Summary
ここでは、列およびレイヤーにショウジョウバエ延髄ニューロンの樹状突起のルーティングを分析する方法を示しています。ワークフローは、トレース基準列配列の樹状アーバーを登録すると、3次元空間内の樹枝状構造を分析するための画像品質と計算ツールを改善するためのデュアルビューイメージング技術を含みます。
Abstract
このようなフライ光学ローブと脊椎動物皮質などの中枢神経系の多くの地域では、シナプス回路が発達した動物での開発と情報の処理中に脳の配線を容易にするための層と列に編成されています。特定の層における型特異的なパターンで精巧な樹状突起シナプス後ニューロンは、適切なシナプス前終末とシナプスします。フライ髄質の神経網は10層と約750列で構成されます。各カラムは、型特異的様式で求心性のいくつかの7種類の軸索の端末と一致延髄のニューロンの38種類以上の樹状突起によって神経支配されています。このレポートでは、画像に手順を詳しく説明し、延髄の神経細胞の樹状突起を分析します。ワークフローは、次の3つのセクションを含む：（I）デュアルビュー撮像部は、樹状突起の高解像度3D画像に直交する方向で集め2の共焦点画像スタックを結合します。 （ⅱ）デンドライトはトレースと登録部は、樹状をトレース3Dでアーバーと参照列配列に樹枝状のトレースを登録します。 （iii）は、樹状分析部は、樹状アーバーの層特異的な終端と平面投影方向を含む列と層に対する樹状パターンを解析して、樹状分岐および終了周波数の推定値を導出します。プロトコルは、マトリックス研究所言語でオープンソースのMIPAV（医療画像処理、分析、および可視化）プラットフォームとカスタムツールボックス上に構築されたカスタムプラグインを利用しています。一緒に、これらのプロトコルは、層および列にショウジョウバエ髄質ニューロンの樹状経路を分析する細胞型を同定するため、および変異体の欠陥を決定するために、完全なワークフローを提供します。
Introduction
開発中に複雑で、ニューロン精巧な樹状突起が、そのシナプス前パートナーとシナプスを形成するための分岐パターンをステレオタイプ。樹状分岐パターンは、ニューロンのアイデンティティと機能と相関します。樹状分岐の複雑さとフィールドのサイズは、入力された番号を管理しながら、樹状アーバーの場所は、彼らが受け取るシナプス前入力のタイプを決定します。このように、樹枝状の形態学的特性は、シナプス接続と神経計算のための重要な決定因子です。フライ視神経ローブと脊椎動物の網膜のような複雑な脳の多くの地域では、シナプス回路は、情報処理1、2を容易にするために、列およびレイヤーで構成されています。このようなコラムと層組織では、明確なモダリティプロジェクトの軸索のシナプス前ニューロンは特定の層（いわゆる層特異的標的）で終了すると整然とした2次元アレイを形成する（いわゆるのcalleD地形図）、シナプス後ニューロンは、正しい種類と数のシナプス前入力を受信するために特定の層に適切なサイズの樹状突起を拡張しながら。層と列への標的軸索は、よく3、4を研究してきたが、はるかに少ないが、樹状突起は、特定の層にルーティングし、正しいシナプス前パートナー5とのシナプス結合を形成するために、受容野を適切に展開する大きさであるかについては知られています。イメージングおよび層と列への標的定量化する樹状の難しさは、柱状の積層脳構造における樹状開発の研究を妨げてきました。
ショウジョウバエ髄質ニューロンは、列と層における樹状ルーティングおよび回路アセンブリを研究するための理想的なモデルです。フライ髄質の神経網は、3D 10層の格子と約750列として編成されています。各列は、pを含む求心性神経のセットによって神経支配されますその軸索端子層特異的なファッション6で地形を形成L5、 - hotoreceptors R7 / R8およびラミナニューロンL1。延髄のニューロンの約38種類が、これらの求心性神経7からの入力を受信するための特定の層で、適切なフィールドサイズを持つすべての髄質列と精巧な樹状突起に存在しています。髄質におけるシナプス回路は、電子顕微鏡レベルで再構築されてきました。従って、シナプスパートナーシップウェル7,8を設置しています。さらに、髄質ニューロンの様々な種類を標識するための遺伝的ツールは、9、10、11入手可能です。 transmedullaの3種類（Tm）は、ニューロン（TM2、TM9及びTM20）を調べることによって、我々は以前に二つの細胞型特異的な樹枝状の属性を特定した：（ⅰ）のTmニューロンは、平面PROJ（前方または後方方向のいずれかに樹状突起を投影しますection方向）、細胞の種類に応じて、及び（ii）の延髄の神経細胞の樹状突起は、細胞型特異的な様式（層特異的な終端）12で特定の髄質層で終端します。層および列合図へのTmの応答を破壊する突然変異が、これらの属性の異なる側面に影響を与えながら、平面投影方向と層固有の終端は、Tmのニューロンのこの3種類を区別するのに十分です。
ここでは、列および層（ 図1）におけるショウジョウバエ延髄ニューロンの樹状突起パターン形成を調べるための完全なワークフローを提示します。まず、2つの共焦点画像を結合するカスタマイズされたソフトウェアを使用してデュアルビューイメージング法は、高品質の等方性の画像を生成するためにスタックを示しています。この方法は、超解像顕微鏡法に頼らずに、樹状分岐の信頼性トレースを可能にする高品質の画像を生成するためにのみ、従来の共焦点顕微鏡検査を必要とするようなsのSTED（誘導放出枯渇）または構造的照明。第二に、我々は、樹状アーバをトレースするための、参照列配列に生じた神経突起のトレースを登録するための方法を提示します。第三に、我々は、樹状分岐および終了周波数の推定値を導出するための樹状突起の平面投影方向と層固有の終了に関する情報、ならびにを抽出するための計算方法を示しています。一緒に、これらの方法は、3D、樹状突起の形態に基づいて細胞種の分類における樹状パターンの特徴付け、および変異体における潜在的な欠陥の同定を可能にします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：デュアルビュー撮影（セクション1から3）、樹状トレースおよび登録（セクション4から6）、及び樹状解析（セクション7から9）（ 図1）：プロトコルは3つのセクションが含まれています。コードとサンプルファイルは、 マテリアル/機器の表に記載されています。
1.デュアル画像取得
注：この手順は、二つの直交（水平および前頭）方位への関心のニューロンの2つの画像スタックを取得するように設計されています。
- 以前に12を説明したように、膜GFPマーカー（mCD8GFP）でまばらに標識された延髄ニューロン（〜10細胞/脳の葉）を含有するハエの脳を準備します。前述のように、（髄質ニューロンの樹状突起のために）、ウサギ抗GFPで脳を染色し、マウスmAb24B10（感光体軸索のために）、一次抗体および蛍光二次抗体（アレクサ488抗ウサギおよびAlexa 568抗マウス抗体）13。 1×PBS中70％グリセロール中で脳をクリアします。
- 水平方向（ 図2A、B）で脳をマウントするには、スライドの中央に退色防止封入剤の20μLのドロップにグリセロール-クリアフライ脳を転送します。
- 実装時の脳試料を粉砕からカバースリップを防止するために、カバースリップの4隅に粘土の小さなパッチを添付してください。
注：クレイパッチは、サンプルを粉砕からカバースリップを防止するためにクッション性を提供します。各粘土パッチは、直径約1ミリメートルであるべきです。 - 解剖顕微鏡下で、腹アップ位置に脳を配置し、脳を保護するために上にカバースリップを配置。脳試料（ 図2A）の向きを識別するためのランドマークとして、脳の凸状の背面を使用します。
- 共焦点顕微鏡を用いて最初の画像スタック（水平ビュー）を取得します。このような63X 1.3 NAグリセロールまたは油浸オブジェとして（高NAの対物レンズを使用してくださいctiveレンズ）と2.5倍デジタルズーム（画素サイズは、画素当たり0.105ミクロンであり、平均数が2）です。 0.2ミクロンのステップサイズと髄質の神経網をカバーする180以上の光学切片（512×512ピクセル）を取得。
- ステップ1.3で説明したように脳を再マウント - 1.4が、前方のアップ位置（正面図）で脳を揃えます。
- ステップ1.5で説明したように、同一のニューロンの第二の画像スタック（正面図）を取得します。
注：視葉中の標識の多数のニューロンが存在する場合、同じニューロンを見つけることは困難な場合があります。両方向から同一のニューロンを同定するために、両方のビューから低倍率の画像スタックが必要とされるかもしれない（例えば、低解像度の画像スタックを取得するために0.7のズーム、および0.45μmのステップサイズを使用します）。 ×512 512より画像が大きい場合は、画像は、画像合成の前に512×512にトリミングされるべきである、と広い視野を画像化しながら、画素サイズがピクセルあたり0.105ミクロンでおく必要があります。信号の損失深部組織の潜在的な問題です。信号が弱い場合には、画像脳の腹側半分。スキャン中に退色削減するために、できるだけ低いレーザーパワーを使用しています。画像スタックを取得する前に、露出オーバーをチェックする範囲インジケータを使用してください。可能な場合は、GaAsPの検出器を搭載した共焦点顕微鏡を使用しています。 - 髄質の神経網（左/右[R / L]と背/腹[D / V]）に対する関心のニューロンの位置を特定し、記録します。サンプルは画像スタックを調べることによって、画像の取得中に移動しているか確認してください。
注：サンプル動画は、多くの場合、不適切な取り付けに起因しています。サンプルの移動が発生すると、画像スタックは、登録のために使用することができず、廃棄されるべきです。サンプルを再マウントし、同じニューロンからの画像スタックを取得します。
2.画像のデコンボリューション
注：デコンボリューションステップは、ぼかしによって分解される取得された画像を復元する画像復元ソフトを使用していますそして、ノイズ。このステップは任意であるが、それは著しく画質を向上させることができます。セクション3で画像レジストレーションとの組み合わせのための復元画像スタックを使用することをお勧めします。
- 対話モードでデコンボリューションプログラムを起動します。メインウィンドウの[ファイル/開く（またはCtrl-O）：メニューを選択することによって、（LSMまたは特定の微視的な形式の）画像スタックをロードします。
- 画像操作画面を開くには、オプス：ロードされた画像スタックを選択し、メニューを選択する場合にクリックします。デフォルトクラシック最尤推定（CMLE）アルゴリズムを使用してください。
- 画像操作ウィンドウで、「パラメータ」タブをクリックします。 （。 など 、 例えば、液浸油を）（。 例えば、油、グリセリン、 など ）培地を埋め込む、レンズ液浸媒体のための適切なパラメータを入力して、開口数（NA;ここでは、1.3を使用しました）。彼らは正確に撮影条件を反映することを確認するために、残りのパラメータをチェックしてください。フィンには、「すべての検証の設定」タブをクリックしますパラメータ設定をアリゼ。
- 画像操作ウィンドウで、「操作」タブをクリックします。出力先を割り当てます（ 例えば、C）。 「チャネルあたりの信号/ノイズ」に適切な数字を入力します（デフォルト設定は「20 20 20 20」であるが、例えば、「12 12 12 12」するには、良い出発点です）。残りのパラメータのデフォルト設定を使用します。
- 画像スタックをデコンボリューション開始するには、「コマンドの実行」タブをクリックします。このプロセスは、コンピュータに応じて、完了するまでに数十分程度かかる可能性があります。
- メイン画面で、復元画像スタックをクリックして選択します。メニューを選択してください：ICSの画像ファイルフォーマット（の.icsと.ids）に復元画像を保存するように保存します。
注：各画像スタックは、2つのファイルを持っている：ICSファイルは、ヘッダ情報が含まれているとIDファイルは、生の画像情報が含まれています。- イメージング向きに応じて画像スタックのファイルの名前を変更（ 例えば、水平視野画像の名前タックH.idsとH.icsと正面ビュー画像スタックF.idsとF.ics）。
3.デュアルビュー画像合成
注：このステップは、2つの画像がMIPAVソフトウェアを使用して高解像度の3D画像を生成するためにスタック組み合わせ。
- 画像合成のための行列を生成します。
- MIPAVプログラムを起動します。メニューを選択することで、HとF画像スタックをロードします。ディスク（またはCtrl-f）の/H.idsとF.idsからファイル/開く画像（A）;ウィンドウには、2つの画像を表示します。
- 画像をクリックするとH画像を選択し、メニューを選択します。ユーティリティ/変換ツール/ RGB /グレイズ。ウィンドウはGrayG、GrayB、およびGrayR画像が表示されます。
- ウィンドウのみにGrayGを保ち、GrayRとGrayBを閉じます。
- 画像をクリックして、Fの画像を選択し、メニューを選択します。ユーティリティ/変換ツール/ RGB /グレイズ。ウィンドウはGrayG1、GrayB1、およびGrayR1画像が表示されます。
- GrayR1とGrayB1閉じるとウィンドウ上だけGrayG1を保ちます。このステップのみのGrでayGとGrayG1は、ウィンドウ上にあります。
- GrayG（ハイライト）を選択し、メニューを選択します：アルゴリズム/登録/最適化された画像の自動登録を。 「最適化された自動画像レジストレーション3D」ダイアログボックスがポップアップ表示されます。
- 入力オプションでは、「具体的な再スケール-9。「デフォルト」アフィン-12」から「自由度」を変更、および「ファインで3：「粗い角度増分」（15度デフォルト）で、10：「ローテーション」、「回転角度サンプリング範囲」（-30〜30度デフォルト）〜105 -105内のキーで角度増分」（デフォルト：6度）。
- [OK]をクリックします。最初のマトリックス」GrayG_To_GrayG1.mtx」が生成し、画像フォルダに保存されます。すべての画像ウィンドウを閉じて、次のステップに進みます。このステップは、少なくとも15分かかります。
- ディスク（またはCtrl-f）の/H.idsとF.idsからファイル/開く画像（A）を、ステップ3.1.1のように：メニューを選択することで、HとF画像スタックをロードします。
- 画像をクリックするとH画像を選択し、メニューを選択します。ユーティリティ/変換ツール/ RGB /グレー。 「RGB->グレー」ダイアログボックスがポップアップ表示されます。 [OK]をクリックします。ウィンドウには、「HGray」の画像が表示されます。 HGrayを保ち、H画像を閉じます。
- Fの画像を繰り返しステップ3.1.9。 「FGray」の画像がウィンドウに表示されます。 FGrayを保ち、Fの画像を閉じます。 HGrayとFGrayだけは、ウィンドウ上に残されます。
- HGray画像（ハイライト）を選択し、メニューに行く：アルゴリズム/変換ツール/変換します。 「/リサンプル画像を変換」ダイアログボックスがポップアップ表示されます。 「リサンプル」タブをクリックし、「FGray "に" HGray」のサイズにリサンプルを変更します。次に、「トランスフォーム」タブをクリックして選択して「GrayG_To_GrayG1.mtx」を読み込む」ファイルから読み取り行列を。」 [OK]をクリックします。ウィンドウはHGray_transformの画像が表示されます。 HGray_transformとFGrayこれだけがウィンドウに残っているHGrayイメージを閉じます。
- 「HGray_transform＆＃を選択34;画像（ハイライト）し、メニューに行く：アルゴリズム/登録/最適化された画像の自動登録。 「最適化された自動画像レジストレーション3D」ダイアログボックスがポップアップ表示されます。 、および「ファイン1：「粗い角度増分」（15度デフォルト）で、3：「ローテーション」キーで-5「回転角度サンプリング範囲」（-30〜30度デフォルト）〜5で角度増分」（デフォルト：6度）。 [OK]をクリックします。
注：アフィン行列（HGray_transform_To_FGray.mtx）が生成され、画面に表示される画像フォルダと「HGray_Transform_register」画像に保存されます。このステップは、少なくとも40分かかります。 - 「HGray_transform「画像を閉じます。 「HGray_Transform_register "と" FGray」だけは、ウィンドウ上に残されるべきです。
- 「HGray_Transform_register」画像（ハイライト）を選択し、メニューに行く：アルゴリズム/登録/ Bスプライン自動登録2D / 3D。 「Bスプライン自動Registratiオン3D強度」ダイアログボックスがポップアップ表示されます。選択」（デフォルトは相関比で）コスト関数に最小二乗」。
- 「2パス登録を実行」をクリックします。 （デフォルトは10）：「勾配法ステップサイズ（サンプル単位）の最小化」へのパス1項、2のキーではとキー10の「最大反復回数」にします（デフォルトは1です）。パス2節では、への1キーに2（デフォルトは0.5である）と、キー「勾配法は、ステップサイズ（サンプル単位）の最小化」「最大反復回数：「（デフォルトは10です）。
注：NLT行列、「HGray_transform_register.nltは、「画像フォルダに保存され、「HGray_transform_register_registered「画像ウィンドウに表示されます。このステップは、少なくとも5分かかります。
- 「2パス登録を実行」をクリックします。 （デフォルトは10）：「勾配法ステップサイズ（サンプル単位）の最小化」へのパス1項、2のキーではとキー10の「最大反復回数」にします（デフォルトは1です）。パス2節では、への1キーに2（デフォルトは0.5である）と、キー「勾配法は、ステップサイズ（サンプル単位）の最小化」「最大反復回数：「（デフォルトは10です）。
- ウィンドウ上のすべての画像を閉じます。
- 画像合成のための基準画像を生成します。
注：この手順は、GENERことを意味しています組み合わせのために登録された水平方向の画像を食べました。- メニューを選択して、負荷のHとFの画像スタック：ディスク（またはCtrl-f）の/H.idsとF.idsからファイル/開く画像（A）; 2つの画像がウィンドウに表示されます。
- H画像（ハイライト）を選択し、メニューに行く：アルゴリズム/変換ツール/変換。 「/リサンプル画像を変換」ダイアログボックスがポップアップ表示されます。 「リサンプル」タブをクリックし、「F.」に "H"のサイズからリサンプルを変更次に、選択して「変換」タブとロード」GrayG_To_GrayG1.mtx」をクリックして "ファイルから行列を読んでください。」 [OK]をクリックします。 H_transformイメージがウィンドウに表示されます。 H画像を閉じますが、ウィンドウにH_transformとFを保ちます。
- 「H_transform」画像（ハイライト）を選択し、メニューに行く：アルゴリズム/変換ツール/変換。 「/リサンプル画像を変換」ダイアログボックスがポップアップ表示されます。 「リサンプル」タブをクリックし、「Fに "H_transform」のサイズからリサンプルを変更します。＆＃34;次に、選択して「変換」タブとロード」HGray_transform_To_FGray.mtx」をクリックして "ファイルから行列を読んでください。」 [OK]をクリックします。 「H_transform_transform「画像ウィンドウに表示されます。 H_transformイメージを閉じます。この時点で、H_transform_transformとFだけがウィンドウ上に残されます。
- 「H_transform_transform」画像（ハイライト）を選択し、メニューに行く：アルゴリズム/変換ツールは/非線形の変換; 「非線形B-スプライン変換」ダイアログボックスがポップアップ表示されます。次に、負荷 "HGray_transform_register.nlt」、[OK]をクリックします。 「H_transform_transform_registered「画像ウィンドウに表示されます。 ICSファイルとして画像を保存します。ウィンドウ上のすべての画像を閉じます。
- 画像スタックを組み合わせ
注：この手順は、1つの高解像度スタックに直交する向き（水平および前頭）で取得した2つの画像スタックを組み合わせることです。- メニューに移動します：プラグイン/汎用/ショウジョウバエ網膜のRegistrationl; 「ショウジョウバエ網膜登録V2.9」ダイアログボックスがポップアップ表示されます。 （画像のH-登録済の変換1-グリーンにステップ3.1.7から、「GrayG_To_GrayG1.mtx「画像Fで、「F.ics」のステップ3.2.4から任意の画像H、「H_transform_transform_registered」の「H.ics」をアップロード変換2-アフィン、および「HGray_transform_register.nlt」のステップ3.1.12から）、「HGray_transform_To_FGray.mtx「トランスフォーメーション3-非線形（オプション）のステップ3.1.14から。
- SQRT（強度-Hのx強度-F）と「Fに再スケールH "ではありません再スケールを選択残りのパラメータのデフォルトオプションを保持します。 [OK]をクリックします。このステップは、約3分かかります。
注：処理の後、画像の3セットが生成されます。combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids（最終再合成画像）、greenChannelsImage-Gxreg-GY-Gcomp.IDS（H、Fのための緑チャネル、および最終的な再合成画像）、およびredChannelsImage- Rxreg-RY-Rcomp.ids（FO赤チャンネルR H、F、および最終的な再結合画像）。すべての出力ファイルは512×512×512にリサイズされます。
- SQRT（強度-Hのx強度-F）と「Fに再スケールH "ではありません再スケールを選択残りのパラメータのデフォルトオプションを保持します。 [OK]をクリックします。このステップは、約3分かかります。
- 画像可視化ソフトウェアの下の「combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids」を開きます。 IMS形式の画像スタックを保存し、ファイルの名前を変更。この再結合画像ファイルは、神経突起のトレースと登録のために使用されます。
- メニューに移動します：プラグイン/汎用/ショウジョウバエ網膜のRegistrationl; 「ショウジョウバエ網膜登録V2.9」ダイアログボックスがポップアップ表示されます。 （画像のH-登録済の変換1-グリーンにステップ3.1.7から、「GrayG_To_GrayG1.mtx「画像Fで、「F.ics」のステップ3.2.4から任意の画像H、「H_transform_transform_registered」の「H.ics」をアップロード変換2-アフィン、および「HGray_transform_register.nlt」のステップ3.1.12から）、「HGray_transform_To_FGray.mtx「トランスフォーメーション3-非線形（オプション）のステップ3.1.14から。
4.神経突起のトレースと基準点の割り当て
注：この手順は、神経突起（4.1）をトレースすると、画像の可視化ソフトウェアを使用して登録（4.2）のための基準点を割り当てることです。
- 神経突起をトレース
- 画像可視化ソフトウェアを起動します。再結合した画像ファイルを開きます。メニューに移動します。編集/表示する表示調整と感光体チャネル（赤）をオフにします。
- 「サーパス」モードで画像を可視化します。 「ステレオ」をオンにして、コンピュータが等量であれば3D映像を可視化するために「クワッドバッファ」モードを使用します立体システムとuipped。
- メニューに移動します。新しいフィラメントを追加する/フィラメントを突破。 「手動で編集し、自動作成をスキップ」タブをクリックします。
- 「描画」タブをクリックし、選択 "AutoDepthを。」
- 「設定を、「選択」、ライン "をチェックし、より良い視覚化のための適切な画素数（4ピクセルの線は、このプロトコルで使用されている）でキー。 「ショー樹状突起」、「始まりのポイント」、および「分岐点」を確認してください。 100％に「品質をレンダリング」に設定します。
- 「描画」タブを選択し、神経突起をトレースを開始。軸索で起動し、樹状突起（ 図2D）に移動します。 transmedullaニューロンの軸索と樹状突起は区別するのは簡単です。
注：Tmのニューロンは、細胞体からの軸索を拡張し、より高い視覚処理センター、lobulaのすべての方法を投影します。システムが自動的に軸索と残りの短いフィラメントなどのように、第1の長いフィラメントを定義します樹状突起。トレース中にフィラメント（軸索）の先頭に出発点を維持し、トレースされた神経突起が接続されていることを確認してください。分岐点と最初の点を調べます。デンドライトが接続されていない場合は、新たな開始点は、非接続フィラメントに定義されます。 - トレースした後に戻って「設定」、「始まりのポイント」と「分岐点」をオフにして、メニューに行く：/エクスポート選択したオブジェクトを../突破。 Inventorファイル（* .iv）としてフィラメントを保存します。
- 基準点の割り当て
- 「ショーの表示調整」を選択し、両方のイメージングチャネルをオンにします。この例では、チャンネル1は、感光体染色およびチャネル2はTM20ニューロン（GFP）です。
- メニューに移動します：/測定を突破。 「編集」タブを選択し、「特定のチャンネル：「チェック（感光体チャネル[赤]を選択します）。
- トップ層のための基準点を割り当てます。メニューに移動します：/サーパス/測定ポイ新しい測定ポイントを作成するためのNTS。最上層にM1層の始まりをマークします。次のようにポイントの順序は次のとおりです。赤道、前方赤道、前部、前部、腹、腹側、後部-腹側、後部、後部赤道、中央（ 図3F）。ほとんどの樹状突起に関連する一つとして、中心感光体を定義します。
- ステップ4.2.3（ 図3G）のようにR8およびR7層を割り当てます。 3つの個々の測定点は、ステップ4.2.3および4.2.4で作成する必要があります。
- 各層の点の座標をエクスポートします。 ";"統計」タブをクリックし、「詳細」、「固有の値、 "および"ポジションを選択および「ファイルにタブ表示にエクスポート統計情報」をクリックします。 （* .csv）に「カンマ区切り」として保存します。
- （ステップ4.2.3から - 4.2.4）3 CSVファイルを開き、コピーして貼り付けて、新しいCSVファイルに27の基準点の座標を組み合わせて（目電子順序がトップ、R8、及びR7）です。 材料/機器の表を参照してください例ファイルのフォーマットに従ってください。
5.リジッドボディとTPS非線形登録
注：この手順は、参照列配列に（静脈形式）神経突起のトレースを登録するとMIPAVプログラムを使用して登録されたSWCファイルを生成することです。このセクションでは、次のファイルが必要です。ステップ3.3からの再合成画像スタック（.ids）、ステップ4.1からステップ4.2から基準点ファイル形式（.csv）、および神経突起トレースフィラメントファイル（.ivを）。
- メニューに移動します：プラグイン/汎用/ DrosophilaStandardColumnRegistration。 「DrosophilaStandardColumnRegistrationのv6.6.1」ウィンドウがポップアップ表示されます。
- 画像ファイル（.ids）、基準点ファイル形式（.csv）、およびフィラメントのファイルをロードします（.iv）。
- 層ごとに9ポイントを選択します。
- 撮像されたニューロン（LV / RDまたはRV / LD）の位置を選択します。
- リジッド」を選択しRegistrati上とTPS「と」は、それぞれ、非線形と剛体の登録に剛体位置合わせ」、。
- 、SWC形式で登録された神経突起のトレース・ファイルを（定義するための具体的な材料/機器を参照）、登録IVファイル（.iv）、標準化された神経突起ファイル（.txt）の座標：チェック次の出力ファイルを生成するために、「SWCファイルを作成します」変換された座標ファイル（.txt）、および合成画像（.ids）。
- SWCファイルの名前を変更します。ファイル名（ステップ1.7）の端に位置の略語を適用します。例えば、右延髄の腹側半分に位置TM20ニューロン＃3は、「Tm20_3_RV.swc "を使用します。
右腹側の設定6.標準化
注：このステップでは、カスタムスクリプトを使用して標準RV（右腹側）の構成に（SWC形式で）神経突起のトレースを変換することです」RV_standardization.m。」ここでは、スクリプトは、マトリックス実験室の言語で書かれています。ザ「NeuronName _ 番号 _ 設定 .swc」（ 例えば、Tm20_3_LV.swc）：入力SWCファイルの名前は次の形式にする必要があります。
- 「RV_standardization.m "スクリプトを開きます。
- 「ユーザー入力」セクションに次のパラメータを編集します。
- （ 例えば、Tm2が、TM20、 等 ） を番号付けすることなく、ニューロンの名前を入力し、「neuron_names。」
注：「file_end_in」のデフォルトは "。_ * SWCは"（ "*"任意の数の文字に一致するワイルドカードである）を含む名前のファイルを探します」。_ * SWC」です。 「swc_file_end_out」のデフォルトは標準化後のファイル名の末尾に "_f"を追加します」_f.swc、 "です。 - SWCファイルは「directory_in」にあるディレクトリを指定します。標準化されたファイルは「directory_swcout」に行くディレクトリを指定します。
- （ 例えば、Tm2が、TM20、 等 ） を番号付けすることなく、ニューロンの名前を入力し、「neuron_names。」
- スクリプトを実行します。
- Optional：使用Vaa3D 14は、SWCファイルを視覚化し、変換を検証します。
7.計算樹状分岐と終了周波数
注：この手順は、樹状セグメントが終了せずに所定の長さに到達する確率のためのカプランマイヤー推定量を計算するために剛体登録SWCファイルを使用しています。 extractDendriticSegmentLengthDistributionとestimateDendriticSegmentLengthProbability：このスクリプトは、2 Dendritic_Tree_Toolbox機能を使用しています。
- 「Branch_term_P.m "スクリプトを開きます。
- 「ユーザー入力」セクションに次のパラメータを編集します。
- 「pathToSWCFiles」に剛体登録SWCファイルへのパスを指定します（ 例えば、/ Rigid_Registered_swc /）。グラフィックス出力を保持するパスを指定し、「pathToOutputを。」ニューロンまたは「neuron_names」における神経タイプの名前を指定します（ 例えば、Tm2を、Tmの20、 など ）。
- スクリプトを実行します。出力は、樹状分岐や終了のカプランマイヤー推定曲線です。
注：オプション：カプラン・マイヤーは、樹状突起セグメントは分岐または終了することローカル確率を推定器から抽出する機能フィッティング法を適用します。
8.プロット樹状アーバーのレイヤ固有の終了の配布
注：この手順は、棒グラフなど、異なる髄質層における樹状端子の分布をプロットします。これは、1つの神経細胞、ニューロン、またはニューロンのグループのグループに適用することができます。スクリプトはDendritic_Tree_ToolboxからextractDistributionAlongAxis機能を使用しています。
- 「Layer_term.m "スクリプトを開きます。
- 「ユーザー入力」セクションに次のパラメータを編集します。
- 「pathToSWCFiles」に非線形登録SWCファイルを含むディレクトリを指定します（ 例えば、/ Non_linear_Registered_swc /）。グラフィックス出力用のディレクトリを指定する」pathToOutput。」 「neuron_names」（ 例えば、Tm2が、TM20 など ）のニューロンまたは神経種類の名前を指定します。
- チュートリアルスクリプトを実行します。出力は、特定の髄質層内のターミナルノードの割合のヒストグラムです。
9.プロット樹状突起の平面投影方向
注：この手順は極座標として樹状突起の平面投影方向をプロットします。スクリプトはDendritic_Tree_ToolboxからextractAngularDistribution機能を使用しています。
- 「Planar_proj.mを。 "スクリプトを開きます。
- 「ユーザー入力」セクションで、次のパラメータを編集します。
- 「pathToSWCFiles」（ 例えば、/ Non_linear_Registered_swc /）に非線形に登録されたSWCファイルを含むディレクトリを指定します。でグラフィック出力のためのディレクトリを指定し、「pathToOutput。」の名前を指定します。「neuron_names」（ 例えば、Tm2が、TM20 など ）のニューロンまたは神経種類。
- スクリプトを実行します。出力は、平面投影方向の極座標プロットです。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ここで提示デュアルビュー画像化手順を使用して、まばらに標識TM20ニューロンを含むハエの脳は、二つの直交する方向で画像化しました。撮影の前に、脳は、膜繋留GFPと感光体軸索を可視化するための適切な一次および二次抗体で染色しました。イメージングのために、脳の第1の水平方向に取り付けた（ 図2A、B）。 GFP標識TM20ニューロンと周囲の光受容体の軸索は、共焦点顕微鏡（ 図3A）を使用して画像化しました。脳はその後、（ 図2A、B）再整列させたと同じTM20ニューロンは前頭向き（ 図3B）に再画像化しました。イメージングプロセスの間に、TM20ニューロンの位置は右延髄神経網（RV構成）の腹側半分であると同定されました。これら2つの画像スタックは、画像復元ソフトウェアとRECを使用してデコンボリューションしました。組換え画像スタック（ 図3C '）を生成するMIPAV（ 図3C）を使用してombined。組換え画像スタックは、入力スタック（ 図3A '、B'）のいずれかと比較して軸方向歪みの有意な減少を示しました。
画像可視化ソフトウェアを使用して、TM20ニューロンの軸索と樹状突起が（ 図3D）トレースおよび発明（iv）のファイルとして保存されました。 TM20ニューロンを囲む感光体軸索上の27の基準点が割り当てられていた（ 図3E - H）とカンマ区切り値（CSV）ファイルとして保存します。トレースデンドライトファイル基準点ファイルは、その後、登録された剛体とSWCファイル形式で非直線的に登録された樹状突起トレースを生成するMIPAVのカスタムプラグインに適用しました。登録された樹状トレースは「RV_standardization.m」スクリプトを使用して、標準RV構成に変換しました。 T彼は登録され、標準化樹状トレースファイルは、登録と標準化プロセス（ 図3I）を検証するためにVaa3Dを用いて可視化しました。
樹状分析のために、15 TM20ニューロンおよび15 Tm2をニューロンのための登録された樹枝状のトレースを収集しました。 「Branch_term_P.m」スクリプトを使用して、分岐およびこれらのニューロンの確率を終了すると、剛体登録樹状トレース（ 図4A、B）を用いて分析しました。カプラン・マイヤー曲線は、両方の神経細胞型は類似の分岐及び終了周波数を有することを示しています。しかし、TM2が（4ミクロン>; 図4A）より長いセグメントの下側終端周波数を有する12。層および列に関連した樹枝状の性質を分析するために、非線形登録方法で登録樹状トレースを使用しました。カスタム「Layer_term_P.m "スクリプトを使用して、配布Tm2をとTM20のニューロンのための層特異的な樹状終端のsが（ 図4C、D）を算出しました。 Tm2をとTM20樹状突起の層特異的な終端の明確な分布は異なる層での特定のシナプスのパートナーと一致している：TM20の樹状突起は、R8およびL3からの入力を受信しながら、Tm2を樹枝状結晶は、それぞれ、M2およびM5にL2とL4軸索の端末からの入力を受け取りますM3で層8、15、16。 Tm2をデンドライトプロジェクトは前方TM20デンドライトプロジェクトながら後方12（ 図4E、F）：Tm2とし、TM20樹状突起の平面投影方向を分析し、互いに別個であることが判明した、「Planar_proj.m "スクリプトを使用します。
ワークフロー1.図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
デュアルビューのイメージングとショウジョウバエ髄質列配列の対称性図2.サンプル調製。 （A、B）サンプルデュアルビュー画像化のために実装。 （A）図は、カバーガラスを介して脳を見ているかのように示されています。 （B）のサンプル実装するための模式図。イメージング地平線のためのタルスタックは、免疫染色した脳は腹アップ位置に最初に搭載されています。最初のスタックを取得した後、脳は前頭葉スタックを撮像するための前方アップ位置に再配置されています。 ：前方; P：後部; D：背側; V：腹。 R：右; L：左。 （C - E）髄質の神経網の対称性と組織、正面位置から見ました。 24B10抗体（赤）で標識された（C）感光体の軸索は、髄質の神経網の組織を視覚化するために使用しました。画像は、脳の中に外から見ているかのように示されています。アリ：前方;順位：後部;ドール：背側;ヴェン：腹。式：赤道。 （D）R7層レベルでの髄質の神経網の4つの象限において（C）の高倍率図。中央R7端子は黄色の点でマークされています。前方および赤道R7sは、それぞれ、緑とシアンのドットで標識されています。 （E）髄質の共同の略図lumnar組織。左右の髄質neuropilsが鏡像であることに注意してください、と各神経網の背側と腹側の半分にも鏡像され、赤道で区切られています。赤い点は、第一の基準点である赤道R7sを示しています。数字（1から9）、矢印は基準点の割り当ての順序を示します。スケールバー：Cで15ミクロン; Dの5ミクロンこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.画像の組換えと基準点の割り当て。 （A - C）横一（A）で取得したTM20ニューロンおよび前頭（B）方向のための共焦点画像。画像は最大強度投影として示されています。感光体の軸索とシングルTM20のneuronそれぞれ、Mb24B10抗体（赤）及び膜係留GFP（緑色）で標識されます。 （赤A）と（B、シアン）の（C）再合成画像。明確にするために、唯一の光受容体が示されています。 （A ' - C'）デュアルイメージングは、軸方向の解像度を向上させます。再合成画像（A '）は （と正面ビュー（B'）画像の水平ビューA）のものよりも優れた分解能を有します」。下のパネル：上パネルで箱入りの領域の高倍率ビュー。 （D）単一TM20ニューロンの軸索（白）をトレース。開始点は、シアンドットとして示しました。 （E）TM20ニューロンを取り囲む9感光軸索の27の基準点（白丸）をランドマークとして使用されています。トップ、R8およびR7：基準点は、3つの層です。各層の（F）基準点の割り当て。基準点の割り当てはFOLに従います牛の鳴き声順：赤道（式）、前方 - 赤道（AE）、前腹前方（A）、（AV）、腹側（V）、後部腹（PV）、事後（P）、後部-赤道（PE） 、中央（C）。 （G）登録に使用髄質列配列の模式図。 TM20ニューロンは（緑）に示されています。示されるように、髄質層（M1-6）です。 （H）単列の層と基準点の割り当ての例を示します。トップ、R8及びR7（M5 / 6層の接合）：三層は、各列を定義するために使用されます。 （I）Aが登録され、標準化された神経突起のトレースがVaa3Dを用いて可視化。スケールバー：AC用では5μm; 「A'-Cのための「Aが5μm; D、E、F、およびGで5ミクロンこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
410fig4.jpg "/>
樹状分析の結果からの4例を図。 （A、B）樹状分岐（A）と終了（B）のカプラン-マイヤー推定値（y軸）は、セグメント長（x軸）に対して対数スケールでプロットしました。実線と点線は、SDS±平均値を表します。 TM2（赤）とTM20（黒）は少ないが4μm以上のセグメントに対して同様の分岐と終端周波数を共有しています。各髄質（M）層で終端樹状ノードの平均比率を示す（C、D）ヒストグラム。与えられた髄質層中のターミナルノードの割合は、最初の指定されたタイプのすべてのニューロンについて計算し、そのタイプのすべてのニューロンにわたって平均化されます。垂直バーは、割合の標準偏差を示します。一方、Tmの20のニューロンのために、層5中のマイナーピークで、Tm2がニューロン（C）のために、ターミナルの樹状ノードの分布が髄質層2に集中していることに注意してください（D）、分布はM2とM3層を中心とします。 （E、F）、樹状突起の平面投影方向の極座標プロット。角度ビン（20°）内に投影されたターミナルノードの割合は、最初の指定されたタイプのすべてのニューロンについて計算し、その型のすべてのニューロンを渡って平均しました。赤と青の曲線は平均±標準偏差の割合を示しています。曲線上のコーナーは、角ビンの中点です。黒丸は彼らの側に黒の数字で示される割合値を示しています。平均して、ニューロンの2つのクラスがほぼ反対方向に配向している、ということに注意してください。 ：前方; P：後部; D / V：背/腹。式：赤道。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは、画像にどのように表示し、 ショウジョウバエの延髄ニューロンの樹状アーバーを分析します。最初のセクション、デュアルビュー画像は、高解像度の画像をスタックに2つの画像スタックのデコンボリューションおよび組み合わせが記載されています。第二セクション、樹状突起のトレースと登録は、参照列配列に延髄の神経細胞の樹状突起のトレースと登録について説明します。第3セクション、樹状分析は、樹状パターンを分析するためのカスタムスクリプトの使用を記載しています。一緒に、これらのプロトコルは、層および列に対する樹状パターンに関する情報を抽出し、樹状分岐及び終了周波数を決定するために、完全なワークフローを提供します。
ここで提示デュアルビューイメージング法は直交収集二つ以上の画像スタックが高い軸resolutioを達成するために再結合される光シート顕微鏡で実現多視点画像化技術、概念的に類似していますnは17、18。しかし、直交細長いデンドライトを撮像するために必要とされる2つの高NA（開口数）の対物レンズを実現することは技術的に困難です。このように、デュアルビュー方法は、2つの連続する段階で、同じ脳試料を画像化し、イメージングの間にサンプルを再配向が必要です。画像合成における障害は、最も可能性の高い操作中にイメージングまたはサンプル押しつぶし中にサンプルの動きによって引き起こされます。画像再結合プロセスが軸歪みの問題と近等方性の解像度で結果を軽減しながら、さらに、再結合画像は、回折限界の下にまだあります。我々のデュアルビューイメージング法が広く利用可能である、唯一の標準的な共焦点顕微鏡を必要とします。しかし、このようなSTEDや構造照明などの超解像顕微鏡は、利用可能な場合、ここでは現在のデュアルビュー撮影方法に優れた代替となります。
ザここで提示樹状突起のトレースと登録セクションでは、樹状突起をトレースし、参照列配列に樹状突起を登録します。このプロトコルでは、商用プログラムIMARISは、半自動化された樹状突起のトレースのための基準点を割り当てるために使用されます。同様のタスクは、NeuronJ 19,20および神経トレーサー21とフリーウェアの選択肢の数を使用して実施することができます。当社の登録プロトコルは、参照列配列に樹状突起のトレースを登録するためのオープンソースプログラムMIPAVに実装されたカスタムプラグインを使用しています。我々の知る限り、この登録方法は、列、層に神経突起のトレースを登録する唯一の方法です。この手順では、登録のための目印として規則的に配置され、感光体の軸索を使用しています。非線形登録方法によって生成された樹状トレースは、列およびレイヤーに関連した樹状パターンの情報を抽出するための理想的です。もう一方の手は、剛体の登録方法は、樹状長または他のローカル幾何学的特性を変化させることなく、神経網の枢機卿軸に、樹状トレースのデカルト軸を整列します。そのため、剛体登録樹状トレースは、標準的な形態学的分析に適しています。
、周囲の組織を参照せずに、ローカルおよびグローバルな樹枝状の性質を特徴づけるようなL-対策22として、伝統的な樹枝状形態計測分析、。我々は以前、多くの延髄神経細胞が樹状幾何学的特性を共有することが示されていると、このようなメトリックは、延髄のニューロンのタイプ12を区別するのに不十分であること。代わりに、タイプ固有の樹状突起の属性は直接樹状突起が存在する層と列に関連付けられています。具体的には、延髄のニューロンの異なるタイプの特定の髄質層で終端する異なる平面方向の樹状突起を投影します。これらの二つの樹状突起は、r属性層と列に編成さretinotopically向かう求心性神経を受信するために延髄の神経細胞の樹状突起の機能をeflect。これらのプロパティの抽出を容易にするために、我々は、樹状特性を計算するためのカスタム関数のシリーズが含まれている樹状突起のツールボックスを開発しました。樹状分析部では、これらの機能は、樹状突起の層特異的な終端と平面投影方向の分布を計算するために、登録された樹状トレースに適用する方法を示しています。
樹状突起のツールボックスは、樹状分析のために他のカスタム関数を追加するためのプラットフォームを提供します。樹状分析部では、我々はまた、明らか樹状終端と分岐の周波数の推定値を導出するためのプロセスを説明します。具体的には、これらの機能は、樹状セグメントは、特定のlengtに延長する確率のためのカプラン・マイヤーノンパラメトリック推定量に基づいて分岐し、終了周波数を計算します分岐もしくは12、23を終了することなく、H。剛体の登録（ただし、非線形登録）非線形登録処理は、樹状セグメントの長さを変化させるための樹状トレースは、この計算のために使用されるべきであることに留意することが重要です。樹状分岐および終了周波数はKM曲線の一次導関数（勾配）であり、関数フィッティング法を用いて計算することができます。単一ニューロンは樹状突起セグメントの比較的数が少ないので、さらに、分岐および終了周波数の正確な計算は、多くの場合、かなり大きなデータセット（> Tmのニューロンのための10ニューロン）が必要です。提供された例では、Tm2をとTM20が同様の分岐と終端周波数を持っていますが、Tm2を分岐頻度は長分岐渡って均質ではない、Tm2との特徴は、12の樹状突起します。
私たちのプロトコル一方、ショウジョウバエ髄質ニューロンのために設計され、それらは、他のショウジョウバエ光学ローブと脊椎動物の網膜および皮質などの層と列に精巧な樹状突起、他の神経細胞を分析するために適合させることができます。このような適応は、対象12のシステムに基づいて、新たな基準列配列、ならびにMIPAVプラグインのマイナーな修正を構築する必要になります。私たちは、コラボレーションと共有を促進するためのオープンソースソフトウェアとしてすべての私たちのプログラムを提供しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所の学内研究プログラムによってサポートされていた、子どもの健康と人間開発（C.-HLへの助成金HD008913）のユニス・ケネディ・シュライバー国立研究所、情報技術のためのセンター（PGM、NP、ESM 、およびMM）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | version 16.05 | for image deconvolution (https://svi.nl). commercial software |
| MIPAV | version 7.3.0 | for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware | |
| MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class |
freeware | ||
| MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class |
freeware | ||
| Imaris | Bitplane | for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software | |
| Vaa3D | for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware | ||
| Matlab | Mathworks | R2014b | for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software |
| Matlab toolbox: TREES1.14 | v1.14 | for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware | |
| Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox | v1.0 | For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Sample files | |||
| SWC file definition | http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html | ||
| The codes and sample files for image combination and registration | https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration | ||
| Reference point example | https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2 |
||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Computer system | |||
| MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later | 3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal) | ||
| Optional: Quadro4000 (or above) graphic card | Nvidia | for stereographic visualization of dendrites. | |
| Optional: NVIDIA 3D vision2 | Nvidia | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html | |
| Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2 | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html | ||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Reagents for imaging | |||
| 24B10 antibody | The Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
| GFP Tag Antibody | Thermofisher Scientific | G10362 | |
| Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermofisher Scientific | A11034 | |
| Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568 | Thermofisher Scientific | A21124 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mounting Clay | Fisher | S04179 | |
| 70% glycerol in 1x PBS | |||
| Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9000-000 |
References
- Kaas, J. H. Topographic maps are fundamental to sensory processing. Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).
- Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).
- Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. CSH Perspect Biol. 2 (3), a001743 (2010).
- Clandinin, T. R., Feldheim, D. A. Making a visual map: mechanisms and molecules. Curr Opin Neurobiol. 19 (2), 174-180 (2009).
- Luo, J., McQueen, P. G., Shi, B., Lee, C. H., Ting, C. Y. Wiring dendrites in layers and columns. J Neurogenet. 30 (2), 69-79 (2016).
- Meinertzhagen, I. A., Hanson, T. E. The development of the optic lobe. In The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 1363-1491 (1993).
- Takemura, S. Y., et al. A visual motion detection circuit suggested by Drosophila connectomics. Nature. 500 (7461), 175-181 (2013).
- Takemura, S. Y., et al. Synaptic circuits and their variations within different columns in the visual system of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), 13711-13716 (2015).
- Gao, S., et al. The neural substrate of spectral preference in Drosophila. Neuron. 60 (2), 328-342 (2008).
- Karuppudurai, T., et al. A hard-wired glutamatergic circuit pools and relays UV signals to mediate spectral preference in Drosophila. Neuron. 81 (3), 603-615 (2014).
- Strother, J. A., Nern, A., Reiser, M. B. Direct observation of ON and OFF pathways in the Drosophila visual system. Curr Biol. 24 (9), 976-983 (2014).
- Ting, C. Y., et al. Photoreceptor-derived activin promotes dendritic termination and restricts the receptive fields of first-order interneurons in Drosophila. Neuron. 81 (4), 830-846 (2014).
- Ting, C. Y., et al. Tiling of R7 axons in the Drosophila visual system is mediated both by transduction of an activin signal to the nucleus and by mutual repulsion. Neuron. 56 (5), 793-806 (2007).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
- Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: the input terminals to the medulla. J Comp Neurol. 509 (5), 493-513 (2008).
- Takemura, S. Y., et al. Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway. Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Wu, Y., et al. Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy. Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).
- Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. Automated analysis of NeuronJ tracing data. Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
- Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. JASA. 53, 457-481 (1958).
