Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Analysere Dendritic Morfologi i kolonner og Layers

Published: March 23, 2017 doi: 10.3791/55410
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 1
1Section on Neuronal Connectivity, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (NIH), 2Mathematical and Statistical Computing Laboratory, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH), 3Biomedical Imaging Research Services Section, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH)

Summary

Her viser vi hvordan du analyserer dendrittiske ruting av Drosophila medulla nevroner i kolonner og lag. Arbeidsflyten inkluderer en dual-view avbildningsteknikk for å forbedre bildekvaliteten og dataverktøy for sporing, registrering dendrittiske arbors til referansen kolonnen matrise og for å analysere de dendrittiske strukturer i 3D-rom.

Abstract

I mange deler av det sentrale nervesystemet, som for eksempel fly optiske fliker og virveldyr cortex, er synaptiske kretser organisert i lag og kolonner for å legge til rette for hjernen kabler i utvikling og informasjonsbehandling i utviklede dyr. Postsynaptiske nevroner forseggjort dendritter i typespesifikke mønstre i spesifikke lag til Synapse med passende presynaptiske terminaler. Flua medulla neuropil består av 10 lag og ca 750 kolonner; hver kolonne er innervated av dendritter av over 38 typer av medulla nevroner, som samsvarer med aksonal terminalene på noen 7 typer afferente i en typespesifikk måte. Denne rapporten gir detaljer om prosedyrer for å image og analysere dendritter av medulla nerveceller. Arbeidsflyten omfatter tre deler: (i) dual-view bildeseksjonen kombinerer to confocal bildestakker samlet på ortogonale retninger i en høyoppløselig 3D-bilde av dendritter; (Ii) dendrite sporing og registrering § spor dendrittiskearbors i 3D og registrerer dendrittiske spor til referansekolonnen matrise; (Iii) det dendritiske analyse delen analyserer dendrittiske mønstre i forhold til kolonner og lag, inkludert laget spesifikk terminering og plane projeksjon retning av dendrittiske arbors, og utleder estimater av dendritiske forgreninger og terminerings frekvenser. Protokollene bruke tilpassede plugins bygget på åpen kildekode MIPAV (Medical Imaging Processing, analyse og visualisering) plattform og tilpassede verktøykasser i matrisen laboratoriet språk. Sammen utgjør disse protokollene tilveiebringe en komplett arbeidsflyt for å analysere den dendrittiske ruting av Drosophila medulla nevroner i lag og kolonner, for å identifisere celletyper, og for å bestemme defekter i mutanter.

Introduction

Under utviklingen til nevroner forseggjort dendritter i komplekse, men stereotype forgrenede mønstre danner synapser med sine presynaptiske partnere. Dendrittiske forgrening mønstre korrelerer med nevronale identitet og funksjoner. Lokaliseringen av dendrittiske arbors bestemme hvilken type presynaptiske innganger de mottar, mens dendrittiske forgrening kompleksitet og feltstørrelser styrer inngangsnummer. Dermed dendrittiske morfologiske egenskaper er kritiske determinants for synaptiske tilkobling og nevronale beregning. I mange deler av komplekse hjerner, slik som fly optiske fliker og virveldyr hinnen, blir synaptiske kretser organisert i kolonner og lag for å lette informasjonsbehandling 1, 2. I en slik kolonne og lag organisasjon, til presynaptiske nerveceller i en distinkt modalitet prosjekt aksoner avsluttes ved et bestemt lag (såkalt lag spesifikk målretting) og til å danne en ordnet to-dimensjonal matrise (så-called topografisk kart), mens postsynaptiske nevroner utvide dendritter av passende størrelse i bestemte lag for å motta presynaptiske inngangene de riktige typene og tall. Mens axonal målretting til lag og kolonner har blitt godt undersøkt 3, 4, er langt mindre kjent om hvordan dendritter blir rutet til bestemte lag og utvide riktig størrelse mottakelig felt for dannelse av synaptiske forbindelser med de riktige presynaptiske partnerne 5. Vanskeligheten med bildebehandling og kvantifisere dendrittiske målretting til lag og kolonner har hindret studiet av dendrittiske utvikling i søyle og laminerte strukturer i hjernen.

Drosophila medulla nevroner er en ideell modell for å studere dendrittiske ruting og kretsstevne i kolonner og lag. Flua medulla neuropil er organisert som en 3D-gitter av 10 lag og ca 750 kolonner. Hver kolonne er innervert av et sett av afferente, inkludert photoreceptors R7 / R8 og lamina nevroner L1 - L5, hvis aksonal terminaler danne topografiske kart i et lag-spesifikk mote 6. Om 38 typer medulla nevroner er til stede i hver medulla kolonne og forseggjorte dendritter i bestemte lag og med passende felt størrelser å motta innspill fra disse afferente 7. De synaptiske kretser i medulla har blitt rekonstruert ved elektronmikroskopi nivå; således er de synaptiske partnerskap vel etablert 7, 8. Videre genetiske verktøy for merking av forskjellige typer av medulla nevroner er tilgjengelige 9, 10, 11. Ved å undersøke tre typer transmedulla (TM) neuroner (Tm2, TM9 og TM20), har vi tidligere har identifisert to celletypespesifikke dendritiske egenskaper: (i) Tm neuroner rager dendritter i enten den fremre eller bakre retning (plan projEL retning), avhengig av celletyper og (ii) dendritter av medulla nevroner ender i bestemte medulla lag i en celletype-spesifikk måte (layer-spesifikk terminering) 12. Planar projeksjon retning og lag-spesifikke terminering er tilstrekkelig til å skille disse tre typer Tm nevroner, mens mutasjoner som forstyrrer Tm svar til lag og kolonne signaler påvirke ulike aspekter av disse attributtene.

Her presenterer vi en komplett arbeidsflyt for å undersøke den dendrittiske fordelingen av Drosophila medulla nevroner i kolonner og lag (figur 1). Først viser vi en dual-view avbildningsmetode som bruker tilpasset programvare for å kombinere to confocal bilde stabler å generere høy kvalitet isotrope bilder. Denne metoden krever bare vanlig konfokalmikroskopi å generere bilder av høy kvalitet som gir mulighet for pålitelig sporing av dendrittiske grener, uten å ty til super-oppløsning mikroskopi, sliks STED (stimulert utslipp Nedbryting) eller strukturelle belysning. For det andre, presenterer vi en metode for å spore dendrittiske lysthus og for å registrere de resulterende neurite spor til en referanse kolonne matrise. For det tredje viser vi de beregningsmessige metoder for å ekstrahere informasjon om den plane projeksjon retning og lag-spesifikk opphør av dendritter, samt for å utlede estimater for dendritiske forgreninger og terminerings frekvenser. Sammen utgjør disse metodene gir mulighet for karakterisering av dendrittiske mønstre i 3D, klassifisering av celletyper basert på dendrittiske morfologi, og identifisering av mulige defekter i mutanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Protokollen inneholder tre deler: dual-view bildebehandling (punkt 1 - 3), dendrittiske sporing og registrering (§§ 4 - 6), og dendrittiske analyse (§§ 7 - 9) (figur 1). Kodene og eksempelfiler er gitt i tabell for material / utstyr.

1. Dual-image Acquisition

MERK: Dette trinnet er laget for å skaffe to bilde stabler av nervecellen av interesse i to ortogonale (horisontale og frontale) orientering.

  1. Forbered fly hjerner som inneholder tynt merkede medulla nevroner (~ 10 celler / hjerne lobe) med en membran GFP markør (mCD8GFP), som tidligere beskrevet 12. Flekk hjernen med kanin-anti-GFP (for marg neuron dendritter) og mus mAb24B10 (for fotoreseptoren aksoner), primære antistoffer, og fluoriserende sekundære antistoffer (Alexa 488 anti-kanin og Alexa 568 anti-mus-antistoffer), som beskrevet tidligere13. Tømme hjernen i 70% glyserol i 1x PBS.
  2. For å montere hjernen i horisontal retning (figur 2A, B), overføre glyserol-ryddet fly hjernen til en 20 mL dråpe antifade montering medium i midten av et lysbilde.
  3. Fest små flekker av leire i de 4 hjørnene av dekkglass for å hindre dekkglass fra knusing hjernen prøven under montering.
    MERK: leire patcher gir demping for å hindre dekkglass fra knusing prøven. Hver leire plaster bør være ca 1 mm i diameter.
  4. Under en dissekere mikroskop, plasserer hjernen i ventral-up posisjon og plassere dekkglass på toppen for å sikre hjernen. Bruk konvekse baksiden av hjernen som et fjell for å identifisere retningen av hjernen prøven (figur 2A).
  5. Skaff første bildestakk (horisontal visning) med en konfokalmikroskop. Bruk en høy NA objektiv (for eksempel en 63X 1,3 NA glyserol eller olje nedsenking objective linse) og 2,5x digital zoom (pikselstørrelsen er 0,105 mikrometer per piksel, averaging tallet er to). Erverve mer enn 180 optiske seksjoner (512 x 512 piksler) for å dekke medulla neuropil med en trinnstørrelse på 0,2 mikrometer.
  6. Monter hjernen som beskrevet i trinn 1.3 - 1.4, men justere hjernen i anterior-up stilling (sett forfra).
  7. Erverve den andre bildestabelen (frontriss) av den samme nervecellen, som beskrevet i trinn 1.5.
    MERK: Finne samme nervecellen kan være utfordrende når det er mange nerveceller merket i den optiske lapp. For å identifisere de samme nevronene fra begge retninger, kanskje lavere forstørrelse bildestakker fra begge syn være nødvendig (for eksempel bruke en zoom på 0,7, og en trinnstørrelse på 0,45 mikrometer til å tilegne seg lav oppløsning bildestakker). Hvis bildet er større enn 512 x 512, bør beskjæres til 512 x 512 før image kombinasjon, og pikselstørrelsen bør holde på 0,105 mikrometer per piksel mens bildebehandling det store feltet. Tap av signaler et potensielt problem for dype vev. Hvis signalet er svakt, bilde ventrale halvdel av hjernen. For å redusere photobleaching under skanning, bruker så lite av en laser strøm som mulig. Bruk rekkevidde indikator for å se etter overeksponering før du henter bildestakker. Hvis mulig, bruk en konfokal mikroskop utstyrt med Gaasp detektorer.
  8. Identifisere og registrere plasseringen av nervecellen av interesse med hensyn til medulla neuropil ([R / L] høyre / venstre og dorsal / ventral [D / V]). Sjekk om prøven flyttet under bildet oppkjøpet ved å undersøke bildestakk.
    MERK: Prøve flytting er ofte på grunn av feil montering. Hvis prøven bevegelse oppstår, kan bildestakk ikke brukes for registrering og skal kastes. Re-montere prøven og skaffe bildestakker fra samme nervecellen.

2. Bilde Deconvolution

MERK: deconvolution trinnet bruker image deconvolution programvare for å gjenopprette de oppkjøpte bilder som er degradert ved å tåkeleggeog støy. Mens dette trinnet er valgfritt, forbedrer det betydelig bildekvalitet. Det anbefales å bruke dekonvolveres bildestakker for bilderegistrering og kombinasjon i § 3.

  1. Start deconvolution program i den interaktive modus. Last inn bildestakk (i LSM eller bestemt mikroskopisk format) ved å velge Meny: File / Open (eller Ctrl-o) i hovedvinduet.
  2. Klikk for å velge lastet bildestakk og velger Meny: Ops å åpne bildet operasjonsvindu. Bruk standard Classic Maximum Likelihood estimering (CMLE) algoritme.
  3. I driften vinduet bilde, klikker du på "Parameters" -kategorien. Skriv inn de riktige parametrene for objektivet nedsenking medium, innstøpningsmediet og numerisk apertur (f.eks olje, glyserin, osv.) (F.eks nedsenking olje, osv.) (NA, her, 1.3 ble brukt). Sjekk de resterende parametere for å sørge for at de korrekt gjenspeiler bildeforhold. Klikk på fanen "Sett alt verifisert" å finAlizé parameterinnstillingene.
  4. I driften vinduet bilde, klikker du på "Operation" -kategorien. Tildele en utmatingsmål (f.eks c). Legg inn aktuelle tall i "Signal / Noise per kanal" (for eksempel "12 12 12 12" er et godt utgangspunkt, mens standardinnstillingen er "20 20 20 20"). Bruk standardinnstillinger for de resterende parametrene.
  5. Klikk på fanen "Kjør kommando" for å starte deconvoluting bildet stabelen; denne prosessen kan ta opptil flere titalls minutter å fullføre, avhengig av datamaskinen.
  6. I hovedvinduet klikker du og velger dekonvolveres bildestakk. Velg Meny: Lagre som for å lagre dekonvolveres bildet i ICS bildefil format (ICS og .ids).
    MERK: Hver bildestakk har to filer: ICS-filen inneholder header informasjon og IDer filen inneholder rå bildeinformasjon.
    1. Gi nytt navn til bildestakk filer i henhold til bildeorientering (f.eks nevne den horisontale-view bilde sstifter H.ids og H.ics og frontal-view bildestakk F.ids og F.ics).

3. Dual-view bilde Kombinasjon

Merk: Dette trinnet kombinerer to image stabler å generere høyoppløselige 3D-bilder ved hjelp av MIPAV programvare.

  1. Generere matriser for bilde kombinasjon.
    1. Start MIPAV programmet. Last H og F bildestakker ved å velge Meny: Fil / Åpne bilde (A) fra disk (eller Ctrl-f) /H.ids og F.ids; vinduet vil vise to bilder.
    2. Velg H bilde ved å klikke på bildet og velg Meny: Verktøy / Conversion Tools / RGB / Grays; vinduet vil vise GrayG, grayb, og GrayR bilder.
    3. Lukk GrayR og grayb, bare holde GrayG på vinduet.
    4. Velg F-bilde ved å klikke på bildet og velg Meny: Verktøy / Conversion Tools / RGB / Grays. Vinduet vil vise GrayG1, GrayB1, og GrayR1 bilder.
    5. Lukk GrayR1 og GrayB1 og holder bare GrayG1 på vinduet. På dette trinnet bare GrayG og GrayG1 er på vinduet.
    6. Velg GrayG (høydepunkt), velger du Meny: Algoritmer / Registrering / Optimalisert Automatic Image Registrering; "Automatisk optimalisert bilderegistrering 3D" dialogboks vil dukke opp.
      1. I Input Options, endre "Grader av frihet" fra default "Affine-12" til "Specific Rescale-9." I "rotasjoner," -tasten i -105 til 105 i "Rotasjonsvinkel prøvetaking utvalg" (standard: -30 til 30 grader), 10 i "Grov vinkeløkning" (standard: 15 grader), og 3 i "Fine vinkel tilveksten "(standard: 6 grader).
    7. Klikk OK; den første Matrix "GrayG_To_GrayG1.mtx" vil bli generert og lagret i bildemappen. Lukk alle bildevinduer og gå videre til neste trinn; dette trinnet vil ta minst 15 min.
    8. Last H og F bildestakker ved å velge Meny: Fil / Åpne bilde (A) fra disk (eller Ctrl-f) /H.ids og F.ids, som i trinn 3.1.1.
    9. Velg H bilde ved å klikke på bildet og velg Meny: Verktøy / Conversion Tools / RGB / Gray; den "RGB-> Gray" dialogboks vil dukke opp. Klikk OK; vinduet vil vise "HGray" bilder. Hold HGray og lukke H bildet.
    10. Gjenta trinn 3.1.9 for F-bilde; de "FGray" bilder vises på vinduet. Hold FGray og lukke F-bilde; bare HGray og FGray vil bli liggende på vinduet.
    11. Velg HGray bilde (høydepunkt) og gå til Meny: Algoritmer / Transformation verktøy / Transform. Den "Transform / Oppdater bilde" dialogboks vil dukke opp. Klikk på "Resample" -kategorien og endre sampling til størrelsen på "HGray" til "FGray". Deretter klikker du på fanen "Transformer" og load "GrayG_To_GrayG1.mtx" ved å velge "Les matrise fra fil." Klikk OK; vinduet vil vise HGray_transform bildet. Lukk HGray bilde så bare HGray_transform og FGray er igjen på vinduet.
    12. Velg "HGray_transform & #34; image (høydepunkt) og gå til Meny: Algoritmer / Registrering / Optimalisert automatisk bilderegistrering. "Automatisk optimalisert bilde Registrering 3D" dialogboks vil dukke opp. I "Rotations," nøkkelen i -5 til 5 i "Rotasjonsvinkel sampling range" (standard: -30 til 30 grader), 3 i "Grov vinkeløkning" (standard: 15 grader), og en i "Fine vinkel tilveksten "(standard: 6 grader). Klikk på OK.
      MERK: Affine Matrix (HGray_transform_To_FGray.mtx) vil bli generert og lagret i bildemappen og "HGray_Transform_register" bilde vises på vinduet. Dette trinnet vil ta minst 40 min.
    13. Lukk "HGray_transform" image; bare "HGray_Transform_register" og "FGray" skal stå på vinduet.
    14. Velg "HGray_Transform_register" image (høydepunkt) og gå til Meny: Algoritmer / Registrering / B-Spline Automatisk registrering 2D / 3D. "B-Spline Automatic registrerinpå 3D-intensitet "dialogboks vil dukke opp. Velg" Least Squares "i kostnadsfunksjonen (standard er Correlation Ratio).
      1. Klikk "Utfør to-pass registrering". I Pass en seksjon, tast 2 inn "Gradient Descent Minimer Step Size (utvalgsenheter)" (standard er 1) og tast inn 10 til "Maksimalt antall iterasjoner:" (standard er 10). I Pass to avsnitt, taster du inn en til "Gradient Descent Minimer Step Size (utvalgsenheter)" (standard er 0,5) og tast inn to til "Maksimalt antall iterasjoner:" (standard er 10).
        MERK: NLT matrise, "HGray_transform_register.nlt", vil bli lagret i bildemappen og "HGray_transform_register_registered" bilde vises på vinduet. Dette trinnet vil ta minst 5 min.
    15. Lukk alle bildene på vinduet.
  2. Generere referansebildet for bilde kombinasjon.
    MERK: Dette trinnet er ment å Generspiste et registrert horisontal image for kombinasjon.
    1. Load H og F bildestakker ved å velge Meny: Fil / Åpne bilde (A) fra disk (eller Ctrl-f) /H.ids og F.ids; to bilder vises på vinduet.
    2. Velg H bilde (høydepunkt) og gå til Meny: Algoritmer / Transformation verktøy / Transform; den "Transform / Oppdater bilde" dialogboks vil dukke opp. Klikk på "Resample" -kategorien og endre sampling fra en størrelse på "H" til "F." Deretter klikker du på fanen "Transformer" og load "GrayG_To_GrayG1.mtx" ved å velge "Les matrise fra fil." Klikk OK; den H_transform Bildet vises på vinduet. Lukk H bildet, men beholde H_transform og F i vinduet.
    3. Velg "H_transform" image (høydepunkt) og gå til Meny: Algoritmer / Transformation verktøy / Transform; den "Transform / Oppdater bilde" dialogboks vil dukke opp. Klikk på "Resample" -kategorien og endre sampling fra en størrelse på "H_transform" til "F. & #34; Deretter klikker du på fanen "Transformer" og load "HGray_transform_To_FGray.mtx" ved å velge "Les matrise fra fil." Klikk OK; den "H_transform_transform" bilde vil vises på vinduet. Lukk H_transform bildet; på dette punkt, vil bare H_transform_transform og F bli liggende på vinduet.
    4. Velg "H_transform_transform" image (høydepunkt) og gå til Meny: Algoritmer / Transformation verktøy / Transform-lineær; den "ikke-lineær B-Spline Transformation" dialogboks vil dukke opp. Deretter load "HGray_transform_register.nlt" og klikk OK; den "H_transform_transform_registered" bilde vil vises på vinduet. Lagre bildet som en ICS-fil. Lukk alle bildene på vinduet.
  3. Kombinere bildestakker
    MERK: Dette trinnet er å kombinere to bildestakker ervervet i ortogonale retninger (horisontale og frontale) i ett høyoppløselig stabelen.
    1. Gå til Meny: Plugins / Generisk / Drosophila Retinal Registrationl; den "Drosophila Netthinne Registrering v2.9" dialogboks vil dukke opp. Last opp "H.ics" i bilde H, "H_transform_transform_registered" fra trinn 3.2.4 i Image H-Registrerte, "F.ics" i Image F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" fra trinn 3.1.7 i Transformation 1-Grønn (valgfritt ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" fra trinn 3.1.12 i Transformation 2-Affine, og "HGray_transform_register.nlt" fra trinn 3.1.14 i Transformation 3-ikke-lineær (valgfritt).
      1. Velg sqrt (Intensitet-H x Intensitet-F) og No Rescale i "Rescale H til F." Hold standard alternativer for de andre parametrene. Klikk OK; dette trinnet vil ta ca 3 min.
        MERK: Etter behandling, 3 sett med bilder vil bli generert: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (den endelige saman bildet), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (grønn kanal for H, F, og det endelige saman bilde), og redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (røde kanalen for H, F, og det endelige rekombinerte image); alle utdatafiler vil bli endret til 512 x 512 x 512.
    2. Åpne "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" under bildet visualisering programvare. Lagre bildet stabelen i ims format og endre navn på filen; dette saman bildefil skal brukes til neurite sporing og registrering.

4. neurite Tracing og Reference Point Assignment

MERK: Dette trinnet er å spore neurites (4.1) og å tildele referansepunkter for registrering (4.2) ved hjelp av image visualisering programvare.

  1. Følge neurites
    1. Start image visualisering programvare. Åpne recombined bildefilen. Gå til Meny: Rediger / Show Display Justering og slå av fotoreseptoren kanal (rød).
    2. Visualiser bildet i "overgå" modus. Slå på "stereo" og bruke "Quad Buffer" -modus for å visualisere 3D-bilder hvis datamaskinen er equipped med et stereograph system.
    3. Gå til Meny: overgå / Filaments å legge til nye filamenter. Klikk på "Skip automatisk oppretting, redigere manuelt" -kategorien.
    4. Klikk på fanen "Tegn" og velg "AutoDepth."
    5. Velg "Innstillinger" sjekk "Line" og tast inn et passende antall piksler for bedre visualisering (en 4-pixel linjen brukes i denne protokollen). Sjekk "Show dendritter", "Begynnelsen Point" og "grenpunkt". Sett "Render Quality" til 100%.
    6. Velg "Tegn" -fanen og starte sporing neurites. Start med axon og deretter flytte til dendritter (figur 2D). Axon og dendritter av transmedulla nevroner er lett å skille.
      MERK: En Tm nevron utvider sin axon fra cellekroppen og prosjekter hele veien til høyere visuell prosessering sentrum, lobula. Systemet vil automatisk definere den første lange filamentet som et axon, og de gjenværende korte filamenter somdendritter. Hold startpunktet ved begynnelsen av filamentet (axon) under sporing og sørge for at de spores neurites er tilkoblet. Undersøk forgreningspunkt og startpunktet. Hvis dendritter ikke er koblet til, vil en ny begynnelse punkt defineres på ikke-tilkoblede filament.
    7. Etter sporing, gå tilbake til "Innstillinger" uncheck "Begynnelsen Point" og "forgreningspunkt", og gå til Meny: overgå / Eksporter valgte objektene ../. Lagre filament som oppfinner fil (* .iv).
  2. Tildeling av referansepunkter
    1. Velg "Show Display Justering" og slå på begge bilde kanaler. I dette eksemplet kanalen 1 er det fotoreseptoren farging og kanal 2 er det TM20 neuron (GFP).
    2. Gå til Meny: overgå / måling. Velg "Edit" -kategorien og sjekke "spesifikk Channel:" (velg fotoreseptoren kanal [red]).
    3. Tildele referansepunkter for topplaget. Gå til Meny: / overgå / Måling Points å lage nye målepunkter. Markere begynnelsen på M1 laget som et topplag. Rekkefølgen av punktene er som følger: ekvatoriale, anterior-ekvator, anterior, anterior-ventral, ventral, posterior-ventral, posterior, posterior for ekvator, og sentrum (figur 3F); definere midtfotoreseptoren som den som er knyttet til de dendrittiske prosesser.
    4. Tildele R8 og R7 lag som i trinn 4.2.3 (figur 3G). Tre individuelle målepunkter skal opprettes i trinn 4.2.3 og 4.2.4.
    5. Eksport koordinatene til punktene for hvert lag. Klikk på "Statistikk" -kategorien, velger du "Detaljert", "spesifikke verdier" og "Position;" og klikk "Export Statistikk på kategorien Skjerm til fil." Lagre som "Comma separerte verdier" (* .csv).
    6. Åpne de tre CSV-filer (fra trinn 4.2.3 - 4.2.4) og kombinere koordinatene til de 27 referansepunkter i en ny csv fil ved å kopiere og lime inn (the ordre er Top, R8 og R7). Se Materialer / utstyr Bord og følger formatet for eksempel filen.

5. Rigid-kropp og TPS-lineær Registrering

MERK: Dette trinnet er å registrere neurite spor (i iv format) til referansen kolonnen matrise og å generere en registrert SWC fil ved hjelp av MIPAV programmet. Denne delen krever følgende filer: den rekombinerte bildestakk (.ids) fra trinn 3.3, referansepunktet (.csv) fra trinn 4.2, og neurite spor filament fil (.iv) fra trinn 4.1.

  1. Gå til Meny: Plugins / Generisk / DrosophilaStandardColumnRegistration. Den "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" vindu vil dukke opp.
  2. Last inn bildefiler (.ids), den referansepunkter fil (CSV), og filament fil (.iv).
  3. Velg 9 poeng per lag.
  4. Velg posisjonen fotografert nevron (LV / RD eller RV / LD).
  5. Velg "Rigid registrerinpå og TPS "og" Stiv registrering "til ikke-lineær og rigid-body registrering, henholdsvis.
  6. Sjekk "Lag SWC fil" for å generere følgende output filer: en registrert neurite sporingsfilen i SWC-format (se konkrete materialer / utstyr for definisjon), en registrert IV fil (.iv), koordinatene til standardiserte neurite (.txt), transformerte koordinater (.txt), og det sammensatte bildet (.ids).
  7. Endre navnet på SWC-filen. Påfør forkortelse av beliggenheten til enden av filnavnet (trinn 1.7). Bruk for eksempel "Tm20_3_RV.swc" for TM20 Nevron # 3 ligger på ventrale halvdel av høyre marg.

6. Standardisering til Høyre-ventral Configuration

MERK: Dette trinnet er å konvertere neurite spor (i SWC-format) til standard RV (høyre ventral) konfigurasjon ved hjelp av egendefinert skript "RV_standardization.m." Her ble skriptet skrevet i matriksen laboratoriet språk. DeNavnene på inngangs SWC-filer skal være i følgende format: "NeuronName _ Antall _ Configuration .swc" (f.eks Tm20_3_LV.swc).

  1. Åpne "RV_standardization.m" script.
  2. Redigere følgende parametere i "User input" seksjonen:
    1. Skriv inn navnene på de nevroner uten nummerering (f.eks Tm2, TM20, etc.) i "neuron_names."
      MERK: Standard i "file_end_in" er "_ * SWC,." Som ser etter filer med navn som inneholder ( "*" er et wildcard matchende vilkårlig antall tegn) "_ * SWC.". Standard av "swc_file_end_out" er "_f.swc", som vil legge til "_F" til slutten av filnavnet etter standardisering.
    2. Angi katalogen der SWC-filer er i "directory_in". Angi katalogen der de standardiserte filer vil gå i "directory_swcout".
  3. Kjør skriptet.
  4. Optional: Bruk Vaa3D 14 for å visualisere SWC-filer og validere konvertering.

7. Beregn Dendritic Forgrening og avslutte Frekvenser

MERK: Dette trinnet bruker stive kroppen registrert SWC-filer til å beregne de Kaplan-Meier estimatorene for sannsynligheten for at en dendrittiske segmentet vil nå en gitt lengde uten å avslutte. Dette skriptet bruker to Dendritic_Tree_Toolbox funksjoner: extractDendriticSegmentLengthDistribution og estimateDendriticSegmentLengthProbability.

  1. Åpne "Branch_term_P.m" script.
  2. Redigere følgende parametere i "User input" seksjonen:
    1. Angi banen til de stive kroppen registrerte SWC-filer i "pathToSWCFiles" (for eksempel / Rigid_Registered_swc /). Angi banen som vil holde grafikk ut i "pathToOutput." Oppgi navnet på nervecellene eller nevrale typer i "neuron_names" (f.eks Tm2, Tm20, etc.).
  3. Kjør skriptet; utgangene er Kaplan-Meier estimatet kurve for dendrittiske forgrening og avslutning.
    MERK: Valgfritt: Påfør funksjonen sittende metode for å utvinne fra Kaplan-Meier estimatorene den lokale sannsynligheten for at dendrittiske segmentet vil forgrene eller avslutte.

8. Plott Fordeling av Layer-spesifikke Oppsigelse av dendrittiske Arbors

MERK: Dette trinnet plotter fordelingen av dendrittiske terminaler i ulike medulla lag som et søylediagram. Dette kan brukes til en nevron, en gruppe av nerveceller, eller grupper av neuroner. Skriptet bruker extractDistributionAlongAxis funksjon fra Dendritic_Tree_Toolbox.

  1. Åpne "Layer_term.m" script.
  2. Redigere følgende parametere i "User input" seksjonen:
    1. Angi katalogen som inneholder lineære registrert SWC-filer i "pathToSWCFiles" (for eksempel / Non_linear_Registered_swc /). Angi katalogen for grafikk ut i "pathToOutput." Oppgi navnet på nervecellene eller nevrale typene i "neuron_names" (f.eks Tm2, TM20, etc.).
  3. Kjør tutorial script. Utgangen er et histogram av andelen av terminale noder i bestemte medulla lag.

9. Plott Planar Projection Retning dendritter

MERK: Dette trinnet plotter plane projeksjonsretninger dendritter som en polar plot. Skriptet bruker extractAngularDistribution funksjon fra Dendritic_Tree_Toolbox.

  1. Åpne script "Planar_proj.m."
  2. Redigere følgende parametere i "User input" delen.
    1. Angi katalogen som inneholder ikke-lineære registrerte SWC-filer i "pathToSWCFiles" (for eksempel / Non_linear_Registered_swc /). Angi katalogen for grafisk produksjon i "pathToOutput." Oppgi navnet pånevroner eller nerve typer i "neuron_names" (f.eks Tm2, TM20, etc.).
  3. Kjør skriptet; produksjonen er en polar tomt på plane projeksjon retninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruk av dual-view bildebehandling prosedyren som presenteres her, ble en flue hjernen inneholder tynt merket TM20 nevroner avbildes i to ortogonale retninger. Før bildebehandling, ble hjernen farget med egnede primære og sekundære antistoffer for å visualisere membran tethered GFP og fotoreseptorlidelser aksoner. For avbildning, ble hjernen først montert i den horisontale retning (figur 2A, B). En GFP-merket TM20 nevroner og de omkringliggende fotoreseptorlidelser axoner ble fotografert ved hjelp av et konfokal mikroskop (figur 3A). Hjernen ble deretter re-justert (figur 2A, B) og det samme TM20 neuron ble gjen avbildes i frontal retning (figur 3B). I løpet av avbildningsprosessen, ble plasseringen av TM20 neuron identifisert på den ventrale halvdel av den høyre marg neuropil (RV-konfigurasjon). Disse to bildestakker ble dekonvolveres bruke bildet deconvolution programvare og recombined ved hjelp MIPAV (figur 3C) for å generere en rekombinant bilde stabel (figur 3C). Det rekombinante bildestakk viste en signifikant reduksjon av aksial forvrengningen i forhold til enten inngang stabel (figur 3A ', B').

Bruk av bildet visualisering programvare, ble aksonet og dendritter av TM20 nervecellen spores (figur 3D) og lagret som oppfinner (iv) fil. 27 referansepunkter på fotoreseptorlidelser axoner rundt TM20 nervecellen ble tildelt (Tall 3E - H) og lagres som en kommaseparert fil (CSV). De spores dendrite filer og referansepunkt filen ble senere brukt til egendefinerte plugin i MIPAV å generere stive kroppen registrerte og ikke-lineært registrerte dendrite spor i SWC filformat. De registrerte dendrittiske spor ble konvertert til standard RV konfigurasjonen ved hjelp av "RV_standardization.m" script. THan registrerte og standardiserte dendrittiske sporingsfilene ble visualisert ved hjelp Vaa3D å validere registrering og standardiseringsprosesser (figur 3i).

For dendrittiske analyse, registrert dendrittiske spor i 15 TM20 nevroner og 15 Tm2 nevronene ble samlet inn. Ved hjelp av "Branch_term_P.m" script, forgreningen og avslutning av sannsynligheten av disse nevronene ble analysert ved anvendelse av stivt legeme registrerte dendrittiske spor (figur 4A, B). Kaplan-Meier-kurver viser at begge nevronale typer har lignende forgrening og terminer frekvenser. Imidlertid har Tm2 en lavere terminerende frekvens for lengre segmenter (> 4 um, figur 4A) 12. For å analysere dendritiske egenskaper assosiert med lag og kolonner, ble dendrittiske traser registrert av den ikke-lineære registreringsmetode som brukes. Bruke egendefinerte "Layer_term_P.m" script, fordelingens fra lag-spesifikke dendrittiske avslutning for Tm2 og TM20 nevronene ble beregnet (figur 4C, D). De forskjellige distribusjoner av lag-spesifikke avslutning av Tm2 og TM20 dendritter er i samsvar med deres spesifikke synaptiske partnere i forskjellige lag: Tm2 dendritter motta innspill fra L2 og L4 aksonal terminaler i M2 og M5, henholdsvis, mens TM20 dendritter motta innspill fra R8 og L3 i M3 lag 8, 15, 16. Ved hjelp av "Planar_proj.m" script, ble de plane projeksjon retninger av tm2 og TM20 dendritter analysert og ble funnet å være adskilt fra hverandre: Tm2 dendritter prosjekt baktil mens TM20 dendritter prosjekt anteriort 12 (figur 4E, F).

Figur 1
Figur 1. arbeidsflyt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Prøvepreparering for Dual-view Imaging og symmetrien i Drosophila Medulla Column Array. (A, B) Eksempel montering for dual-view bildebehandling. (A) Utsikten er vist som om du ser på hjernen gjennom en dekkglass. (B) Skjematisk diagrammer for prøvemontering. For bildebehandling horisontental stabler, immuno-farget hjernen er montert først på ventral-up posisjon. Etter å skaffe den første bunken, er hjernen re-plassert i anterior-up posisjon for avbildning frontal stabelen. A: anterior; P: posterior; D: dorsal; V: ventral; R: høyre; L: venstre. (C - E) Symmetrien og organisering av medulla neuropil, sett i frontal posisjon. (C) fotoreseptor axoner, merket med 24B10 antistoff (rød), ble anvendt for å visualisere organiseringen av medulla neuropil. Bildet vises som om du ser fra utsiden og inn i hjernen. Ant: anterior; Pos: posterior; Dor: dorsal; Ven: ventral; Eq: ekvator. (D) En høy forstørrelse riss av (C) ved fire kvadranter av medulla neuropil på R7 lag nivå. De sentrale R7 terminalene er merket med gule prikker. Den fremre og ekvatoriale R7s er merket med grønne og cyan prikker, henholdsvis. (E) En skjematisk fremstilling av medulla columnar organisasjon. Legg merke til at venstre og høyre medulla neuropils er speilbilder, og dorsal og ventral halvdelene av hver neuropil er også speilbilder, atskilt av ekvator. Røde prikker angir ekvatoriale R7s, som er de første referansepunkter. Numbers (1 - 9) og piler indikerer rekkefølgen av referansen punkt oppdrag. Skala: 15 mikrometer i C; 5 mikrometer i D. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Bilde rekombinasjon og Reference Point Oppdraget. (A - C) Confocal bilder for en enkelt TM20 nevron ervervet i den horisontale (A) og frontale (B) retninger. Bildene vises som maksimal intensitet projeksjoner. Fotoreseptorlidelser axoner og en enkel TM20 neuron er merket med Mb24B10 antistoff (rød) og membran-bundet GFP (grønt), respektivt. (C) rekombinert bilde av (A, rød) og (B, cyan). For klarhet er det bare fotoreseptorene vist. (A '- C') Dual-bildebehandling forbedrer aksial oppløsning. Den rekombinerte bilde (A ') har en bedre oppløsning enn de som er av den horisontale visning (A') og frontpartiet visning (B ') bilder. Lavere paneler: høy forstørrelse utsikt over eske områder i de øvre paneler. (D) Tracing axon (hvit) av en enkelt TM20 neuron. Begynnelsen punktet ble angitt som en cyan prikk. (E) De 27 referansepunkter (hvite prikker) på 9 fotoreseptorlidelser axoner omgir TM20 nevronene blir brukt som landemerker. Referansepunktene er i tre lag: Top, R8 og R7. Punkt oppdraget (F) Annonse i hvert lag. Referansepunktet oppdraget følger fol gende rekkefølge: ekvator (EQ), anterior-ekvator (AE), anterior (A), anterior-ventral (AV), ventral (V), posterior-ventral (PV), posterior (P), posterior-ekvator (PE) og sentrum (C). (G) Et skjematisk fremstilling av medulla kolonne matrisen som brukes for registrering. En TM20 nevron vises (grønn). Medulla lag (M1-6) er som angitt. (H) Et eksempel på et lag og referansepunkt oppdrag for en enkelt kolonne. Tre lag brukes til å definere hver kolonne: Topp, R8 og R7 (krysset av M5 / 6 lag). (I) Et registrert og standardisert neurite spor visualisert ved hjelp Vaa3D. Skala: 5 mikrometer i A for AC; 5 um i A 'for A'-C'; 5 mikrometer i D, E, F og G. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

410fig4.jpg "/>
Figur 4. Eksempler på resultater fra dendrittiske Analyser. (A, B) Kaplan-Meier-estimater (y-akse) av dendrittisk forgrening (A) og terminering (B) ble plottet på logaritmisk skala i forhold til segmentlengden (x-aksen). Solid og stiplede linjer betegne gjennomsnitt ± SDS. Tm2 (rød) og TM20 (svart) dele lignende forgrening og terminer frekvenser for segmenter mindre enn 4 mikrometer. (C, D) histogrammer som viser den gjennomsnittlige andelen av terminale dendrittiske noder i hver marg (M) lag. Andelen av terminalnoder i en gitt medulla lag blir først beregnes for hver neuron av en gitt type, og deretter midlet over alle neurons av denne typen. De vertikale linjer viser standardavviket for andelen. Legg merke til at for TM2 nevroner (C), fordelingen av terminal dendrittiske noder er konsentrert i medulla lag 2, med en mindre topp i laget 5, mens det for Tm 20 neuroner(D), er fordelingen sentrert rundt M2 og M3 lag. (E, F) Polar plott av den plane projeksjonen av dendritter. Andelen av terminal noder projiserte innenfor et vinkelformet kasse (20 °) ble først beregnet for hver neuron av en gitt type, og deretter midlet over alle nevroner av denne typen. De røde og blå kurvene viser den gjennomsnittlige andelen ± standardavvik. Hjørnene på kurvene er midtpunktene av vinkelkasser. De svarte sirklene viser andelen verdiene angitt av den sorte tall på deres side. Merk at det i gjennomsnitt er de to klasser av nevroner orientert i nesten motsatt retning. A: anterior; P: posterior; D / V: dorsal / ventral; Eq: ekvator. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi hvordan du bildet og analysere dendrittiske lysthus av Drosophila medulla nerveceller. Den første delen, dual-view bildebehandling, beskriver deconvolution og kombinasjon av to bildestakker inn et bilde med høy oppløsning stabelen. Den andre delen, dendrite sporing og registrering, beskriver sporing og registrering av dendritter av medulla nerveceller til referanse kolonnen matrisen. Den tredje delen, dendrittiske analyse, beskriver bruken av egendefinerte skript for å analysere dendrittiske mønstre. Sammen disse protokollene gi en komplett arbeidsflyt for å hente ut informasjon om dendrittiske mønstre med hensyn til lag og kolonner og for å bestemme dendrittiske forgrening og terminer frekvenser.

Den dual-view avbildningsmetode som presenteres her er konseptuelt lik den multi-view avbildningsteknikker implementert med lys-arks mikroskoper, hvor to eller flere bilde stabler innsamlede orthogonally blir rekombinert å oppnå en høy aksial resolution 17, 18. Men det er teknisk utfordrende å ortogonalt gjennomføre de to høye NA (numerisk apertur) objektiv som er nødvendige for å avbilde slanke dendritter. Således krever den to-syn metode å avbilde det samme hjerne prøven i to påfølgende trinn, og re-orientering av prøven mellom imaging. Svikt i bilde kombinasjon er mest sannsynlig forårsaket av prøven bevegelse under avbildning eller prøve pres under manipulasjon. Videre, mens det bilde rekombinasjon fremgangsmåte begrenser den aksiale forvrengning problem og resulterer i nær-isotrop oppløsning, den rekombinerte bildene er fremdeles under en diffraksjonsgrensen. Vår dual-view avbildningsmetode må bare standard konfokalmikroskopi, som er allment tilgjengelig. Men super-oppløsning mikroskopi, for eksempel STED eller struktur belysning, hvis tilgjengelig, ville være et utmerket alternativ til dual-view avbildningsmetode til stede her.

Dedendrite sporing og registrering delen presenteres her sporer dendrittiske trær og registrerer dendrittiske trær til referanse kolonnen matrisen. I denne protokollen, er kommersielt program Imaris brukes for semi-automatisert dendrite sporing og for å tildele referansepunkter. Lignende oppgaver kan utføres ved hjelp av en rekke freeware alternativer, for eksempel NeuronJ 19, 20 og neurite Tracer 21. Vår registreringsprotokoll bruker et egendefinert plugin implementert i åpen kildekode-program MIPAV å registrere dendrite spor til referanse kolonnen matrisen. Så vidt vi vet, er dette registreringsmetode den eneste metoden som registrerer neurite spor til kolonner og lag. Denne fremgangsmåten bruker jevnlig arrangert fotoreseptorlidelser axoner som landemerker for registrering. De dendrittiske traser genereres av den ikke-lineære registreringsmetode er ideelle for å trekke ut informasjon om dendritiske mønstre i forbindelse med søyler og lag. På den andrehånd, justerer den stive kroppen registreringsmetode de kartesiske aksene dendrittiske spor til kardinal aksene i neuropil uten å endre dendrittiske lengder eller andre lokale geometriske egenskaper. Derfor er registrert den stive legeme-dendrittiske traser er egnet for standard morfometrisk analyse.

Tradisjonell dendrittiske morfometrisk analyse, slik som L-mål 22, karakteriserer lokale og globale dendrittiske egenskaper uten å registrere omkringliggende vev. Vi har tidligere vist at mange medulla nevroner dele dendrittiske geometriske egenskaper og at slike beregninger er utilstrekkelige for å skille medulla Nevron typer 12. I stedet er typespesifikke dendrittiske attributter direkte forbundet med lagene og kolonner hvor dendritter bor. Spesielt ulike typer medulla nevroner projisere dendritter i forskjellige plane retninger for å avslutte i bestemte medulla lag. Disse to dendrittiske attributter rkjøleeflekt dendrittiske funksjon av medulla nevroner å motta retinotopically rettet afferente organisert i lag og kolonner. For å lette utvinning av disse egenskapene, har vi utviklet dendrittiske treet verktøykasse som inneholder en rekke egendefinerte funksjoner for beregning av dendrittiske egenskaper. I den dendrittiske analyse seksjon, viser vi hvordan disse funksjonene kan anvendes til registrerte dendrittiske traser for å beregne fordelingen av sjiktspesifikke terminering og plane projeksjon retninger av dendritter.

Dendrittiske tre verktøykasse gir en plattform for å legge til andre tilpassede funksjoner for dendrittiske analyse. I dendrittiske analyse delen beskriver vi også prosessen for å utlede estimater for åpen dendrittiske avslutnings og forgrening frekvenser. Spesielt disse funksjonene beregne forgreninger og terminerer frekvenser basert på en Kaplan-Meier-parametriske estimator for sannsynligheten for at et dendrittisk segmentet vil strekke seg til en viss lengtt uten forgrening eller avslutte 12, 23. Det er viktig å merke seg at den stive legeme-registrert (men ikke de ikke-lineært registrert) dendrittiske traser som skal brukes for denne beregningen fordi den ikke-lineære registreringsprosessen endrer dendrittiske segmentlengder. De dendrittiske forgreninger og terminerings frekvenser er den første deriverte (stigningstallet) av KM kurver og kan beregnes ved hjelp av funksjonen sittende metode. Videre er nøyaktig beregning av forgrening og terminerende frekvenser krever ofte en betydelig datasett (> 10 nevroner for Tm neuroner) fordi enkelt neuroner har bare et relativt lite antall av dendrittiske segmenter. I de medfølgende eksemplene, Tm2 og TM20 har lignende forgrening og avslutnings frekvenser, men Tm2 forgrening frekvensen er ikke ensartet over forgrening lengde, et karakteristisk trekk ved Tm2 dendritter 12.

Mens våre protokollerer utformet for Drosophila medulla neuroner, kan de være innrettet til å analysere andre nevroner som utførlig dendritter i lag og kolonner, for eksempel andre Drosophila optiske fliker og virveldyr hinnen og cortex. Slike tilpasninger vil kreve bygging av en ny referanse kolonne gruppe basert på system av interesse 12, samt mindre modifikasjoner av MIPAV plugin. Vi tilbyr alle våre programmer som åpen kildekode programvare for å fremme samarbeid og deling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av egenutført Research Program av National Institutes of Health, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (tilskudd HD008913 til C.-HL) og Senter for Informasjonsteknologi (PGM, NP, ESM og MM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Huygens Professional Scientific Volume Imaging version 16.05 for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV version 7.3.0 for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila
RetinalRegistration.class		 freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard
ColumnRegistration.class		 freeware
Imaris Bitplane for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab Mathworks R2014b for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14 v1.14 for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox v1.0 For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name Company Catalog number Comments
Sample files
SWC file definition http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example  https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=
1471880596000&api=v2
Name Company Catalog number Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later 3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card Nvidia for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2 Nvidia http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2 http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name Company Catalog number Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody The Developmental Studies Hybridoma Bank 24B10
GFP Tag Antibody Thermofisher Scientific G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488 Thermofisher Scientific A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568 Thermofisher Scientific A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000
Mounting Clay  Fisher S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm Zeiss 474030-9000-000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaas, J. H. Topographic maps are fundamental to sensory processing. Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).
  2. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).
  3. Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. CSH Perspect Biol. 2 (3), a001743 (2010).
  4. Clandinin, T. R., Feldheim, D. A. Making a visual map: mechanisms and molecules. Curr Opin Neurobiol. 19 (2), 174-180 (2009).
  5. Luo, J., McQueen, P. G., Shi, B., Lee, C. H., Ting, C. Y. Wiring dendrites in layers and columns. J Neurogenet. 30 (2), 69-79 (2016).
  6. Meinertzhagen, I. A., Hanson, T. E. The development of the optic lobe. In The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 1363-1491 (1993).
  7. Takemura, S. Y., et al. A visual motion detection circuit suggested by Drosophila connectomics. Nature. 500 (7461), 175-181 (2013).
  8. Takemura, S. Y., et al. Synaptic circuits and their variations within different columns in the visual system of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), 13711-13716 (2015).
  9. Gao, S., et al. The neural substrate of spectral preference in Drosophila. Neuron. 60 (2), 328-342 (2008).
  10. Karuppudurai, T., et al. A hard-wired glutamatergic circuit pools and relays UV signals to mediate spectral preference in Drosophila. Neuron. 81 (3), 603-615 (2014).
  11. Strother, J. A., Nern, A., Reiser, M. B. Direct observation of ON and OFF pathways in the Drosophila visual system. Curr Biol. 24 (9), 976-983 (2014).
  12. Ting, C. Y., et al. Photoreceptor-derived activin promotes dendritic termination and restricts the receptive fields of first-order interneurons in Drosophila. Neuron. 81 (4), 830-846 (2014).
  13. Ting, C. Y., et al. Tiling of R7 axons in the Drosophila visual system is mediated both by transduction of an activin signal to the nucleus and by mutual repulsion. Neuron. 56 (5), 793-806 (2007).
  14. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
  15. Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: the input terminals to the medulla. J Comp Neurol. 509 (5), 493-513 (2008).
  16. Takemura, S. Y., et al. Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway. Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).
  17. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  18. Wu, Y., et al. Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy. Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).
  19. Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. Automated analysis of NeuronJ tracing data. Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).
  20. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  21. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  22. Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).
  23. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. JASA. 53, 457-481 (1958).

Tags

Nevrovitenskap dendritter morphometrics lag og kolonner retina dual-view bildebehandling,
Analysere Dendritic Morfologi i kolonner og Layers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ting, C. Y., McQueen, P. G., Pandya, … More

Ting, C. Y., McQueen, P. G., Pandya, N., McCreedy, E. S., McAuliffe, M., Lee, C. H. Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers. J. Vis. Exp. (121), e55410, doi:10.3791/55410 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter