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Neuroscience

कॉलम और परतों में वृक्ष के समान आकृति विज्ञान का विश्लेषण

Published: March 23, 2017 doi: 10.3791/55410
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 1
1Section on Neuronal Connectivity, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (NIH), 2Mathematical and Statistical Computing Laboratory, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH), 3Biomedical Imaging Research Services Section, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH)

Summary

यहाँ, हम कैसे कॉलम और परतों में ड्रोसोफिला मज्जा न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान मार्ग के विश्लेषण के लिए दिखा। कार्यप्रवाह, ट्रेसिंग संदर्भ स्तंभ सरणी के वृक्ष के समान arbors पंजीकरण के लिए और 3 डी अंतरिक्ष में वृक्ष के समान संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए छवि गुणवत्ता और कम्प्यूटेशनल उपकरण में सुधार करने के लिए एक दोहरे दृश्य इमेजिंग तकनीक भी शामिल है।

Abstract

मक्खी ऑप्टिक पालियों और कशेरुकी कोर्टेक्स के रूप में केंद्रीय नर्वस सिस्टम, के कई क्षेत्रों में, synaptic सर्किट परतों और स्तंभों में आयोजित कर रहे हैं विकास और विकसित पशुओं में सूचना प्रोसेसिंग के दौरान मस्तिष्क के तारों की सुविधा के लिए। विशिष्ट परतों में प्रकार विशिष्ट पैटर्न में पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन्स विस्तृत डेन्ड्राइट उचित presynaptic टर्मिनलों के साथ स्य्नाप्स करने के लिए। मक्खी मज्जा neuropil 10 परतों और 750 के बारे में स्तंभों से बना है; प्रत्येक स्तंभ मज्जा न्यूरॉन्स के 38 से अधिक प्रकार है, जो एक विशेष प्रकार के फैशन में afferents के कुछ 7 प्रकार की axonal टर्मिनलों के साथ मैच के डेन्ड्राइट द्वारा आच्छादित है। इस रिपोर्ट में छवि के लिए प्रक्रियाओं का विवरण और मज्जा न्यूरॉन्स की dendrites का विश्लेषण। कार्यप्रवाह तीन वर्गों में शामिल हैं: (i) दोहरे दृश्य इमेजिंग खंड डेन्ड्राइट के एक उच्च संकल्प 3 डी छवि में ओर्थोगोनल झुकाव पर एकत्र दो confocal छवि के ढेर को जोड़ती है; (Ii) डेन्ड्राइट ट्रेसिंग और पंजीकरण खंड वृक्ष के समान निशान3 डी में arbors और संदर्भ स्तंभ सरणी के वृक्ष के समान निशान रजिस्टरों; (Iii) वृक्ष के समान विश्लेषण अनुभाग कॉलम और परतें, वृक्ष के समान arbors की परत-विशिष्ट समाप्ति और तलीय प्रक्षेपण दिशा सहित के लिए सम्मान के साथ वृक्ष के समान पैटर्न का विश्लेषण करती है, और वृक्ष के समान शाखाओं में बंटी और समाप्ति आवृत्तियों का अनुमान निकला है। प्रोटोकॉल खुला स्रोत MIPAV (मेडिकल इमेजिंग प्रोसेसिंग, विश्लेषण, और दृश्य) मैट्रिक्स प्रयोगशाला भाषा में मंच और कस्टम toolboxes पर बनाया गया कस्टम plugins का उपयोग। साथ में, इन प्रोटोकॉल परतों और स्तंभों में ड्रोसोफिला मज्जा न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान रूटिंग विश्लेषण करने के लिए, सेल प्रकार की पहचान करने के लिए, और म्यूटेंट में दोष का निर्धारण करने के लिए एक पूरा कार्यप्रवाह प्रदान करते हैं।

Introduction

विकास के दौरान, जटिल लेकिन टकसाली शाखाओं पैटर्न में न्यूरॉन्स विस्तृत डेन्ड्राइट उनकी प्रेस्य्नाप्तिक सहयोगियों के साथ synapses के रूप में। वृक्ष के समान शाखाओं में बंटी पैटर्न न्यूरोनल पहचान और कार्यों के साथ सहसंबंधी। वृक्ष के समान arbors के स्थानों, प्रेस्य्नाप्तिक आदानों वे प्राप्त के प्रकार का निर्धारण करते हुए वृक्ष के समान शाखाओं में जटिलता और क्षेत्र आकार इनपुट संख्या को नियंत्रित। इस प्रकार, वृक्ष के समान गुण रूपात्मक synaptic कनेक्टिविटी और neuronal अभिकलन के लिए महत्वपूर्ण निर्धारक हैं। मक्खी ऑप्टिक पालियों और कशेरुकी रेटिना के रूप में जटिल दिमाग के कई क्षेत्रों में, synaptic सर्किट कॉलम और परतों में आयोजन किया जाता सूचना प्रोसेसिंग 1, 2 की सुविधा के लिए। (इतनी-कल्ले इस तरह के एक स्तंभ और परत संगठन में, एक अलग साधन परियोजना axons की प्रेस्य्नाप्तिक न्यूरॉन्स एक विशेष परत (तथाकथित परत विशिष्ट लक्षित) पर समाप्त करने के लिए और एक अर्दली दो आयामी सरणी बनाने के लिएडी स्थलाकृतिक नक्शा) है, जबकि पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन्स विशिष्ट परतों में उचित आकार के डेन्ड्राइट का विस्तार सही प्रकार और संख्या का प्रेस्य्नाप्तिक आदानों प्राप्त करने के लिए। जबकि axonal परतों और स्तंभों के लिए लक्षित कर अच्छी तरह से 3, 4 अध्ययन किया गया है, बहुत कम कैसे डेन्ड्राइट विशिष्ट परतों से कराई और सही प्रेस्य्नाप्तिक भागीदारों के साथ 5 synaptic कनेक्शन के लिए फार्म का उचित रूप से विस्तार ग्रहणशील क्षेत्रों आकार रहे हैं के बारे में जाना जाता है। इमेजिंग और बढ़ाता वृक्ष के समान परतों और स्तंभों को लक्षित करने की कठिनाई स्तंभ और टुकड़े टुकड़े में मस्तिष्क संरचना में वृक्ष के समान विकास के अध्ययन रुकावट है।

ड्रोसोफिला मज्जा न्यूरॉन्स वृक्ष के समान रूटिंग और स्तंभों और परतों में सर्किट विधानसभा के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल हैं। मक्खी मज्जा neuropil 10 परतों के एक 3 डी जाली और लगभग 750 स्तंभों के रूप में आयोजित किया जाता है। प्रत्येक स्तंभ पी सहित afferents का एक सेट, द्वारा आच्छादित हैhotoreceptors R7 / R8 और पटल न्यूरॉन्स एल 1 - L5, जिसका axonal टर्मिनलों एक परत-विशिष्ट फैशन 6 में स्थलाकृतिक नक्शे के रूप में। मज्जा न्यूरॉन्स के बारे में 38 प्रकार हर मज्जा स्तंभ और विशिष्ट परतों में और उपयुक्त क्षेत्र आकार के साथ विस्तृत dendrites में मौजूद इन afferents 7 से जानकारी प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं। मज्जा में synaptic सर्किट इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म स्तर पर खंगाला गया है; इस प्रकार, synaptic भागीदारी खैर, 8 7 स्थापित कर रहे हैं। इसके अलावा, मज्जा न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार लेबलिंग के लिए आनुवंशिक उपकरण उपलब्ध 9, 10, 11 हैं। transmedulla के तीन प्रकार (टीएम) न्यूरॉन्स (Tm2, Tm9 और Tm20) की जांच करके, हम पहले दो सेल प्रकार विशिष्ट वृक्ष के समान गुण की पहचान की है: (i) टीएम न्यूरॉन्स या तो पूर्वकाल या पीछे दिशा में dendrites परियोजना (तलीय projection दिशा), सेल प्रकार पर निर्भर करता है और (ii) मज्जा न्यूरॉन्स की dendrites एक सेल प्रकार विशिष्ट फैशन (परत-विशिष्ट समाप्ति) 12 में विशिष्ट मज्जा परतों में समाप्त। Planar प्रक्षेपण की दिशा और परत-विशिष्ट समाप्ति, टीएम न्यूरॉन्स के इन तीन प्रकार के भेद करने के लिए पर्याप्त हैं, जबकि म्यूटेशन कि परत और स्तंभ संकेतों के टीएम प्रतिक्रियाओं को बाधित इन विशेषताओं के विशिष्ट पहलुओं को प्रभावित करते हैं।

यहाँ, हम कॉलम और परतों (चित्रा 1) में ड्रोसोफिला मज्जा न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान आकृति की जांच के लिए एक पूरा कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं। सबसे पहले, हम एक दोहरे दृश्य इमेजिंग विधि है, जो दो confocal छवि गठबंधन करने के लिए अनुकूलित सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है उच्च गुणवत्ता वाले isotropic छवियों को उत्पन्न करने के लिए ढेर दिखा। इस विधि, उच्च गुणवत्ता के चित्र है कि वृक्ष के समान शाखाओं के विश्वसनीय ट्रेसिंग के लिए अनुमति उत्पन्न करने के लिए सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का सहारा लिए बिना केवल पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता है इस तरह के एकएस STED (प्रेरित उत्सर्जन कमी) या संरचनात्मक रोशनी। दूसरा, हम वृक्ष के समान arbors पता लगाने के लिए और एक संदर्भ स्तंभ सरणी के लिए जिसके परिणामस्वरूप neurite निशान पंजीकरण के लिए एक तरीका मौजूद है। तीसरा, हम वृक्ष के समान शाखाओं में बंटी और समाप्ति आवृत्तियों के लिए अनुमान पाने के लिए तलीय प्रक्षेपण की दिशा और dendrites की परत-विशिष्ट समाप्ति पर जानकारी निकालने, साथ ही साथ के लिए कम्प्यूटेशनल विधियों दिखा। साथ में, इन तरीकों में 3 डी, वृक्ष के समान morphologies के आधार पर सेल प्रकार के वर्गीकरण में वृक्ष के समान पैटर्न के लक्षण, और म्यूटेंट में संभावित दोषों की पहचान के लिए अनुमति देते हैं।

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Protocol

नोट: दोहरे दृश्य इमेजिंग (1 वर्गों - 3), वृक्ष के समान ट्रेसिंग और पंजीकरण (4 वर्गों - 6), और वृक्ष के समान विश्लेषण (वर्गों 7 - 9) (चित्रा 1): प्रोटोकॉल तीन वर्गों में शामिल है। कोड और उदाहरण फाइलों सामग्री / उपकरण की तालिका में प्रदान की जाती हैं।

1. दोहरे छवि अधिग्रहण

नोट: यह कदम दो orthogonal (क्षैतिज और ललाट) झुकाव में ब्याज की न्यूरॉन के दो छवि के ढेर प्राप्त करने के लिए बनाया गया है।

  1. मक्खी दिमाग कि कम मज्जा न्यूरॉन्स लेबल होते तैयार (~ 10 कोशिकाओं / मस्तिष्क लोब) एक झिल्ली GFP मार्कर (mCD8GFP) के साथ, के रूप में पहले 12 में वर्णित है। खरगोश विरोधी GFP (मज्जा न्यूरॉन dendrites के लिए) और माउस mAb24B10 (फोटोरिसेप्टर एक्सोन के लिए), प्राथमिक एंटीबॉडी, और फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी (एलेक्सा 488 विरोधी खरगोश और एलेक्सा 568 विरोधी माउस एंटीबॉडी) के साथ मस्तिष्क दाग के रूप में पहले से वर्णित13। 1x पीबीएस में 70% ग्लिसरॉल में मस्तिष्क साफ़ करें।
  2. क्षैतिज अभिविन्यास में मस्तिष्क माउंट करने के लिए (आंकड़े 2A, बी), एक स्लाइड के केंद्र में antifade बढ़ते मध्यम की एक 20 μL ड्रॉप करने के लिए ग्लिसरॉल को मंजूरी दे दी मक्खी के मस्तिष्क हस्तांतरण।
  3. बढ़ते दौरान मस्तिष्क नमूना कुचल से coverslip को रोकने के लिए coverslip के 4 कोनों पर मिट्टी के छोटे पैच संलग्न।
    नोट: मिट्टी पैच नमूना कुचल से coverslip को रोकने के लिए cushioning प्रदान करते हैं। प्रत्येक मिट्टी पैच व्यास में लगभग 1 मिमी होना चाहिए।
  4. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, उदर-अप की स्थिति में दिमाग की स्थिति और शीर्ष पर coverslip जगह मस्तिष्क को सुरक्षित करने के लिए। मस्तिष्क नमूना (2A चित्रा) के उन्मुखीकरण की पहचान करने के लिए एक मील का पत्थर के रूप में मस्तिष्क के उत्तल पृष्ठीय सतह का प्रयोग करें।
  5. एक confocal खुर्दबीन के साथ पहली छवि ढेर (क्षैतिज देखें) प्राप्त करते हैं। (जैसे एक 63X 1.3 एनए ग्लिसरॉल या तेल विसर्जन obje के रूप में एक उच्च एनए उद्देश्य लेंस का प्रयोग करेंctive लेंस) और 2.5X डिजिटल जूम (पिक्सेल आकार पिक्सेल प्रति 0.105 माइक्रोन है, औसत संख्या 2 है)। 0.2 माइक्रोन से एक कदम आकार के साथ मज्जा neuropil कवर करने के लिए 180 से अधिक ऑप्टिकल वर्गों (512 x 512 पिक्सल) मोल।
  6. कदम 1.3 में वर्णित के रूप में मस्तिष्क रिमाउंट - 1.4, लेकिन पूर्वकाल-अप पोजीशन (ललाट दृश्य) में मस्तिष्क संरेखित।
  7. 1.5 चरण में वर्णित के रूप में, एक ही न्यूरॉन की दूसरी छवि ढेर (ललाट देखें) मोल।
    नोट: एक ही न्यूरॉन ढूँढना चुनौतीपूर्ण जब वहाँ ऑप्टिक पालि में लेबल कई न्यूरॉन्स रहे हैं हो सकता है। दोनों झुकाव से ही न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए, दोनों के विचारों से कम बढ़ाई छवि के ढेर के लिए आवश्यक हो सकता है (उदाहरण के लिए, 0.7 का एक ज़ूम, और कम संकल्प छवि के ढेर के अधिग्रहण के लिए 0.45 माइक्रोन से एक कदम आकार का उपयोग करें)। 512 x 512 से भी बड़ा छवि, छवि छवि संयोजन से पहले 512 x 512 के लिए फसली तो किया जाना चाहिए, और बड़े क्षेत्र इमेजिंग जबकि पिक्सेल आकार पिक्सेल प्रति 0.105 माइक्रोन पर रखना चाहिए। संकेत के नुकसानगहरी ऊतक के लिए एक संभावित समस्या है। संकेत कमजोर, छवि मस्तिष्क के उदर आधा है। स्कैनिंग के दौरान photobleaching को कम करने के लिए, संभव के रूप में के रूप में कम एक लेजर शक्ति का उपयोग करें। छवि के ढेर प्राप्त करने से पहले overexposure के लिए जाँच करने के लिए रेंज सूचक का प्रयोग करें। यदि संभव हो तो, एक confocal GaAsP डिटेक्टरों से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  8. पहचानें और मज्जा neuropil (सही / छोड़ दिया [आर / एल] और पृष्ठीय / उदर [डी / V]) के लिए सम्मान के साथ ब्याज की न्यूरॉन के स्थान रिकॉर्ड है। अगर नमूना छवि ढेर परीक्षण करके छवि अधिग्रहण के दौरान ले जाया जाँच करें।
    नोट: नमूना चलती अक्सर अनुचित बढ़ते की वजह से है। नमूना आंदोलन होता है, तो छवि ढेर पंजीकरण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है और खारिज किया जाना चाहिए। नमूना फिर से माउंट और एक ही न्यूरॉन से छवि के ढेर के अधिग्रहण।

2. छवि Deconvolution

नोट: deconvolution कदम का अधिग्रहण किया है कि छवियों को धुंधला द्वारा अपमानित कर रहे हैं बहाल करने के लिए छवि deconvolution सॉफ्टवेयर का उपयोग करता हैऔर शोर। हालांकि इस कदम वैकल्पिक है, यह काफी छवि गुणवत्ता में सुधार। यह धारा 3 में छवि पंजीकरण और संयोजन के लिए deconvolved छवि के ढेर का उपयोग करने की सिफारिश की है।

  1. इंटरैक्टिव मोड में deconvolution प्रोग्राम प्रारंभ करें। मुख्य विंडो में फ़ाइल / ओपन (या Ctrl-ओ): छवि ढेर (एल एस एम या विशिष्ट सूक्ष्म प्रारूप में) चुनने मेनू से लोड करें।
  2. छवि आपरेशन विंडो खोलने के लिए ऑप्स: भरी हुई छवि ढेर चुनते हैं और मेनू के लिए क्लिक करें। डिफ़ॉल्ट क्लासिक अधिकतम संभावना आकलन (CMLE) एल्गोरिथ्म का प्रयोग करें।
  3. छवि आपरेशन विंडो में, "पैरामीटर" टैब पर क्लिक करें। लेंस विसर्जन माध्यम के लिए उपयुक्त मानकों दर्ज करें, embedding मध्यम, और संख्यात्मक एपर्चर (जैसे, तेल, ग्लिसरीन, आदि।) (जैसे, विसर्जन के तेल, आदि।) (एनए, यहाँ, 1.3 का इस्तेमाल किया गया था)। सुनिश्चित करें कि वे सही ढंग से इमेजिंग की स्थिति को प्रतिबिंबित करने के लिए शेष मापदंडों की जाँच करें। पंख "सेट सभी सत्यापित" टैब पर क्लिक करेंपैरामीटर सेटिंग्स Alize।
  4. छवि आपरेशन विंडो में, "ऑपरेशन" टैब पर क्लिक करें। (जैसे, ग) एक उत्पादन गंतव्य निरुपित। "चैनल के अनुसार संकेत / शोर" (जैसे, "12 12 12 12" एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है, जबकि डिफ़ॉल्ट सेटिंग "20 20 20 20" है) में उचित संख्या दर्ज करें। शेष मापदंडों के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का प्रयोग करें।
  5. "रन कमांड" टैब छवि ढेर deconvoluting शुरू करने के लिए क्लिक करें; इस प्रक्रिया को पूरा करने के लिए कंप्यूटर पर निर्भर करता है मिनट के दसियों तक का समय लग सकता है।
  6. मुख्य विंडो में, क्लिक करें और deconvolved छवि ढेर का चयन करें। मेनू का चयन: सहेजें आईसीएस छवि फ़ाइल स्वरूप (.ics और .ids) में deconvolved छवि को बचाने के रूप में।
    नोट: प्रत्येक छवि ढेर दो फ़ाइलें है: आईसीएस फ़ाइल शीर्षक में जानकारी शामिल है और आईडीएस फ़ाइल कच्चे छवि में जानकारी शामिल है।
    1. इमेजिंग उन्मुखीकरण के अनुसार छवि ढेर फ़ाइलों का नाम बदलें (जैसे, क्षैतिज दृश्य छवि नामहमलों H.ids और H.ics और ललाट-दृश्य छवि ढेर F.ids और F.ics)।

3. दोहरे दृश्य चित्र संयोजन

नोट: यह कदम दो छवि उच्च संकल्प 3 डी MIPAV सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों को उत्पन्न करने के ढेर को जोड़ती है।

  1. छवि के संयोजन के लिए matrices पैदा होता है।
    1. MIPAV प्रोग्राम प्रारंभ करें। मेनू का चयन करके एच एफ और छवि के ढेर लोड: डिस्क (या Ctrl-एफ) /H.ids और F.ids से फ़ाइल / ओपन छवि (एक); खिड़की दो छवियों को दिखा देंगे।
    2. छवि पर क्लिक करके एच छवि का चयन करें और मेनू का चयन: उपयोगिता / रूपांतरण उपकरण / आरजीबी / Grays; खिड़की GrayG, GrayB, और GrayR छवियों को दिखा देंगे।
    3. बंद GrayR और GrayB, केवल खिड़की पर GrayG रखे हुए हैं।
    4. छवि पर क्लिक करके एफ छवि का चयन करें और मेनू का चयन: उपयोगिता / रूपांतरण उपकरण / आरजीबी / Grays। खिड़की GrayG1, GrayB1, और GrayR1 छवियों को दिखा देंगे।
    5. बंद GrayR1 और GrayB1 और खिड़की पर केवल GrayG1 रहते हैं। यह कदम केवल जीआर परayG और GrayG1 खिड़की पर हैं।
    6. GrayG (उजागर) का चयन करें, चयन मेनू: एल्गोरिदम / पंजीकरण / अनुकूलित स्वत: छवि पंजीकरण; "अनुकूलित स्वत: छवि पंजीकरण 3 डी" संवाद बॉक्स पॉप जाएगा।
      1. इनपुट विकल्प में, डिफ़ॉल्ट "Affine-12" से "स्वतंत्रता की डिग्री" बदलने के लिए "विशिष्ट rescale-9।" , "मोटे कोण बढ़ाना" में 10 (डिफ़ॉल्ट: 15 डिग्री), और 3 "ठीक में:" घुमाव, "" रोटेशन कोण नमूना रेंज "में 105 -105 में कुंजी (-30 से 30 डिग्री डिफ़ॉल्ट) में कोण बढ़ाना "(डिफ़ॉल्ट: 6 डिग्री)।
    7. ओके पर क्लिक करें; पहले मैट्रिक्स 'GrayG_To_GrayG1.mtx "उत्पन्न होता है और छवि फ़ोल्डर में सहेजा जाएगा। सभी छवि विंडो बंद करें और अगले कदम के लिए आगे बढ़ना; इस चरण में कम से कम 15 मिनट का समय लगेगा।
    8. चुनने के लिए मेनू से एच एफ और छवि के ढेर लोड: डिस्क (या Ctrl-एफ) /H.ids और F.ids से फ़ाइल / ओपन छवि (ए) के कदम 3.1.1 के रूप में।
    9. छवि पर क्लिक करके एच छवि का चयन करें और मेनू का चयन: उपयोगिता / रूपांतरण उपकरण / आरजीबी / ग्रे; "RGB-> ग्रे" संवाद बॉक्स पॉप जाएगा। ओके पर क्लिक करें; खिड़की "HGray" छवियों को दिखा देंगे। HGray रखें और एच चित्र को बंद कर दें।
    10. एफ छवि के लिए दोहराएँ कदम 3.1.9; "FGray" छवियों खिड़की पर दिखाई देगा। FGray रखें और एफ की छवि को बंद; केवल HGray और FGray खिड़की पर छोड़ दिया जाएगा।
    11. HGray छवि (उजागर) का चयन करें और मेनू के लिए जाना: एल्गोरिदम / परिवर्तन उपकरण / रूपांतरण। "परिणत / प्रतिदर्श चैनल छवि" संवाद बॉक्स पॉप जाएगा। "प्रतिदर्श चैनल" टैब पर क्लिक करें और "FGray" के लिए "HGray" के आकार के प्रतिदर्श चैनल बदल जाते हैं। अगले, का चयन करके "परिणत" टैब और लोड "GrayG_To_GrayG1.mtx" क्लिक "फ़ाइल से मैट्रिक्स पढ़ें।" ओके पर क्लिक करें; खिड़की HGray_transform छवि दिखाएगा। HGray छवि इतनी ही HGray_transform और FGray खिड़की पर छोड़ दिया जाता है बंद करें।
    12. चुनें "HGray_transform & #34; छवि (उजागर) और मेनू के लिए जाना: एल्गोरिदम / पंजीकरण / अनुकूलित स्वत: छवि पंजीकरण। "अनुकूलित स्वत: छवि पंजीकरण 3 डी" संवाद बॉक्स पॉप जाएगा। में "घुमाव," कुंजी में -5 "रोटेशन कोण नमूना सीमा" में से 5 (डिफ़ॉल्ट: -30 से 30 डिग्री): "ठीक है, और 1," मोटे कोण वेतन वृद्धि "में 3 (15 डिग्री डिफ़ॉल्ट) कोण बढ़ाना "(डिफ़ॉल्ट: 6 डिग्री)। ओके पर क्लिक करें।
      नोट: Affine मैट्रिक्स (HGray_transform_To_FGray.mtx) उत्पन्न होता है और छवि फ़ोल्डर और "HGray_Transform_register" छवि में बचाया खिड़की पर दिखाया जाएगा दिया जाएगा। इस चरण में कम से कम 40 मिनट का समय लगेगा।
    13. "HGray_transform" छवि बंद; केवल "HGray_Transform_register" और "FGray" खिड़की पर छोड़ दिया जाना चाहिए।
    14. "HGray_Transform_register" छवि (उजागर) का चयन करें और मेनू के लिए जाना: एल्गोरिदम / पंजीकरण / बी तख़्ता स्वत: पंजीकरण 2D / 3D। "बी तख़्ता स्वचालित Registratiपर 3 डी तीव्रता "संवाद बॉक्स पॉप जाएगा। चुनें" कम से कम वर्गों "लागत समारोह में (डिफ़ॉल्ट सहसंबंध अनुपात है)।
      1. "दो-पास प्रदर्शन करना पंजीकरण" पर क्लिक करें। दर्रा 1 अनुभाग में, में 2 में कुंजी में "ढाल वंश को छोटा कदम आकार (नमूना इकाइयों)" (डिफ़ॉल्ट 1 है) और कुंजी 10 में "अधिकतम पुनरावृत्तियों की संख्या:" (डिफ़ॉल्ट 10) है। दर्रा 2 खंड में, में 1 में कुंजी में "ढाल वंश को छोटा कदम आकार (नमूना इकाइयों)" (डिफ़ॉल्ट 0.5 है) और कुंजी 2 में "अधिकतम पुनरावृत्तियों की संख्या:" (डिफ़ॉल्ट 10) है।
        नोट: NLT मैट्रिक्स, "HGray_transform_register.nlt," छवि फ़ोल्डर में सहेजा जाएगा और "HGray_transform_register_registered" छवि खिड़की पर दिखाया जाएगा। इस चरण में कम से कम 5 मिनट का समय लगेगा।
    15. खिड़की पर सभी छवियों को बंद करें।
  2. छवि के संयोजन के लिए संदर्भ छवि पैदा होता है।
    नोट: यह कदम Gener के लिए होती हैसंयोजन के लिए एक पंजीकृत क्षैतिज छवि खा लिया।
    1. चुनने के लिए मेनू से लोड एच एफ और छवि के ढेर: डिस्क (या Ctrl-एफ) /H.ids और F.ids से फ़ाइल / ओपन छवि (एक); दो छवियों खिड़की पर दिखाई देगा।
    2. एच छवि (उजागर) का चयन करें और मेनू के लिए जाना: एल्गोरिदम / परिवर्तन उपकरण / रूपांतरण; "परिणत / प्रतिदर्श चैनल छवि" संवाद बॉक्स पॉप जाएगा। "प्रतिदर्श चैनल" टैब पर क्लिक करें और "एफ" के लिए "एच" का एक आकार से प्रतिदर्श चैनल बदल अगले, का चयन करके "परिणत" टैब और लोड "GrayG_To_GrayG1.mtx" क्लिक "फ़ाइल से मैट्रिक्स पढ़ें।" ओके पर क्लिक करें; H_transform छवि खिड़की पर दिखाई देगा। एच छवि के करीब है, लेकिन खिड़की में H_transform और एफ रहते हैं।
    3. "H_transform" छवि (उजागर) का चयन करें और मेनू के लिए जाना: एल्गोरिदम / परिवर्तन उपकरण / रूपांतरण; "परिणत / प्रतिदर्श चैनल छवि" संवाद बॉक्स पॉप जाएगा। "प्रतिदर्श चैनल" टैब पर क्लिक करें और "एफ। & #" H_transform "का एक आकार से प्रतिदर्श चैनल बदल34; अगले, का चयन करके "परिणत" टैब और लोड "HGray_transform_To_FGray.mtx" क्लिक "फ़ाइल से मैट्रिक्स पढ़ें।" ओके पर क्लिक करें; "H_transform_transform" छवि खिड़की पर दिखाई देगा। H_transform की छवि बंद; इस बिंदु पर, केवल H_transform_transform और एफ खिड़की पर छोड़ दिया जाएगा।
    4. "H_transform_transform" छवि (उजागर) का चयन करें और मेनू के लिए जाना: एल्गोरिदम / परिवर्तन उपकरण / nonlinear रूपांतरण; "Nonlinear बी तख़्ता परिवर्तन" संवाद बॉक्स पॉप जाएगा। अगले, लोड "HGray_transform_register.nlt" और ठीक क्लिक करें; "H_transform_transform_registered" छवि खिड़की पर दिखाई देगा। ICS फ़ाइल के रूप में छवि को बचाने। खिड़की पर सभी छवियों को बंद करें।
  3. छवि के ढेर का मेल
    नोट: यह कदम एक उच्च संकल्प ढेर में ओर्थोगोनल झुकाव (क्षैतिज और ललाट) में अधिग्रहण दो छवि के ढेर गठबंधन है।
    1. मेनू: प्लगइन्स / सामान्य / ड्रोसोफिला रेटिना रेगistrationl; "ड्रोसोफिला रेटिना पंजीकरण v2.9" संवाद बॉक्स पॉप जाएगा। कदम 3.2.4 से "H.ics" छवि एच, "H_transform_transform_registered" में अपलोड छवि एच-पंजीकृत परिवर्तन 1-हरे रंग में, "F.ics" छवि एफ में कदम 3.1.7 से, "GrayG_To_GrayG1.mtx" में (वैकल्पिक ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" परिवर्तन में परिवर्तन 2-Affine में 3.1.12 कदम है, और "HGray_transform_register.nlt" कदम 3.1.14 से 3-Nonlinear (वैकल्पिक)।
      1. Sqrt (तीव्रता-एच एक्स तीव्रता-एफ) और "एफ Rescale एच" में कोई rescale का चयन करें शेष मापदंडों के लिए डिफ़ॉल्ट विकल्प रखें। ओके पर क्लिक करें; इस कदम के बारे में 3 मिनट का समय लगेगा।
        नोट: प्रसंस्करण के बाद, छवियों के 3 सेट उत्पन्न हो जाएगा: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (अंतिम recombined छवि), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (एच, एफ के लिए ग्रीन चैनल, और अंतिम recombined छवि), और redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (एफओ लाल चैनलआर एच, एफ, और अंतिम recombined छवि); सभी आउटपुट फाइल 512 x 512 x 512 को बदल दिया जाएगा।
    2. ओपन छवि के दृश्य सॉफ्टवेयर के तहत "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids"। आईएमएस प्रारूप में छवि ढेर बचाने के लिए और फ़ाइल का नाम बदलने; इस recombined छवि फ़ाइल neurite ट्रेसिंग और पंजीकरण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

4. Neurite ट्रेसिंग और संदर्भ बिंदु असाइनमेंट

नोट: यह कदम neurites (4.1) का पता लगाने के लिए और पंजीकरण (4.2) के लिए संदर्भ अंक आवंटित करने के लिए छवि दृश्य सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रहा है।

  1. neurites अनुरेखण
    1. छवि के दृश्य सॉफ्टवेयर शुरू करो। recombined छवि फ़ाइल खोलें। मेनू: संपादित करें / दिखाएँ प्रदर्शन समायोजन और फोटोरिसेप्टर चैनल (लाल) बंद कर देते हैं।
    2. "पार" मोड में छवि कल्पना। "स्टीरियो" पर मुड़ें और 3 डी छवियों कल्पना करने के लिए अगर कंप्यूटर EQ है "ट्रैक्टर बफर" मोड का उपयोग करेंएक stereograph प्रणाली के साथ uipped।
    3. मेनू: पार / फिलामेंट्स नए तंतु जोड़ने के लिए। टैब "स्वत: निर्माण जाएं, मैन्युअल रूप से संपादित" पर क्लिक करें।
    4. "ड्रा" टैब पर क्लिक करें और चुनें "AutoDepth।"
    5. चुनें "सेटिंग्स," बेहतर दृश्य के लिए जाँच "रेखा," और कुंजी एक उपयुक्त पिक्सेल संख्या में (एक 4-पिक्सेल लाइन इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है)। "दिखाएँ dendrites," "शुरुआत बिंदु," और "शाखाओं में बंटी अंक" की जाँच करें। सेट 100% करने के लिए "गुणवत्ता प्रस्तुत करना"।
    6. "ड्रा" टैब का चयन करें और neurites अनुरेखण शुरू करते हैं। अक्षतंतु साथ शुरू और फिर डेन्ड्राइट (चित्रा 2 डी) के लिए कदम। अक्षतंतु और transmedulla न्यूरॉन्स की dendrites अंतर करने के लिए आसान कर रहे हैं।
      नोट: एक टीएम न्यूरॉन सेल शरीर से अपने अक्षतंतु फैली हुई है और उच्च दृश्य प्रसंस्करण केंद्र के लिए सभी तरह से परियोजनाओं, lobula। सिस्टम स्वचालित रूप से एक अक्षतंतु के रूप में पहली लंबी रेशा और के रूप में शेष लघु तंतु को परिभाषित करेगाडेन्ड्राइट। ट्रेसिंग के दौरान रेशा (अक्षतंतु) की शुरुआत में प्रारंभिक बिंदु रखें और सुनिश्चित करें कि पता लगाया neurites कनेक्ट हैं। शाखाओं में बंटी अंक और शुरुआत बात की जांच करना। डेन्ड्राइट जुड़े नहीं हैं, तो एक नई शुरुआत बिंदु गैर जुड़ा रेशा में परिभाषित किया जाएगा।
    7. अनुरेखण के बाद, के लिए वापस जाओ "सेटिंग" अ "शुरुआत बात" और "शाखाओं में बंटी प्वाइंट," और मेनू के लिए जाना: पार / निर्यात चयनित वस्तुओं ../। एक आविष्कारक फ़ाइल के रूप में सहेजें रेशा (* .iv)।
  2. संदर्भ अंक बताए
    1. "दिखाएँ प्रदर्शन समायोजन" का चयन करें और दोनों इमेजिंग चैनलों पर बारी। इस उदाहरण में, चैनल 1 फोटोरिसेप्टर धुंधला है और चैनल 2 Tm20 न्यूरॉन (GFP) है।
    2. मेनू: पार / मापन। "संपादित करें" टैब का चयन करें और जाँच "विशेष चैनल:" (फोटोरिसेप्टर चैनल [लाल] का चयन करें)।
    3. ऊपर परत के लिए संदर्भ बिंदु निरुपित। मेनू: / पार / मापन पोईएनटीएस नई माप अंक बनाने के लिए। एक शीर्ष परत के रूप में एम 1 परत की शुरुआत का प्रतीक। , उदर, पीछे-उदर, पीछे, पीछे-इक्वेटोरियल, और केंद्र (चित्रा 3F), इक्वेटोरियल पूर्वकाल इक्वेटोरियल, पूर्वकाल, पूर्वकाल उदर;: अंक का क्रम इस प्रकार है सबसे वृक्ष के समान प्रक्रियाओं के साथ जुड़े एक के रूप में केंद्र फोटोरिसेप्टर परिभाषित करते हैं।
    4. कदम 4.2.3 (चित्रा 3 जी) के रूप में R8 और R7 परतों निरुपित। तीन अलग-अलग माप अंक कदम 4.2.3 और 4.2.4 में बनाया जाना चाहिए।
    5. प्रत्येक स्तर के लिए अंक के निर्देशांक निर्यात करें। "विस्तृत" का चयन करें "विशिष्ट मूल्यों," और "स्थिति," सांख्यिकी "टैब पर क्लिक करें;" और "टैब प्रदर्शित करने के लिए फ़ाइल पर निर्यात सांख्यिकी" क्लिक करें। के रूप में "अल्पविराम से अलग मूल्यों" सहेजें (* .csv)।
    6. (कदम 4.2.3 से - 4.2.4) तीन सीएसवी फाइल को खोलने के लिए और एक नया सीएसवी फाइल में कॉपी करने और चिपकाने से 27 संदर्भ अंक के निर्देशांक गठबंधन (धE क्रम में ऊपर, R8, और R7) है। सामग्री / उपकरण तालिका देखें और उदाहरण फ़ाइल का स्वरूप का पालन करें।

5. कठोर शरीर और टीपीएस Nonlinear पंजीकरण

नोट: यह कदम संदर्भ स्तंभ सरणी के लिए neurite निशान (चतुर्थ स्वरूप में) रजिस्टर करने के लिए और MIPAV प्रोग्राम का उपयोग कर एक पंजीकृत एसडब्ल्यूसी फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए है। इस अनुभाग में निम्न फ़ाइलों की आवश्यकता है: 3.3 कदम से recombined छवि ढेर (.ids), संदर्भ बिंदु फ़ाइल (.csv) 4.2 कदम से, और neurite ट्रेस रेशा फ़ाइल (.iv) 4.1 कदम से।

  1. मेनू: प्लगइन्स / सामान्य / DrosophilaStandardColumnRegistration। "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" पॉप अप विंडो होगा।
  2. छवि फ़ाइलें (.ids), संदर्भ अंक फ़ाइल (.csv), और फिलामेंट फ़ाइल लोड (.iv)।
  3. परत प्रति 9 अंक का चयन करें।
  4. imaged न्यूरॉन (एल.वी. / आरडी या आर.वी. / एलडी) की स्थिति का चयन करें।
  5. चुनें "कठोर Registratiऔर टीपीएस "और" nonlinear और कठोर शरीर पंजीकरण, क्रमशः के लिए कठोर पंजीकरण "पर।
  6. निम्नलिखित आउटपुट फाइल उत्पन्न करने के लिए "एसडब्ल्यूसी फ़ाइल बनाएँ" जाँच करें: एसडब्ल्यूसी प्रारूप में एक पंजीकृत neurite ट्रेस फ़ाइल (देखें परिभाषा के लिए विशिष्ट सामग्री / उपकरण), एक पंजीकृत चतुर्थ फ़ाइल (.iv), मानकीकृत neurite (.txt) के निर्देशांक, बदल निर्देशांक (.txt), और संयुक्त छवि (.ids)।
  7. एसडब्ल्यूसी फ़ाइल का नाम बदलें। फ़ाइल का नाम (1.7 कदम) के अंत करने के लिए स्थान का संक्षिप्त नाम लागू करें। उदाहरण के लिए, Tm20 न्यूरॉन # 3 सही मज्जा के उदर आधे पर स्थित "Tm20_3_RV.swc" का उपयोग करें।

6. राइट-उदर विन्यास के लिए मानकीकरण

नोट: यह कदम neurite निशान कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग कर मानक आर.वी. (सही-उदर) विन्यास करने के लिए (एसडब्ल्यूसी प्रारूप में) बदल रहा है "RV_standardization.m।" इधर, स्क्रिप्ट मैट्रिक्स प्रयोगशाला भाषा में लिखा गया था।इनपुट एसडब्ल्यूसी फ़ाइलों के नाम निम्न प्रारूप में होना चाहिए: "NeuronName _ _ संख्या विन्यास .swc" (जैसे, Tm20_3_LV.swc)।

  1. "RV_standardization.m" स्क्रिप्ट खोलें।
  2. "उपयोगकर्ता इनपुट" खंड में निम्नलिखित मानकों को संपादित करें:
    1. में नंबर (जैसे, Tm2, Tm20, आदि) के बिना न्यूरॉन्स के नाम लिखें "neuron_names।"
      नोट: "file_end_in" में डिफ़ॉल्ट "। _ * एसडब्ल्यूसी," जो नाम युक्त साथ फाइल के लिए लग रहा है ( "*" अक्षर के किसी भी संख्या से मेल खाते में एक वाइल्डकार्ड है) "_ * एसडब्ल्यूसी।"। "Swc_file_end_out" के डिफ़ॉल्ट "_f.swc," जो मानकीकरण के बाद फ़ाइल नाम के अंत में "_f" जोड़ना होगा।
    2. जहां निर्देशिका एसडब्ल्यूसी फ़ाइलें "directory_in" में हैं निर्दिष्ट करें। जहां निर्देशिका मानकीकृत फ़ाइलें "directory_swcout" में जाना होगा निर्दिष्ट करें।
  3. स्क्रिप्ट चलाएँ।
  4. हेptional: उपयोग Vaa3D 14 एसडब्ल्यूसी फ़ाइलें कल्पना और रूपांतरण मान्य करने के लिए।

7. गणना वृक्ष के समान शाखाओं में बंटी और समाप्त आवृत्तियों

नोट: यह कदम कठोर शरीर एसडब्ल्यूसी फ़ाइलें पंजीकृत संभावना है कि एक वृक्ष के समान खंड समाप्त किए बिना एक दिया लंबाई तक पहुंच जाएगा के लिए कापलान-मायर estimators गणना करने के लिए उपयोग करता है। extractDendriticSegmentLengthDistribution और estimateDendriticSegmentLengthProbability: यह स्क्रिप्ट दो Dendritic_Tree_Toolbox कार्यों उपयोग करता है।

  1. "Branch_term_P.m" स्क्रिप्ट खोलें।
  2. "उपयोगकर्ता इनपुट" खंड में निम्नलिखित मानकों को संपादित करें:
    1. "PathToSWCFiles" में कठोर शरीर पंजीकृत एसडब्ल्यूसी फाइल करने के लिए पथ निर्दिष्ट (जैसे, / Rigid_Registered_swc /)। रास्ता है कि में ग्राफिक्स उत्पादन आयोजित करेगा निर्दिष्ट करें "pathToOutput।" न्यूरॉन्स या "neuron_names" में तंत्रिका प्रकार के नाम निर्दिष्ट करें (जैसे, Tm2, टीएम20, आदि)।
  3. स्क्रिप्ट चलाएँ; outputs के वृक्ष के समान शाखाओं में बंटी और समाप्ति के लिए कापलान-मायर अनुमान वक्र कर रहे हैं।
    नोट: वैकल्पिक: कापलान-मायर से स्थानीय संभावना है कि वृक्ष के समान खंड शाखा या समाप्त होगा estimators निकालने के लिए समारोह ढाले विधि को लागू करें।

8. प्लॉट वृक्ष के समान arbors की परत-विशिष्ट समाप्ति का वितरण

नोट: यह कदम एक बार ग्राफ के रूप में विभिन्न मज्जा परतों में वृक्ष के समान टर्मिनलों के वितरण के भूखंडों। यह एक न्यूरॉन, न्यूरॉन्स, या न्यूरॉन्स के समूहों के एक समूह के लिए लागू किया जा सकता है। स्क्रिप्ट Dendritic_Tree_Toolbox से extractDistributionAlongAxis समारोह का उपयोग करता है।

  1. "Layer_term.m" स्क्रिप्ट खोलें।
  2. "उपयोगकर्ता इनपुट" खंड में निम्नलिखित मानकों को संपादित करें:
    1. निर्देशिका है कि "pathToSWCFiles" में nonlinear पंजीकृत एसडब्ल्यूसी फ़ाइलें हैं निर्दिष्ट करें (जैसे, / Non_linear_Registered_swc /)। में ग्राफिक्स उत्पादन के लिए निर्देशिका निर्दिष्ट करें "pathToOutput।" "Neuron_names" (जैसे, Tm2, Tm20, आदि) में न्यूरॉन्स या तंत्रिका प्रकार के नाम निर्दिष्ट करें।
  3. ट्यूटोरियल स्क्रिप्ट चलाएँ। उत्पादन विशिष्ट मज्जा परतों में टर्मिनल नोड्स के अनुपात के एक हिस्टोग्राम है।

9. प्लॉट dendrites के Planar प्रक्षेपण दिशा

नोट: इस कदम के लिए एक ध्रुवीय साजिश के रूप में dendrites के तलीय प्रक्षेपण दिशाओं भूखंडों। स्क्रिप्ट Dendritic_Tree_Toolbox से extractAngularDistribution समारोह का उपयोग करता है।

  1. स्क्रिप्ट खोलें "Planar_proj.m।"
  2. "उपयोगकर्ता इनपुट" खंड में निम्नलिखित मानकों को संपादित करें।
    1. निर्देशिका "pathToSWCFiles" (जैसे, / Non_linear_Registered_swc /) में nonlinear पंजीकृत एसडब्ल्यूसी फ़ाइलें हैं कि निर्दिष्ट करें। में ग्राफिक उत्पादन के लिए निर्देशिका निर्दिष्ट करें "pathToOutput।" का नाम निर्दिष्ट करेंन्यूरॉन्स या "neuron_names" (जैसे, Tm2, Tm20, आदि) में तंत्रिका प्रकार के।
  3. स्क्रिप्ट चलाएँ; उत्पादन तलीय प्रक्षेपण दिशाओं में से एक ध्रुवीय साजिश है।

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Representative Results

दोहरे दृश्य इमेजिंग यहाँ प्रस्तुत की प्रक्रिया का उपयोग करना, एक मक्खी कम लेबल Tm20 न्यूरॉन्स युक्त मस्तिष्क दो orthogonal दिशाओं में imaged किया गया था। इमेजिंग के लिए पहले, मस्तिष्क की झिल्ली सीमित GFP और फोटोरिसेप्टर एक्सोन visualizing के लिए उपयुक्त प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सना हुआ था। इमेजिंग के लिए, मस्तिष्क पहले क्षैतिज अभिविन्यास में रखा गया था (चित्रा 2A, बी)। एक GFP लेबल Tm20 न्यूरॉन और आसपास के फोटोरिसेप्टर एक्सोन एक confocal खुर्दबीन (चित्रा 3 ए) का उपयोग imaged थे। मस्तिष्क तो फिर से गठबंधन किया था (चित्रा 2A, बी) और एक ही Tm20 न्यूरॉन ललाट अभिविन्यास (चित्रा 3 बी) में फिर से imaged किया गया था। इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, Tm20 न्यूरॉन के स्थान सही मज्जा neuropil (आर वी विन्यास) के उदर आधे से कम के रूप में पहचान की थी। इन दोनों की छवि छवि के ढेर deconvolution सॉफ्टवेयर और आरईसी का उपयोग कर रहे थे deconvolvedMIPAV (चित्रा 3 सी) का उपयोग कर एक पुनः संयोजक छवि ढेर (चित्रा -3 सी ') उत्पन्न करने के लिए ombined। पुनः संयोजक छवि ढेर अक्षीय विरूपण का एक महत्वपूर्ण कमी से पता चला सकते हैं या तो इनपुट ढेर (चित्रा 3 ए ',' बी ') की तुलना में।

छवि के दृश्य सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, अक्षतंतु और Tm20 न्यूरॉन के dendrites पता लगाया गया (चित्रा 3 डी) और एक आविष्कारक (iv) फ़ाइल के रूप में बचाया। फोटोरिसेप्टर Tm20 न्यूरॉन आसपास के एक्सोन पर 27 अंक संदर्भ सौंपा गया (आंकड़े 3E - एच) और एक अल्पविराम से अलग मूल्य (CSV) फ़ाइल के रूप में सहेजा। पता लगाया डेन्ड्राइट फ़ाइलें और संदर्भ बिंदु फ़ाइल बाद में एसडब्ल्यूसी फ़ाइल स्वरूप में कठोर शरीर पंजीकृत और गैर पंजीकृत रैखिक डेन्ड्राइट निशान उत्पन्न करने के लिए MIPAV में कस्टम प्लगइन करने के लिए लागू किया गया था। पंजीकृत वृक्ष के समान निशान "RV_standardization.m" स्क्रिप्ट का उपयोग कर मानक आर.वी. विन्यास में परिवर्तित किया गया। टीवह पंजीकृत है और मानकीकृत वृक्ष के समान ट्रेस फ़ाइलों पंजीकरण और मानकीकरण प्रक्रियाओं (चित्रा 3I) को मान्य करने के Vaa3D उपयोग करते हुए कल्पना कर रहे थे।

वृक्ष के समान विश्लेषण के लिए, वृक्ष के समान निशान पंजीकृत के लिए 15 Tm20 न्यूरॉन्स और 15 Tm2 न्यूरॉन्स एकत्र किए गए थे। "Branch_term_P.m" स्क्रिप्ट, शाखाओं में उपयोग करना है और इन न्यूरॉन्स की संभावना समाप्त कठोर शरीर पंजीकृत वृक्ष के समान निशान उपयोग विश्लेषण किया गया (चित्रा -4 ए, बी)। कापलान-मायर घटता बताते हैं कि दोनों न्यूरोनल प्रकार के समान शाखाओं में बंटी और समाप्त आवृत्तियों है। हालांकि, Tm2 अब खंडों के लिए एक कम समाप्त आवृत्ति है (> 4 माइक्रोन, चित्रा 4 ए) 12। परतों और स्तंभों के साथ जुड़े वृक्ष के समान गुणों का विश्लेषण के लिए, वृक्ष के समान गैर रेखीय पंजीकरण विधि द्वारा पंजीकृत निशान इस्तेमाल किया गया। कस्टम "Layer_term_P.m" स्क्रिप्ट का प्रयोग, वितरणTm2 और Tm20 न्यूरॉन्स के लिए परत-विशिष्ट वृक्ष के समान समाप्ति की रों गणना की गई है (चित्रा 4C, डी)। Tm2 और Tm20 dendrites की परत-विशिष्ट समाप्ति के विशिष्ट वितरण विभिन्न परतों में उनकी विशिष्ट synaptic सहयोगियों के साथ संगत कर रहे हैं: Tm2 डेन्ड्राइट, क्रमशः, M2 और M5 में L2 और L4 axonal टर्मिनलों से जानकारी प्राप्त Tm20 डेन्ड्राइट R8 और L3 से जानकारी प्राप्त करते हुए एम 3 में परत 8, 15, 16। "Planar_proj.m" स्क्रिप्ट का प्रयोग, Tm2 और Tm20 dendrites के तलीय प्रक्षेपण दिशाओं का विश्लेषण किया गया और एक दूसरे से अलग होना पाया गया: Tm2 डेन्ड्राइट परियोजना पीछे है जबकि Tm20 डेन्ड्राइट परियोजना पूर्व 12 (चित्रा 4E, एफ)।

आकृति 1
चित्रा 1. कार्यप्रवाह। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा दोहरे दृश्य इमेजिंग और ड्रोसोफिला मज्जा कॉलम ऐरे की समरूपता के लिए 2. नमूना तैयार करना। (ए, बी) नमूना दोहरे दृश्य इमेजिंग के लिए बढ़ते। (ए) को देखने के रूप में अगर एक coverslip के माध्यम से मस्तिष्क पर देख दिखाया गया है। (बी) नमूना बढ़ते के लिए योजनाबद्ध चित्र। इमेजिंग क्षितिज के लिएताल के ढेर, इम्युनो से सना हुआ मस्तिष्क उदर-अप की स्थिति में पहले मुहिम शुरू की है। पहली ढेर प्राप्त करने के बाद, ब्रेन इमेजिंग ललाट ढेर के लिए पूर्वकाल-अप की स्थिति में फिर से तैनात है। एक: पूर्वकाल; पी: पीछे; डी: पृष्ठीय; वी: उदर; आर: सही; एल: छोड़ दिया है। (सी - ई) समरूपता और मज्जा neuropil के संगठन, ललाट स्थिति में देखा। (सी) फोटोरिसेप्टर एक्सोन, 24B10 एंटीबॉडी (लाल) द्वारा लेबल, मज्जा neuropil के संगठन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया। छवि के रूप में यदि मस्तिष्क में बाहर से देख रहे हैं दिखाया गया है। चींटी: पूर्वकाल; स्थिति: पीछे; दोर: पृष्ठीय; वेंचर: उदर; EQ: भूमध्य रेखा। (डी) एक उच्च बढ़ाई R7 परत स्तर पर मज्जा neuropil के चार quadrants में (सी) के दृश्य। केंद्रीय R7 टर्मिनलों पीले डॉट्स द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। पूर्वकाल और इक्वेटोरियल R7s क्रमश: हरे और सियान डॉट्स के साथ लेबल रहे हैं। (ई) मज्जा सह की एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्वlumnar संगठन। ध्यान दें कि बाएँ और दाएँ मज्जा neuropils दर्पण छवियों हैं, और प्रत्येक neuropil के पृष्ठीय और उदर आधा भी छवियों, भूमध्य रेखा के द्वारा अलग दर्पण हैं। लाल डॉट्स इक्वेटोरियल R7s, जो पहली संदर्भ अंक हैं संकेत मिलता है। नंबर (1 - 9) और तीर संदर्भ बिंदु के कार्य के क्रम में संकेत मिलता है। स्केल पट्टी: सी में 15 माइक्रोन; डी में 5 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. छवि पुनर्संयोजन और संदर्भ बिंदु असाइनमेंट। (ए - सी) एक एकल Tm20 न्यूरॉन क्षैतिज (ए) में अधिग्रहण किया है और ललाट (बी) दिशाओं के लिए Confocal छवियों। छवियाँ अधिकतम तीव्रता के अनुमानों के रूप में दिखाया जाता है। फोटोरिसेप्टर एक्सोन और एक भी Tm20 neuron Mb24B10 एंटीबॉडी (लाल) और झिल्ली सीमित GFP (हरा), क्रमशः के साथ लेबल रहे हैं। (सी) recombined (ए, लाल) और (बी, सियान) की छवि। स्पष्टता के लिए, केवल फोटोरिसेप्टर दिखाए जाते हैं। (ए '- सी') दोहरे इमेजिंग अक्षीय संकल्प को बेहतर बनाता है। Recombined छवि (ए ') (और छवियों (बी) ललाट-दृश्य क्षैतिज दृश्य ए) की तुलना में एक बेहतर फैसला नहीं किया है।' कम पैनल: ऊपरी पैनल में बॉक्सिंग क्षेत्रों के उच्च बढ़ाई देखा गया। (डी) एक एकल Tm20 न्यूरॉन के अक्षतंतु (सफेद) अनुरेखण। शुरुआत बिंदु एक सियान डॉट के रूप में संकेत दिया गया था। (ई) 9 फोटोरिसेप्टर Tm20 न्यूरॉन्स आसपास के एक्सोन पर 27 संदर्भ अंक (सफेद डॉट्स) स्थलों के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। ऊपर, R8 और R7: संदर्भ अंक तीन परतों में हैं। प्रत्येक परत में (एफ) संदर्भ बिंदु असाइनमेंट। संदर्भ बिंदु काम fol इस प्रकार है lowing आदेश: भूमध्य रेखा (EQ), पूर्वकाल भूमध्य रेखा (एई), पूर्वकाल (ए), पूर्वकाल उदर (ए वी), उदर (वी), पीछे-उदर (पीवी), पीछे (पी), पीछे-भूमध्य रेखा (पीई) , और केंद्र (सी)। (G) मज्जा स्तंभ पंजीकरण के लिए इस्तेमाल करने वालों की एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एक Tm20 न्यूरॉन दिखाया गया है (हरा)। मज्जा परतों (M1-6) के रूप में संकेत कर रहे हैं। (एच) परत और एक एकल स्तंभ के लिए संदर्भ बिंदु के काम का एक उदाहरण है। तीन परतों प्रत्येक स्तंभ को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं: ऊपर, R8, और R7 (M5 / 6 परतों के जंक्शन)। (I) पंजीकृत और मानकीकृत neurite ट्रेस Vaa3D का उपयोग कल्पना। स्केल पट्टी: एसी के लिए एक में 5 माइक्रोन; 5 'A'-सी के लिए' ए में माइक्रोन; 5 माइक्रोन डी में, ई, एफ, जी और यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

410fig4.jpg "/>
चित्रा 4. वृक्ष के समान विश्लेषण से परिणाम के उदाहरण हैं। (ए, बी) कापलान-मायर वृक्ष के समान शाखाओं में बंटी (ए) और समाप्ति (बी) का अनुमान (शाफ़्ट) खंड की लंबाई (एक्स अक्ष) के संबंध में लघुगणक पैमाने में प्लॉट किए जाते थे। ठोस और बिंदीदार रेखा एसडीएस ± औसत निरूपित। Tm2 (लाल) और Tm20 (काला) 4 माइक्रोन से कम वर्गों के लिए समान शाखाओं में बंटी और समाप्त आवृत्तियों का हिस्सा है। (सी, डी) प्रत्येक मज्जा (एम) परत में टर्मिनल वृक्ष के समान नोड्स का मतलब अनुपात दिखा Histograms। एक दिया मज्जा परत में टर्मिनल नोड्स के अनुपात में पहली बार एक दिया प्रकार के हर न्यूरॉन के लिए गणना की जाती है और फिर उस प्रकार के सभी न्यूरॉन्स पर औसतन। ऊर्ध्वाधर सलाखों के अनुपात के मानक विचलन दिखा। ध्यान दें कि Tm2 न्यूरॉन्स (सी), टर्मिनल वृक्ष के समान नोड्स के वितरण के लिए, परत 5 में एक नाबालिग के चोटी के साथ, मज्जा परत 2 में केंद्रित है, जबकि टीएम 20 न्यूरॉन्स के लिए(डी), वितरण M2 और एम 3 परतों के आसपास केंद्रित है। (ई, एफ) dendrites के तलीय प्रक्षेपण दिशा के ध्रुवीय भूखंडों। एक कोणीय बिन (20 डिग्री) के भीतर अनुमान टर्मिनल नोड्स के अनुपात में पहली बार एक दिया प्रकार के हर न्यूरॉन के लिए गणना की और फिर उस प्रकार के सभी न्यूरॉन्स पर औसतन किया गया था। लाल और नीले रंग घटता मानक विचलन ± मतलब अनुपात दिखा। घटता पर कोनों कोणीय डिब्बे के midpoints हैं। काले घेरे उनके पक्ष को काला अंक ने संकेत दिया अनुपात मूल्यों को दिखाने के। ध्यान दें कि, औसत पर, न्यूरॉन्स के दो वर्गों के लगभग विपरीत दिशाओं में उन्मुख होते हैं। एक: पूर्वकाल; पी: पीछे; डी / वी: पृष्ठीय / उदर; EQ: भूमध्य रेखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ, हम कैसे छवि को और ड्रोसोफिला मज्जा न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान arbors विश्लेषण दिखा। प्रथम खंड, दोहरे दृश्य इमेजिंग, deconvolution और दो छवि के ढेर के संयोजन एक उच्च संकल्प छवि ढेर में वर्णन करता है। दूसरे खंड, डेन्ड्राइट ट्रेसिंग और पंजीकरण, ट्रेसिंग और संदर्भ स्तंभ सरणी के लिए मज्जा न्यूरॉन्स की dendrites के पंजीकरण का वर्णन है। तीसरे खंड, वृक्ष के समान विश्लेषण, कस्टम स्क्रिप्ट के उपयोग के वृक्ष के समान पैटर्न का विश्लेषण करने का वर्णन है। एक साथ इन प्रोटोकॉल परतों और स्तंभों के लिए सम्मान के साथ वृक्ष के समान पैटर्न पर जानकारी निकालने के लिए और वृक्ष के समान शाखाओं में बंटी और समाप्त आवृत्तियों निर्धारित करने के लिए एक पूरा कार्यप्रवाह प्रदान करते हैं।

दोहरे दृश्य इमेजिंग यहाँ प्रस्तुत विधि धारणात्मक बहु दृश्य इमेजिंग तकनीक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप के साथ लागू किया, एकत्र जिसमें दो या अधिक छवि के ढेर orthogonally एक उच्च अक्षीय resolutio प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं recombined के समान हैn 17, 18। हालांकि, यह तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण orthogonally दो उच्च एनए (संख्यात्मक एपर्चर) उद्देश्य लेंस है कि पतला डेन्ड्राइट इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं को लागू करने के लिए है। इस प्रकार, दोहरे देखें विधि लगातार दो चरणों में इमेजिंग ही मस्तिष्क नमूना और इमेजिंग के बीच नमूना फिर से orientating की आवश्यकता है। छवि के संयोजन में विफलताओं सबसे अधिक संभावना हेरफेर के दौरान इमेजिंग या नमूना squashing के दौरान नमूना आंदोलन की वजह से कर रहे हैं। इसके अलावा, जबकि छवि पुनर्संयोजन प्रक्रिया अक्षीय विरूपण समस्या और लगभग isotropic संकल्प में परिणाम mitigates, recombined चित्र अभी भी एक सीमा विवर्तन के अधीन हैं। हमारे दोहरे दृश्य इमेजिंग विधि केवल मानक confocal माइक्रोस्कोपी, जो व्यापक रूप से उपलब्ध है की जरूरत है। हालांकि, इस तरह STED या संरचना रोशनी के रूप में सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी, यदि उपलब्ध हो, दोहरे दृश्य इमेजिंग विधि यहां उपस्थित लिए एक बेहतरीन विकल्प होगा।

यहाँ प्रस्तुत डेन्ड्राइट ट्रेसिंग और पंजीकरण खंड वृक्ष के समान पेड़ों के निशान और संदर्भ स्तंभ सरणी के वृक्ष के समान पेड़ पंजीकृत करता है। इस प्रोटोकॉल में, वाणिज्यिक कार्यक्रम Imaris अर्द्ध स्वचालित डेन्ड्राइट ट्रेसिंग के लिए और संदर्भ बिंदु बताए के लिए प्रयोग किया जाता है। इसी तरह के कार्यों ऐसे NeuronJ 19, 20 और neurite अनुरेखक 21 के रूप में फ्रीवेयर विकल्प, के एक नंबर का उपयोग किया जा सकता है। हमारे पंजीकरण प्रोटोकॉल खुला स्रोत प्रोग्राम MIPAV संदर्भ स्तंभ सरणी के लिए डेन्ड्राइट निशान रजिस्टर करने में लागू एक कस्टम प्लगइन का उपयोग करता है। हमारे ज्ञान करने के लिए, इस पंजीकरण विधि ही तरीका है कि स्तंभों और परतों के लिए neurite निशान रजिस्टरों है। यह प्रक्रिया नियमित रूप से पंजीकरण के लिए स्थलों के रूप में फोटोरिसेप्टर एक्सोन व्यवस्था की उपयोग करता है। वृक्ष के समान गैर रेखीय पंजीकरण विधि द्वारा उत्पन्न निशान कॉलम और परतों से संबंधित वृक्ष के समान पैटर्न पर जानकारी निकालने के लिए आदर्श होते हैं। दूसरे परहाथ, कठोर शरीर पंजीकरण विधि वृक्ष के समान लंबाई या अन्य स्थानीय ज्यामितीय गुणों को बदलने के बिना neuropil के कार्डिनल कुल्हाड़ियों के लिए वृक्ष के समान निशान की कार्तीय कुल्हाड़ियों संरेखित करता है। इसलिए, कठोर शरीर पंजीकृत वृक्ष के समान निशान के लिए मानक morphometric विश्लेषण उपयुक्त हैं।

पारंपरिक वृक्ष के समान morphometric विश्लेषण, ऐसे एल उपाय के रूप में 22, आसपास के ऊतकों को संदर्भित बिना स्थानीय और वैश्विक वृक्ष के समान गुण की विशेषता है। हम पहले से पता चला है कई मज्जा न्यूरॉन्स वृक्ष के समान ज्यामितीय गुण का हिस्सा है और ऐसे मैट्रिक्स मज्जा न्यूरॉन प्रकार 12 को अलग करने के लिए अपर्याप्त हैं। इसके बजाय, प्रकार विशिष्ट वृक्ष के समान गुण सीधे परतों और स्तंभों जहां डेन्ड्राइट रहते हैं के साथ जुड़े रहे हैं। विशेष रूप से, मज्जा न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार के अलग-अलग दिशाओं में तलीय डेन्ड्राइट विशिष्ट मज्जा परतों में समाप्त करने के लिए परियोजना। इन दोनों के वृक्ष के समान गुण reflect मज्जा न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान समारोह परतों और स्तंभों में आयोजित retinotopically निर्देशित afferents प्राप्त करने के लिए। इन गुणों की निकासी की सुविधा के लिए, हम वृक्ष के समान पेड़ टूलबॉक्स कि वृक्ष के समान गुण की गणना के लिए कस्टम कार्यों की एक श्रृंखला शामिल है विकसित की है। वृक्ष के समान विश्लेषण अनुभाग में, हम कैसे इन कार्यों परत-विशिष्ट समाप्ति और dendrites के तलीय प्रक्षेपण दिशाओं के वितरण की गणना करने के लिए पंजीकृत वृक्ष के समान निशान करने के लिए लागू किया जा सकता दिखा।

वृक्ष के समान पेड़ टूलबॉक्स वृक्ष के समान विश्लेषण के लिए अन्य कस्टम कार्य जोड़ने के लिए एक मंच प्रदान करता है। वृक्ष के समान विश्लेषण अनुभाग में, हम भी स्पष्ट वृक्ष के समान सांत और शाखाओं में बंटी आवृत्तियों के लिए अनुमान प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन है। विशेष रूप से, इन कार्यों के लिए एक संभावना कापलान-मायर nonparametric आकलनकर्ता के आधार पर शाखाओं में बंटी और समाप्त आवृत्तियों की गणना है कि एक वृक्ष के समान खंड एक निश्चित lengt का विस्तार होगाशाखाओं में बंटी या 12 को समाप्त, 23 बिना एच। यह ध्यान रखें कि कठोर शरीर पंजीकृत (लेकिन nonlinearly पंजीकृत), क्योंकि गैर रेखीय पंजीकरण प्रक्रिया वृक्ष के समान खंड लंबाई बदल वृक्ष के समान निशान इस गणना के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए महत्वपूर्ण है। वृक्ष के समान शाखाओं में बंटी और समाप्ति आवृत्तियों केएम घटता के पहले व्युत्पन्न (ढलान) कर रहे हैं और समारोह ढाले विधि का उपयोग कर की गणना की जा सकती है। इसके अलावा, शाखाओं में बंटी और समाप्त आवृत्तियों की सटीक गणना अक्सर एक बड़ा डेटा सेट (> टीएम न्यूरॉन्स के लिए 10 न्यूरॉन्स) की आवश्यकता है, क्योंकि एकल न्यूरॉन्स वृक्ष के समान क्षेत्रों में से केवल एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या है। दिए गए उदाहरणों में, Tm2 और Tm20 समान शाखाओं में बंटी और समाप्त आवृत्तियों है, लेकिन Tm2 शाखाओं में बंटी आवृत्ति लंबाई शाखाओं में बंटी भर में समरूप नहीं है, Tm2 की एक विशेषता 12 dendrites।

हमारे प्रोटोकॉल जबकिड्रोसोफिला मज्जा न्यूरॉन्स के लिए तैयार कर रहे हैं, वे अन्य न्यूरॉन्स का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि इस तरह के अन्य ड्रोसोफिला ऑप्टिक पालियों और कशेरुकी रेटिना और कोर्टेक्स के रूप में परतों और स्तंभों में विस्तृत डेन्ड्राइट। इस तरह के रूपांतरों एक नया संदर्भ स्तंभ ब्याज 12 की प्रणाली, साथ ही MIPAV प्लगइन का मामूली संशोधनों के आधार पर सरणी के निर्माण की आवश्यकता होगी। हम खुला स्रोत सॉफ्टवेयर सहयोग और साझा करने को बढ़ावा देने के रूप में हमारे सभी कार्यक्रमों प्रदान करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था, यूनिस कैनेडी श्राइवर राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास (सी-एच एल के लिए अनुदान HD008913) के संस्थान, और सूचना प्रौद्योगिकी के लिए केंद्र (PGM, एनपी, ईएसएम और मिमी)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Huygens Professional Scientific Volume Imaging version 16.05 for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV version 7.3.0 for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila
RetinalRegistration.class		 freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard
ColumnRegistration.class		 freeware
Imaris Bitplane for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab Mathworks R2014b for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14 v1.14 for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox v1.0 For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name Company Catalog number Comments
Sample files
SWC file definition http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example  https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=
1471880596000&api=v2
Name Company Catalog number Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later 3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card Nvidia for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2 Nvidia http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2 http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name Company Catalog number Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody The Developmental Studies Hybridoma Bank 24B10
GFP Tag Antibody Thermofisher Scientific G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488 Thermofisher Scientific A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568 Thermofisher Scientific A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000
Mounting Clay  Fisher S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm Zeiss 474030-9000-000

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 121 डेन्ड्राइट आकृति परतों और स्तंभों रेटिना दोहरे दृश्य इमेजिंग,
कॉलम और परतों में वृक्ष के समान आकृति विज्ञान का विश्लेषण
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Ting, C. Y., McQueen, P. G., Pandya, … More

Ting, C. Y., McQueen, P. G., Pandya, N., McCreedy, E. S., McAuliffe, M., Lee, C. H. Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers. J. Vis. Exp. (121), e55410, doi:10.3791/55410 (2017).

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