFP).
- Allez dans Menu: Surpass / Mesure. Sélectionnez l'onglet "Modifier" et vérifier "Channel spécifique:" (sélectionner le canal photorécepteur [rouge]).
- Attribuer des points de référence pour la couche supérieure. Aller au menu: / Surpass / Mesure Points pour créer de nouveaux points de mesure. Marquer le début de la couche M1 comme une couche supérieure. L'ordre des points est la suivante: équatorial, antéro-équatorial, antérieure, antéro-ventrale, ventrale, postéro-ventrale, postérieure, postérieure-équatoriale, et le centre (Figure 3F); définir le photorécepteur central comme celui qui est associé aux procédés les plus dendritiques.
- Attribuer les couches R8 et R7 comme à l' étape 4.2.3 (figure 3G). Trois points de mesure individuels devraient être créés dans les étapes 4.2.3 et 4.2.4.
- Exporter les coordonnées des points pour chaque couche. Cliquez sur l'onglet "Statistiques", sélectionnez "détaillée", "valeurs spécifiques" et "Position"; et cliquez sur "Statistiques sur les exportations sur l'onglet Affichage dans le fichier." Enregistrer sous "Comma Separated Values" (* .csv).
- Ouvrez les trois fichiers csv (des étapes 4.2.3 - 4.2.4) et de combiner les coordonnées des points de référence 27 dans un nouveau fichier csv en copiant et collant (ee ordre est Top, R8 et R7). Voir la Matériaux / Équipement Table et suivre le format du fichier d'exemple.
5. Rigid-corps et TPS Nonlinear Inscription
REMARQUE: Cette étape consiste à enregistrer les traces de neurites (en format iv) à la matrice de la colonne de référence et pour générer un fichier swc enregistré en utilisant le programme MIPAV. Cet article exige que les fichiers suivants: la pile d'image recombinée (de .ids) de l'étape 3.3, le fichier de point de référence (.csv) de l'étape 4.2, et le fichier neurites trace de filament (.iv) de l'étape 4.1.
- Allez dans Menu: Plugins / Générique / DrosophilaStandardColumnRegistration. La fenêtre "DrosophilaStandardColumnRegistration de v6.6.1" pop up.
- Chargez les fichiers image (.ids), le fichier de points de référence (.csv), et le fichier de filament (.iv).
- Sélectionnez 9 points par couche.
- Sélectionnez la position du neurone imagé (LV / RD ou RV / LD).
- Sélectionnez "Rigide Registratisur et TPS »et« Enregistrement rigide »pour non linéaire et l'enregistrement de corps rigide, respectivement.
- Cochez la case "Créer un fichier SWC" pour générer les fichiers de sortie suivants: un fichier de trace enregistrée de neurites en format swc (voir Matériaux spécifiques / Équipement pour la définition), un fichier IV enregistré (.iv), les coordonnées de l'neurites standardisé (.txt), coordonnées transformées (.txt), et l'image combinée (.ids).
- Changer le nom du fichier swc. Appliquer l'abréviation de l'emplacement à la fin du nom de fichier (étape 1.7). Par exemple, utiliser «Tm20_3_RV.swc» pour TM20 neurone n ° 3 situé à la moitié ventrale du droit medulla.
6. Normalisation Configuration droit ventral
REMARQUE: Cette étape consiste à convertir les traces de neurites (en format swc) à RV standard (droite-ventral) configuration à l'aide du script personnalisé "RV_standardization.m." Ici, le script a été écrit dans la langue de laboratoire de la matrice. lenoms des fichiers SWC d'entrée doivent être dans le format suivant: "NeuronName _ Nombre _ Configuration .swc" (par exemple, Tm20_3_LV.swc).
- Ouvrez le script "RV_standardization.m".
- Modifiez les paramètres suivants dans la section "d'entrée de l'utilisateur":
- Tapez les noms des neurones sans numérotation (par exemple, Tm2, TM20, etc.) dans "neuron_names."
REMARQUE: La valeur par défaut dans "file_end_in" est "_ * swc,.", Qui recherche les fichiers avec des noms contenant ( "*" est un joker correspondant à un nombre quelconque de caractères) "_ * swc.". La valeur par défaut de "swc_file_end_out" est "_f.swc," qui va ajouter "_f" à la fin du nom de fichier après la normalisation. - Spécifiez le répertoire dans lequel les fichiers SWC sont en "directory_in". Spécifiez le répertoire dans lequel les fichiers standardisés vont dans "directory_swcout".
- Tapez les noms des neurones sans numérotation (par exemple, Tm2, TM20, etc.) dans "neuron_names."
- Exécutez le script.
- Optionnel: Utilisez Vaa3D 14 pour visualiser les fichiers SWC et valider la conversion.
7. Calculer dendritique Branching et Finalisation Fréquences
REMARQUE: Cette étape utilise corps rigide enregistré des fichiers SWC pour calculer les estimateurs de Kaplan-Meier pour la probabilité qu'un segment dendritique atteindra une longueur donnée sans terminer. Ce script utilise deux fonctions Dendritic_Tree_Toolbox: extractDendriticSegmentLengthDistribution et estimateDendriticSegmentLengthProbability.
- Ouvrez le script "Branch_term_P.m".
- Modifiez les paramètres suivants dans la section "d'entrée de l'utilisateur":
- Spécifiez le chemin d'accès aux fichiers SWC corps rigides enregistrés dans "pathToSWCFiles" (par exemple, / Rigid_Registered_swc /). Indiquez le chemin qui contiendra la sortie du graphique dans "pathToOutput." Indiquez le nom des neurones ou des types de neurones dans "neuron_names" (par exemple, Tm2, Tm20, etc.).
- Exécutez le script; les sorties sont la courbe d'estimation de Kaplan-Meier pour ramification dendritique et la terminaison.
NOTE: En option: Appliquer la méthode de la fonction ajustée pour extraire de la méthode de Kaplan-Meier estimateurs la probabilité locale que le segment dendritique branche ou résilier.
8. Tracer la distribution de résiliation spécifique à la couche d'dendritiques Arbors
REMARQUE: Cette étape trace la distribution des terminaux dendritiques dans les différentes couches de médullaires sous forme de graphique à barres. Ceci peut être appliqué à un neurone, un groupe de neurones ou groupes de neurones. Le script utilise la fonction extractDistributionAlongAxis de Dendritic_Tree_Toolbox.
- Ouvrez le script "Layer_term.m".
- Modifiez les paramètres suivants dans la section "d'entrée de l'utilisateur":
- Spécifiez le répertoire qui contient non linéaires enregistré des fichiers SWC dans "pathToSWCFiles" (par exemple, / Non_linear_Registered_swc /). Spécifiez le répertoire pour la sortie graphique dans "pathToOutput." Indiquez le nom des neurones ou des types de neurones dans "neuron_names" (par exemple, Tm2, TM20, etc.).
- Exécutez le script d'apprentissage. La sortie est un histogramme de la proportion des noeuds terminaux dans les couches de la médulla spécifiques.
9. Terrain Projection Direction Planar de dendrites
REMARQUE: Cette étape trace les directions de projection planes de dendrites comme un tracé polaire. Le script utilise la fonction extractAngularDistribution de Dendritic_Tree_Toolbox.
- Ouvrez le script "Planar_proj.m."
- Modifiez les paramètres suivants dans la section "d'entrée de l'utilisateur".
- Spécifiez le répertoire qui contient les fichiers non linéaire swc enregistrés dans "pathToSWCFiles" (par exemple, / Non_linear_Registered_swc /). Spécifiez le répertoire pour la sortie graphique dans "pathToOutput." Indiquez le nom deles neurones ou les types de neurones dans neuron_names "» (par exemple, Tm2, TM20, etc.).
- Exécutez le script; la sortie est un tracé polaire de directions de projection planes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
À l'aide du double point de vue technique d'imagerie présenté ici, un cerveau de mouche des neurones contenant TM20 faiblement marquées a été imagée dans deux directions orthogonales. Avant l'imagerie, le cerveau a été coloré avec des anticorps primaires et secondaires appropriés pour la visualisation de GFP et photorécepteurs axones membrane attachée. Pour l' imagerie, le cerveau est monté d' abord dans le sens horizontal (figure 2A, B). Un neurone TM20 GFP marqué et les axones photoréceptrices environnants ont été imagées en utilisant un microscope confocal (Figure 3A). Le cerveau a ensuite été re-aligné (figure 2A, B) et le même neurone TM20 a été ré-imagé dans l'orientation frontale (figure 3B). Au cours du processus d'imagerie, l'emplacement du neurone TM20 a été identifié comme à la moitié ventrale du neuropile rachidien droite (configuration RV). Ces deux piles d'images ont été déconvoluées en utilisant le logiciel d'image de déconvolution et recombined à l' aide MIPAV (figure 3C) pour générer une image pile recombinante (figure 3C). L'empilement d'images recombinant a montré une réduction significative de la déformation axiale par rapport à chaque pile d'entrée (figure 3A ', B').
Utilisation du logiciel de visualisation d'image, l'axone et les dendrites du neurone TM20 ont été tracés (Figure 3D) et enregistrées comme un inventeur (iv) fichier. 27 points de référence sur les axones photoréceptrices entourant le neurone TM20 ont été assignés (Figures 3E - H) et enregistrés dans un fichier comma separated value (CSV). Les fichiers dendrites tracés et fichier de point de référence a ensuite été appliqué au plugin personnalisé dans MIPAV pour générer des traces dendrites corps rigides enregistrés et non enregistrés linéairement au format de fichier swc. Les traces dendritiques enregistrés ont été convertis à la configuration de RV standard en utilisant le "RV_standardization.m" script. Til a enregistré et les fichiers de trace dendritiques standardisés ont été visualisées en utilisant Vaa3D pour valider les processus d'enregistrement et de normalisation (Figure 3I).
Pour l'analyse dendritique, enregistrée traces dendritiques 15 neurones TM20 et 15 neurones Tm2 ont été recueillies. À l' aide du script "Branch_term_P.m", le branchement et se terminant la probabilité de ces neurones ont été analysés à l' aide de corps rigides traces enregistrées dendritiques (figure 4A, B). Les courbes de Kaplan-Meier montrent que les deux types de neurones ont une ramification similaire et les fréquences de terminaison. Cependant, Tm2 a une fréquence inférieure de terminaison pour les segments les plus longs (> 4 pm; figure 4A) 12. Pour l'analyse des propriétés dendritiques associées à des couches et des colonnes, les traces dendritiques enregistrées par le procédé d'enregistrement non-linéaire ont été utilisées. Utilisation de la coutume "Layer_term_P.m" scénario, la distributions de spécifique à la couche terminaison dendritique pour les neurones Tm2 et TM20 ont été calculées (figure 4C, D). Les distributions distinctes de terminaisons spécifiques à la couche de Tm2 et TM20 dendrites sont compatibles avec leurs partenaires synaptiques spécifiques dans les différentes couches: dendrites Tm2 reçoivent des entrées de terminaisons axonales L2 et L4 en M2 et M5, respectivement, tandis que dendrites TM20 reçoivent des entrées de R8 et L3 M3 dans la couche 8, 15, 16. Utilisation du script "Planar_proj.m", les directions de projection planes Tm2 et TM20 dendrites ont été analysés et ont été trouvés à être distincts les uns des autres: projet dendrites Tm2 arrière tout projet dendrites TM20 12 en avant (Figure 4E, F).
Figure 1. Le flux de travail. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Préparation de l' échantillon pour double-vue imagerie et la symétrie de la colonne Tableau Drosophila Medulla. (A, B) Exemple de montage pour double vue imagerie. (A) La vue est représentée comme si regardant le cerveau par une lamelle. (B) Schémas pour le montage de l' échantillon. Pour horizon d'imagerietal piles, le cerveau immuno-coloré est d'abord monté en position ventrale-up. Après l'acquisition de la première pile, le cerveau est repositionnée dans la position antérieure-haut pour imager la pile frontale. R: antérieure; P: postérieure; D: dorsale; V: ventrale; R: right; L: gauche. (C - E) La symétrie et l' organisation du neuropile rachidien, vu dans la position frontale. (C) axones photoréceptrices, marquées par l'anticorps 24B10 (rouge), ont été utilisés pour visualiser l'organisation du neuropile rachidien. L'image est affichée comme si vous regardez de l'extérieur dans le cerveau. Ant: antérieure; Pos: postérieure; Dor: dorsale; Ven: ventral; Eq: équateur. (D) Une vue à fort grossissement de (C) à quatre quadrants du neuropile rachidien au niveau de la couche R7. Les bornes centrales R7 sont marquées par des points jaunes. La antérieure et équatoriale R7s sont marquées avec des points verts et cyan, respectivement. (E) Une représentation schématique du co rachidienorganisation lumnar. On notera que les neuropils medulla gauche et droite sont des images de miroir, et les nageoires dorsales et ventrales moitiés de chaque neuropile sont des images en miroir, séparés par l'équateur. Les points rouges indiquent R7s équatoriales, qui sont les premiers points de référence. Numbers (1 - 9) et les flèches indiquent l'ordre des points de référence des missions. Barre d'échelle: 15 um C; 5 pm dans D. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Recombinaison image et Point de référence Affectation. (A - C) images confocale pour un seul neurone TM20 acquise dans le sens horizontal (A) et frontale (B) directions. Les images sont affichées comme des projections au maximum d'intensité. axones photoréceptrices et un seul TM20 neuron sont marqués avec un anticorps Mb24B10 (rouge) et de la membrane-tethered GFP (vert), respectivement. (C) l' image recombiné de (A, rouge) et (B, cyan). Pour plus de clarté, seuls photorécepteurs sont présentés. (A '- C') à double imagerie améliore la résolution axiale. L'image recombinée (A ') a une meilleure résolution que celles de la vue horizontale (A') et frontale vue (B ') images. panneaux inférieurs: vue à fort grossissement des zones encadrées dans les panneaux supérieurs. (D) Retraçant l'axone (blanc) d'un seul neurone TM20. Le point de début a été indiqué comme un point de cyan. (E) Les points 27 de référence (points blancs) sur les 9 axones photoréceptrices entourant les neurones TM20 sont utilisés comme points de repère. Les points de référence sont en trois couches: Top, R8 et R7. Point (F) Référence affectation dans chaque couche. L'affectation de point de référence suit le fol ordre suivant: équateur (Eq), antéro-équateur (AE), antérieure (A), antéro-ventral (AV), ventrale (V), postéro-ventral (PV), postérieure (P), postérieure-équateur (PE) et le centre (C). (G) Une représentation schématique de la matrice de la colonne rachidien utilisée pour l' enregistrement. Un neurone TM20 est représenté (vert). Les couches médullaires (M1-6) sont comme indiqué. (H) Un exemple de couche et point de référence affectation pour une seule colonne. Trois couches sont utilisées pour définir chaque colonne: en haut, R8 et R7 (la jonction des couches M5 / 6). (I) A enregistré et trace des neurites standardisé visualisé en utilisant Vaa3D. Barre d'échelle: 5 pm A pour AC; 5 um dans A 'pour A'-C'; 5 um D, E, F, et G. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
410fig4.jpg "/>
Figure 4. Exemples de résultats d'analyses dendritiques. (A, B) Les estimations de Kaplan-Meier (axe y) de ramification dendritique (A) et la fin (B) ont été tracés en échelle logarithmique par rapport à la longueur du segment (axe x). Les lignes pleines et pointillées représentent des moyennes ± SDs. Tm2 (rouge) et TM20 (noir) partagent une ramification similaire et les fréquences de terminaison pour les segments moins de 4 um. (C, D) Histogrammes montrant la proportion moyenne des noeuds terminaux dans chaque dendritiques rachidien (M) couche. La proportion de noeuds terminaux dans une couche rachidien donnée est d'abord calculé pour chaque neurone d'un type donné, puis en moyenne sur tous les neurones de ce type. Les barres verticales indiquent l'écart type de la proportion. Notez que pour les neurones Tm2 (C), la distribution des noeuds terminaux dendritiques est concentrée dans medulla couche 2, avec un pic mineur dans la couche 5, tandis que pour Tm 20 neurones(D), la distribution est centrée autour des couches M2 et M3. (E, F) tracés polaires de la direction de projection plane de dendrites. La proportion de noeuds terminaux prévus dans un bac d'angle (20 °) a d'abord été calculé pour chaque neurone d'un type donné, puis la moyenne sur tous les neurones de ce type. Les courbes rouges et bleues indiquent la proportion moyenne ± écart-type. Les coins sur les courbes sont les points médians des bacs angulaires. Les cercles noirs indiquent les valeurs de proportions indiquées par le chiffre noir de leur côté. Notez que, en moyenne, les deux classes de neurones sont orientés dans des directions presque opposées. R: antérieure; P: postérieure; D / V: dorsale / ventrale; Eq: équateur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ici, nous montrons comment l' image et analyser arborisation dendritique des neurones médullaires drosophile. La première section, dual-view imagerie, décrit la déconvolution et la combinaison de deux piles d'images en une image pile à haute résolution. La deuxième section, le traçage de dendrites et de l'enregistrement, décrit le traçage et l'enregistrement des dendrites des neurones médullaires à la matrice de la colonne de référence. La troisième section, l'analyse dendritique, décrit l'utilisation de scripts personnalisés pour analyser les modèles dendritiques. Ensemble, ces protocoles fournissent un flux de travail complet pour extraire des informations sur les modèles dendritiques par rapport aux couches et de colonnes et de déterminer la ramification dendritique et les fréquences de terminaison.
La méthode d'imagerie à double vue présenté ici est conceptuellement similaire aux vues multiples techniques d'imagerie mises en œuvre avec des microscopes lumière feuilles, dans lequel deux ou plusieurs piles d'images recueillies orthogonale sont recombinés pour parvenir à une resolutio axiale hauten 17, 18. Cependant, il est techniquement difficile à mettre en oeuvre orthogonalement les deux hautes NA (ouverture numérique) lentilles d'objectif qui sont requis pour imager des dendrites fines. Ainsi, le procédé à double point de vue nécessite d'imager le même échantillon de cerveau en deux étapes consécutives et réorientant l'échantillon entre imagerie. Les échecs en combinaison d'image sont très probablement causé par le mouvement de l'échantillon lors de l'imagerie ou de l'échantillon squashing lors de la manipulation. En outre, alors que le processus d'image de recombinaison atténue le problème et les résultats dans la résolution quasi-isotrope distorsion axiale, les images recombinées sont encore sous une limite de diffraction. Notre double vue méthode d'imagerie n'a besoin que la microscopie confocale standard, qui est largement disponible. Cependant, la microscopie de super-résolution, tels que l'éclairage STED ou la structure, le cas échéant, serait une excellente alternative à la méthode d'imagerie à double vue présente ici.
lesection de traçage et l'enregistrement dendrites présenté ici retrace les arbres dendritiques et enregistre des arbres dendritiques à la matrice de colonne de référence. Dans ce protocole, le Imaris programme commercial est utilisé pour dendrites traçage semi-automatisé et pour l'attribution des points de référence. Tâches similaires pourraient être effectuées en utilisant un certain nombre d'alternatives freeware, comme NeuronJ 19, 20 et neurites Tracer 21. Notre protocole d'enregistrement utilise un plugin personnalisé mis en œuvre dans le programme source de MIPAV ouverte pour enregistrer des traces dendrites à la matrice de colonne de référence. À notre connaissance, cette méthode d'enregistrement est la seule méthode qui enregistre neurites traces à des colonnes et des couches. Cette procédure utilise disposés de façon régulière axones photoréceptrices comme points de repère pour l'enregistrement. Les traces dendritiques produites par le procédé d'enregistrement non-linéaire sont idéales pour extraire des informations sur les caractéristiques relatives aux colonnes dendritiques et des couches. De l'autrePar contre, la méthode d'enregistrement de corps rigide aligne les axes cartésiens de traces dendritiques aux axes cardinaux de la neuropile sans modifier les longueurs dendritiques ou d'autres propriétés géométriques locales. Par conséquent, le corps rigide enregistré des traces dendritiques sont appropriées pour analyses morphométriques standard.
Analyse morphométrique dendritique traditionnelle, tels que L-mesure 22, caractérise les propriétés dendritiques locales et globales sans référencer les tissus environnants. Nous avons précédemment montré que beaucoup de neurones médulla partagent des propriétés géométriques dendritiques et que ces métriques sont insuffisantes pour différencier les types de neurones 12 medulla. Au lieu de cela, les attributs dendritiques spécifiques de type sont directement associés à des couches et des colonnes où dendrites résident. En particulier, les différents types de neurones médulla projettent dendrites dans des directions planes distinctes se terminent dans les couches de la médulla spécifiques. Ces deux attributs r dendritiqueseflect la fonction dendritique des neurones médullaires pour recevoir des afférences dirigés rétinotopique organisés en couches et en colonnes. Pour faciliter l'extraction de ces propriétés, nous avons développé la boîte à outils de l'arbre dendritique qui contient une série de fonctions personnalisées pour le calcul des propriétés dendritiques. Dans la section d'analyse dendritique, nous montrons comment ces fonctions peuvent être appliquées aux traces dendritiques enregistrés pour calculer la distribution de la terminaison et les directions de projection plane de dendrites spécifique de la couche.
La boîte à outils de l'arbre dendritique fournit une plate-forme pour l'ajout d'autres fonctions personnalisées pour l'analyse dendritique. Dans la section d'analyse dendritique, nous décrivons également le processus pour obtenir des estimations pour terminaison dendritique apparente et les fréquences de ramification. En particulier, ces fonctions calculent les fréquences de branchement et se terminant sur la base d'un estimateur non paramétrique de Kaplan-Meier de la probabilité qu'un segment dendritique s'étendre à une certaine length sans ramification ou mettant fin à 12, 23. Il est important de noter que le corps rigide enregistré (mais pas les nonlinearly enregistrés) traces dendritiques doit être utilisée pour ce calcul parce que le processus d'enregistrement non linéaire modifie les longueurs de segment dendritiques. Les ramifications et de terminaison fréquences dendritiques sont la première dérivée (la pente) des courbes KM et peuvent être calculées en utilisant la méthode de la fonction ajustée. En outre, le calcul précis de la ramification et les fréquences de terminaison nécessite souvent un ensemble important de données (> 10 neurones pour les neurones Tm) parce que les neurones individuels ont seulement un nombre relativement restreint de segments dendritiques. Dans les exemples fournis, Tm2 et TM20 ont ramification similaire et des fréquences de terminaison, mais la fréquence de ramification Tm2 est pas homogène sur la longueur de ramification, une caractéristique de Tm2 dendrites 12.
Bien que nos protocolessont conçus pour les neurones médulla Drosophila, ils peuvent être adaptés pour analyser d' autres neurones qui dendrites élaborées en couches et en colonnes, comme les autres lobes optiques de Drosophila et la rétine et le cortex vertébré. De telles adaptations , il faudrait construire un nouveau réseau de colonne de référence basé sur le système d'intérêt 12, ainsi que des modifications mineures du plugin MIPAV. Nous fournissons tous nos programmes en tant que logiciel open source pour promouvoir la collaboration et le partage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche intra-muros des National Institutes of Health, l'Institut Eunice Kennedy Shriver National de la santé infantile et du développement humain (subvention de HD008913 à C.-HL), et le Centre de technologie de l'information (PGM, NP, ESM et MM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | version 16.05 | for image deconvolution (https://svi.nl). commercial software |
| MIPAV | version 7.3.0 | for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware | |
| MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class |
freeware | ||
| MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class |
freeware | ||
| Imaris | Bitplane | for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software | |
| Vaa3D | for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware | ||
| Matlab | Mathworks | R2014b | for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software |
| Matlab toolbox: TREES1.14 | v1.14 | for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware | |
| Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox | v1.0 | For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Sample files | |||
| SWC file definition | http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html | ||
| The codes and sample files for image combination and registration | https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration | ||
| Reference point example | https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2 |
||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Computer system | |||
| MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later | 3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal) | ||
| Optional: Quadro4000 (or above) graphic card | Nvidia | for stereographic visualization of dendrites. | |
| Optional: NVIDIA 3D vision2 | Nvidia | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html | |
| Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2 | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html | ||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Reagents for imaging | |||
| 24B10 antibody | The Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
| GFP Tag Antibody | Thermofisher Scientific | G10362 | |
| Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermofisher Scientific | A11034 | |
| Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568 | Thermofisher Scientific | A21124 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mounting Clay | Fisher | S04179 | |
| 70% glycerol in 1x PBS | |||
| Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9000-000 |
References
- Kaas, J. H. Topographic maps are fundamental to sensory processing. Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).
- Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).
- Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. CSH Perspect Biol. 2 (3), a001743 (2010).
- Clandinin, T. R., Feldheim, D. A. Making a visual map: mechanisms and molecules. Curr Opin Neurobiol. 19 (2), 174-180 (2009).
- Luo, J., McQueen, P. G., Shi, B., Lee, C. H., Ting, C. Y. Wiring dendrites in layers and columns. J Neurogenet. 30 (2), 69-79 (2016).
- Meinertzhagen, I. A., Hanson, T. E. The development of the optic lobe. In The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 1363-1491 (1993).
- Takemura, S. Y., et al. A visual motion detection circuit suggested by Drosophila connectomics. Nature. 500 (7461), 175-181 (2013).
- Takemura, S. Y., et al. Synaptic circuits and their variations within different columns in the visual system of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), 13711-13716 (2015).
- Gao, S., et al. The neural substrate of spectral preference in Drosophila. Neuron. 60 (2), 328-342 (2008).
- Karuppudurai, T., et al. A hard-wired glutamatergic circuit pools and relays UV signals to mediate spectral preference in Drosophila. Neuron. 81 (3), 603-615 (2014).
- Strother, J. A., Nern, A., Reiser, M. B. Direct observation of ON and OFF pathways in the Drosophila visual system. Curr Biol. 24 (9), 976-983 (2014).
- Ting, C. Y., et al. Photoreceptor-derived activin promotes dendritic termination and restricts the receptive fields of first-order interneurons in Drosophila. Neuron. 81 (4), 830-846 (2014).
- Ting, C. Y., et al. Tiling of R7 axons in the Drosophila visual system is mediated both by transduction of an activin signal to the nucleus and by mutual repulsion. Neuron. 56 (5), 793-806 (2007).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
- Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: the input terminals to the medulla. J Comp Neurol. 509 (5), 493-513 (2008).
- Takemura, S. Y., et al. Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway. Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Wu, Y., et al. Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy. Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).
- Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. Automated analysis of NeuronJ tracing data. Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
- Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. JASA. 53, 457-481 (1958).
