Summary
Aquí, se muestra cómo analizar enrutamiento dendríticas de las neuronas medulares de Drosophila en columnas y capas. El flujo de trabajo incluye una visualización dual técnica de imagen para mejorar la calidad de imagen y herramientas computacionales para el seguimiento, el registro de los cenadores dendríticas en la matriz de la columna de referencia y para el análisis de las estructuras dendríticas en el espacio 3D.
Abstract
En muchas regiones del sistema nervioso central, tales como los lóbulos ópticos de la mosca y la corteza de los vertebrados, los circuitos sinápticos se organizan en capas y columnas para facilitar el cableado del cerebro durante el desarrollo y tratamiento de la información en los animales desarrollados. las neuronas postsinápticas dendritas elaboradas en los patrones específicos de tipo en capas específicas que hacen sinapsis con las terminales presinápticas apropiadas. El neurópila mosca médula se compone de 10 capas y alrededor de 750 columnas; cada columna está inervado por las dendritas de más de 38 tipos de neuronas medulares, que responden a las terminales axonales de unos 7 tipos de aferentes de una manera específica del tipo. Este informe detalla los procedimientos para analizar la imagen y dendritas de las neuronas medulares. El flujo de trabajo incluye tres secciones: (i) la sección de formación de imágenes de doble vista combina dos pilas de imágenes confocal recogidos en las orientaciones ortogonales una imagen en 3D de alta resolución de las dendritas en; (Ii) la dendrita rastreo y registro de huellas sección dendríticascenadores en 3D y los registros de huellas dendríticas en la matriz de la columna de referencia; (Iii) la sección de análisis dendríticas analiza los patrones dendríticas con respecto a las columnas y capas, incluyendo la terminación y la proyección plana dirección de capa específica de cenadores dendríticas, y calcula las estimaciones de ramificación y de terminación de frecuencias dendríticas. Los protocolos utilizan plugins personalizados construidos en la MIPAV de código abierto (Procesamiento de Imágenes Médicas, análisis y visualización) cajas de herramientas personalizadas de la plataforma y en el idioma de laboratorio matriz. En conjunto, estos protocolos proporcionan un flujo de trabajo completo para analizar el enrutamiento dendríticas de Drosophila neuronas médula en capas y columnas, para identificar tipos de células, y para determinar defectos en los mutantes.
Introduction
Durante el desarrollo, las neuronas dendritas elaboradas en los patrones complejos ramificados, pero estereotipados para formar sinapsis con sus socios presináptica. patrones de ramificación dendríticas se correlacionan con la identidad y las funciones neuronales. Las ubicaciones de los cenadores dendríticas determinan el tipo de entradas presinápticos que reciben, mientras que la ramificación dendrítica de complejidad y de campo tamaños gobiernan el número de entrada. Por lo tanto, las propiedades morfológicas dendríticas son elementos indispensables para la conectividad sináptica y la computación neuronal. En muchas regiones del cerebro complejos, tales como los lóbulos ópticos de la mosca y la retina de los vertebrados, los circuitos sinápticos están organizados en columnas y capas para facilitar el procesamiento de información 1, 2. En una organización tan columna y capa, las neuronas presinápticas de un axones distintos proyectos modalidad para terminar en una capa específica (denominada orientación-capa específica) y para formar una matriz bidimensional ordenada (la called mapa topográfico), mientras que las neuronas postsinápticas se extienden dendritas de tamaños apropiados en capas específicas para recibir aportes presinápticas de los tipos y números correctos. Si bien la orientación axonal a las capas y columnas ha sido bien estudiado 3, 4, se sabe mucho menos acerca de cómo dendritas se encaminan a capas específicas y ampliar adecuadamente dimensionados campos receptivos para formar conexiones sinápticas con los socios correctos presináptica 5. La dificultad de formación de imágenes y la cuantificación de la orientación dendrítica de capas y columnas ha dificultado el estudio del desarrollo dendrítico en las estructuras cerebrales columnares y laminados.
Drosophila neuronas médula son un modelo ideal para el estudio de enrutamiento dendríticas y ensamblaje de circuitos en las columnas y capas. El neurópila mosca médula está organizada como una celosía en 3D de 10 capas y aproximadamente 750 columnas. Cada columna está inervado por un conjunto de fibras aferentes, incluyendo photoreceptors R7 / R8 y neuronas de la lámina L1 - L5, cuyos terminales axonal formar mapas topográficos de una manera específica de la capa 6. Alrededor de 38 tipos de neuronas medulares están presentes en cada columna de médula y dendritas elaboradas en capas específicas y con tamaños de los campos apropiados para recibir las aportaciones de estos aferentes 7. Los circuitos sinápticos en la médula se han reconstruido a nivel microscópico de electrones; por lo tanto, las asociaciones sinápticas están bien establecidos 7, 8. Además, herramientas genéticas para el etiquetado de diferentes tipos de neuronas médula están disponibles 9, 10, 11. Mediante el examen de tres tipos de transmedulla (TM), las neuronas (TM2, TM9 y TM20), hemos identificado previamente dos atributos de tipo celular específico dendríticas: (i) las neuronas se proyectan Tm dendritas, ya sea en la dirección anterior o posterior (proy planadirección reflexión), dependiendo de los tipos de células y (ii) dendritas de las neuronas médula terminar en capas médula específicos de una forma de células de tipo específico (terminación de capa específica) 12. Planar dirección de proyección y la terminación de capa específica son suficientes para diferenciar estos tres tipos de neuronas Tm, mientras que las mutaciones que alteran las respuestas de Tm a capa y columnas señales afectan a distintos aspectos de estos atributos.
A continuación, presentamos un flujo de trabajo completo para el examen de los patrones dendríticas de las neuronas medulares de Drosophila en columnas y capas (Figura 1). En primer lugar, se muestra un método de imagen de doble vista, que utiliza software personalizado para combinar dos imagen confocal pilas para generar imágenes isotrópicas de alta calidad. Este método requiere solamente la microscopía confocal convencional para generar imágenes de alta calidad que permitan el rastreo fiable de ramas dendríticas, sin recurrir a la super-resolución microscopía, como unas STED (emisión estimulada agotamiento) o iluminación estructural. En segundo lugar, se presenta un método para el seguimiento de los cenadores dendríticas y para el registro de las huellas resultantes de neuritas a una matriz columna de referencia. En tercer lugar, se muestran los métodos computacionales para la extracción de información en la dirección de proyección planar y la terminación de la capa específica de dendritas, así como para derivar estimaciones de ramificación y de terminación de frecuencias dendríticas. Juntos, estos métodos permiten la caracterización de patrones dendríticas en 3D, la clasificación de los tipos de células sobre la base de morfologías dendríticas, y la identificación de posibles defectos en los mutantes.
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Protocol
Nota: El protocolo contiene tres secciones: de doble punto de vista de imagen (secciones 1 - 3), el rastreo y registro dendríticas (secciones 4 - 6), y el análisis dendríticas (secciones 7 - 9) (Figura 1). Los códigos y archivos de ejemplo se proporcionan en la Tabla de Materiales / Equipos.
1. Adquisición de doble imagen
NOTA: Este paso está diseñado para adquirir dos pilas de imágenes de la neurona de interés en dos orientaciones ortogonal (horizontal y frontal).
- Prepare cerebros de moscas que contienen escasamente etiquetados neuronas médula (~ 10 células / lóbulo cerebro) con un marcador GFP membrana (mCD8GFP), como se describió anteriormente 12. Teñir el cerebro con conejo anti-GFP (por dendritas de las neuronas médula) y el ratón mAb24B10 (por axones fotorreceptoras), anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios fluorescentes (Alexa 488 anti-conejo y Alexa 568 anticuerpos anti-ratón), como se describió previamente13. Despeja el cerebro en el 70% de glicerol en PBS 1x.
- Para montar el cerebro en la orientación horizontal (Figuras 2A, B), transferir el cerebro de la mosca de glicerol-limpiado con una caída de 20 l de medio de montaje antidesvanecimiento en el centro de una diapositiva.
- Coloque pequeñas manchas de barro en las 4 esquinas del cubreobjetos para evitar el cubreobjetos de aplastar la muestra del cerebro durante el montaje.
NOTA: Las manchas de arcilla proporcionan una amortiguación para evitar el cubreobjetos de la molienda de la muestra. Cada parche de arcilla debe ser de aproximadamente 1 mm de diámetro. - Bajo un microscopio de disección, la posición de los cerebros en la posición ventral arriba y colocar el cubreobjetos en la parte superior para asegurar el cerebro. Utilice la superficie dorsal convexa del cerebro como un punto de referencia para identificar la orientación de la muestra de cerebro (Figura 2A).
- Obtener la primera pila de imágenes (visión horizontal) con un microscopio confocal. Utilice una lente de objetivo de alta NA (como un NA de glicerol o de inmersión en aceite 63X 1,3 objectivo lente) y 2,5 veces el zoom digital (el tamaño de píxel es 0,105 m por píxel; número de promedio es 2). Adquirir más de 180 secciones ópticas (512 x 512 píxeles) para cubrir el bulbo raquídeo neurópila con un tamaño de paso de 0,2 micras.
- Volver a montar el cerebro como se describe en los pasos 1.3 - 1.4, pero el cerebro alinear en la posición antero-up (vista frontal).
- Adquirir la segunda pila de imágenes (vista frontal) de la misma neurona, como se describe en el paso 1.5.
NOTA: Encontrar la misma neurona puede ser difícil cuando hay numerosas neuronas marcadas en el lóbulo óptico. Para identificar las mismas neuronas de ambas orientaciones, podrían ser necesarias de menor magnificación pilas de imágenes desde ambos puntos de vista (por ejemplo, utilizar un zoom de 0,7 y un tamaño de paso de 0,45 micras para adquirir pilas de imágenes de baja resolución). Si la imagen de más de 512 x 512, la imagen debe ser recortada a 512 x 512 antes de la combinación de imagen y el tamaño de píxel debe tener a 0.105 m por píxel, mientras que la formación de imágenes del campo grande. Pérdida de la señales un problema potencial para el tejido profundo. Si la señal es débil, la imagen de la media ventral del cerebro. Para reducir photobleaching durante la exploración, utilizar una fuente de láser lo más bajo posible. Utilice el indicador de alcance para comprobar si hay una sobreexposición antes de adquirir pilas de imágenes. Si es posible, utilice un microscopio confocal equipado con detectores de GaAsP. - Identificar y registrar la ubicación de la neurona de interés con respecto a la neurópila médula (derecha / izquierda [R / L] y dorsal / ventral [D / V]). Compruebe si la muestra se movió durante la adquisición de imágenes mediante el examen de la pila de imágenes.
NOTA: movimiento de la muestra es a menudo debido a un montaje inadecuado. Si se produce movimiento de la muestra, la pila de imagen no se puede utilizar para el registro y debe desecharse. Vuelva a montar la muestra y adquirir pilas de imágenes de la misma neurona.
Deconvolución 2. Imagen
NOTA: El paso de deconvolución utiliza la imagen del software de deconvolución para restaurar las imágenes adquiridas que se degradan difuminandoy el ruido. Si bien este paso es opcional, se mejora significativamente la calidad de imagen. Se recomienda el uso de pilas de imágenes deconvolved para el registro de imagen y combinación en la sección 3.
- Iniciar el programa de deconvolución en el modo interactivo. Cargar la pila de imagen (en formato de LSM o microscópica específica) seleccionando Menú: Archivo / Abrir (o Ctrl-O) en la ventana principal.
- Haga clic para seleccionar la imagen de pila cargada y elegir Menú: Operaciones para abrir la ventana de operación imagen. Usar el algoritmo predeterminado clásico estimación de máxima verosimilitud (CMLE).
- En la ventana de operación de imagen, haga clic en la pestaña "Parámetros". Introduzca los parámetros adecuados para el medio de inmersión de la lente, medio de inclusión y apertura numérica (por ejemplo, aceite, glicerina, etc.) (Por ejemplo, aceite de inmersión, etc.) (NA; aquí, se utilizó 1,3). Compruebe los parámetros restantes para asegurarse de que reflejen correctamente las condiciones de formación de imágenes. Haga clic en la pestaña "Configurar todas verificado" a la aletaAlize los ajustes de los parámetros.
- En la ventana de operación de imagen, haga clic en la pestaña "Operación". Asignar un destino de salida (por ejemplo, c). Introduzca un número adecuado de "señal / ruido por canal" (por ejemplo, "12 12 12 12" es un buen punto de partida, mientras que la configuración por defecto es "20 20 20 20"). Utilizar la configuración por defecto para los parámetros restantes.
- Haga clic en la pestaña "Ejecutar comando" para comenzar a deconvoluting la pila de imágenes; este proceso podría tomar hasta decenas de minutos en completarse, dependiendo del ordenador.
- En la ventana principal, haga clic y seleccione la imagen de pila deconvolved. Elija Menú: Guardar como para guardar la imagen deconvolved en el formato de archivo de imagen ICS (.ics y .ids).
NOTA: Cada pila de imágenes tiene dos archivos: el archivo ics contiene la información del encabezado y el archivo de las identificaciones contiene la información de la imagen en bruto.- Cambiar el nombre de los archivos de imagen Pila de acuerdo con la orientación de imágenes (por ejemplo, el nombre de la horizontal-s vista de la imagentachuelas H.ids y H.ics y el frontal-vista de la imagen pila F.ids y F.ics).
3.-vista dual Combinación de imágenes
Nota: Este paso combina dos imagen apila para generar imágenes de alta resolución en 3D utilizando el software de MIPAV.
- Generación de matrices para la combinación de imágenes.
- Iniciar el programa MIPAV. Cargar las pilas de imágenes H y F eligiendo Menú: Archivo / Abrir imagen (A) del disco (o Ctrl-f) /H.ids y F.ids; la ventana mostrará dos imágenes.
- Seleccione la imagen de H haciendo clic en la imagen y seleccione del menú: Utilidades / conversión / RGB / grises; la ventana mostrará GrayG, GrayB, y las imágenes GrayR.
- Cerrar GrayR y GrayB, sólo el mantenimiento de GrayG en la ventana.
- Seleccione la imagen F clicando en la imagen y selecciona Menú: Utilidades / conversión / RGB / Grises. La ventana mostrará GrayG1, GrayB1, y las imágenes GrayR1.
- Cerrar GrayR1 y GrayB1 y mantener sólo GrayG1 en la ventana. En este paso, solamente GrAYG y GrayG1 están en la ventana.
- Seleccione la GrayG (resaltar), elija Menú: Algoritmos / registro / inscripción automática de la imagen optimizada; el cuadro de diálogo "optimizado registro de la imagen 3D automático" pop-up.
- En las opciones de entrada, cambiar los "grados de libertad" de forma predeterminada "Afín-12" a "específico rescale-9". En clave de -105 a 105 en el "rango de muestreo" Ángulo de rotación "rotaciones" (por defecto: -30 a 30 grados), 10 en el "incremento de ángulo Grueso" (por defecto: 15 grados), y 3 en el "Fine ángulo de incremento "(por defecto: 6 grados).
- Haga clic en Aceptar; La primera matriz "GrayG_To_GrayG1.mtx" se genera y se guarda en la carpeta de imágenes. Cierre todas las ventanas de imagen y proceder al siguiente paso; este paso se tardará al menos 15 min.
- Cargar las pilas de imágenes H y F eligiendo Menú: Archivo / Abrir imagen (A) del disco (o Ctrl-f) /H.ids y F.ids, como en el paso 3.1.1.
- Seleccione la imagen de H haciendo clic en la imagen y seleccione del menú: Utilidades / conversión / RGB / gris; la "> RGB-Gray" cuadro de diálogo se abrirá. Haga clic en Aceptar; la ventana mostrará imágenes "HGray". Mantenga HGray y cerrar la imagen H.
- Repita el paso 3.1.9 para la imagen F; las imágenes "FGray" aparecerá en la ventana. Mantenga FGray y cerrar la imagen F; Sólo HGray y FGray serán dejados en la ventana.
- Seleccione la imagen HGray (resaltar) y vaya al menú: Herramientas Algoritmos / transformación / Transform. El cuadro de diálogo "Transformar / Remuestrear la imagen" pop-up. Haga clic en la pestaña "Volver a muestrear" y cambiar el tamaño de volver a muestrear a "HGray" a "FGray". A continuación, haga clic en la pestaña "Transform" y la carga "GrayG_To_GrayG1.mtx" mediante la selección de la "matriz Leer de archivo." Haga clic en Aceptar; la ventana mostrará la imagen HGray_transform. Cerrar la imagen HGray por lo que sólo HGray_transform y FGray se dejan en la ventana.
- Seleccione la opción "HGray_transform & #34; imagen (resaltar) y vaya a Menú: Algoritmos / registro / inscripción automática de la imagen optimizada. El cuadro de diálogo "optimizado registro de la imagen 3D automático" pop-up. En "Las rotaciones," llave en -5 a 5 en el "rango de muestreo ángulo de rotación" (por defecto: -30 a 30 grados), 3 en el "incremento de ángulo Grueso" (por defecto: 15 grados), y 1 en el "Fine ángulo de incremento "(por defecto: 6 grados). Haga clic en Aceptar.
NOTA: La Matriz afín (HGray_transform_To_FGray.mtx) se genera y se guarda en la carpeta de imágenes y la imagen "HGray_Transform_register" se mostrará en la ventana. Este paso se llevará al menos 40 min. - Cerrar la imagen "HGray_transform"; Sólo "HGray_Transform_register" y "FGray" se debe dejar en la ventana.
- Seleccione la opción "HGray_Transform_register" imagen (resaltar) y vaya a Menú: Algoritmos / Registro / B-spline automático del registro de 2D / 3D. La "B-spline automática Registroen 3D intensidad "cuadro de diálogo aparecerá. Seleccione" Least Squares "en la función de coste (el valor por defecto es la relación de correlación).
- Haga clic en "Realizar el registro de dos pasos". En la sección Paso 1, clave en 2 en "Desnivel Bajada Minimizar tamaño Paso (unidades de muestreo)" (el valor por defecto es 1) e introduzca 10 en el "máximo número de iteraciones:" (el valor predeterminado es 10). En la sección Paso 2, clave en 1 en "Desnivel Bajada Minimizar tamaño Paso (unidades de muestreo)" (el valor predeterminado es 0,5) e introduzca 2 en el "máximo número de iteraciones:" (el valor predeterminado es 10).
NOTA: La matriz NTV, "HGray_transform_register.nlt", se guardará en la carpeta de imágenes y la imagen "HGray_transform_register_registered" se mostrará en la ventana. Este paso se tardará al menos 5 min.
- Haga clic en "Realizar el registro de dos pasos". En la sección Paso 1, clave en 2 en "Desnivel Bajada Minimizar tamaño Paso (unidades de muestreo)" (el valor por defecto es 1) e introduzca 10 en el "máximo número de iteraciones:" (el valor predeterminado es 10). En la sección Paso 2, clave en 1 en "Desnivel Bajada Minimizar tamaño Paso (unidades de muestreo)" (el valor predeterminado es 0,5) e introduzca 2 en el "máximo número de iteraciones:" (el valor predeterminado es 10).
- Cierre todas las imágenes en la ventana.
- La generación de la imagen de referencia para la combinación de imágenes.
NOTA: Este paso está destinado a genercomió una imagen horizontal registrada para la combinación.- Cargar imagen F y H pilas seleccionando el menú: Archivo / Abrir imagen (A) del disco (o Ctrl-f) /H.ids y F.ids; dos imágenes van a aparecer en la ventana.
- Seleccione la imagen de H (resaltar) y vaya al menú: Herramientas Algoritmos / transformación / Transformación; el cuadro de diálogo "Transformar / Remuestrear la imagen" pop-up. Haga clic en la pestaña "Volver a muestrear" y cambiar el nuevo muestreo de un tamaño de "H" a "F" A continuación, haga clic en la pestaña "Transform" y la carga "GrayG_To_GrayG1.mtx" seleccionando la opción "Leer matriz a partir de archivos." Haga clic en Aceptar; la imagen H_transform aparecerá en la ventana. Cerrar la imagen H pero mantener H_transform y F en la ventana.
- Seleccione la opción "H_transform" imagen (resaltar) y vaya al menú: Herramientas Algoritmos / transformación / Transformación; el cuadro de diálogo "Transformar / Remuestrear la imagen" pop-up. Haga clic en la pestaña "Volver a muestrear" y cambiar el nuevo muestreo de un tamaño de "H_transform" a "F. & #34; A continuación, haga clic en la pestaña "Transform" y la carga "HGray_transform_To_FGray.mtx" seleccionando la opción "Leer matriz a partir de archivos." Haga clic en Aceptar; la imagen "H_transform_transform" aparecerá en la ventana. Cerrar la imagen H_transform; en este punto, sólo se H_transform_transform y F se pueden dejar en la ventana.
- Seleccione la opción "H_transform_transform" imagen (resaltar) y vaya al menú: Herramientas Algoritmos / transformación / Transformación no lineal; la caja "no lineal B-spline Transformación" de diálogo se abrirá. A continuación, la carga "HGray_transform_register.nlt" y haga clic en OK; la imagen "H_transform_transform_registered" aparecerá en la ventana. Guarda la imagen como un archivo ICS. Cierre todas las imágenes en la ventana.
- La combinación de pilas de imágenes
NOTA: Este paso es combinar dos pilas de imágenes adquiridas en orientaciones ortogonales (horizontales y frontales) en una pila de alta resolución.- Ir al Menú: Complementos / Genérico / Drosophila Retina Registrationl; el cuadro de diálogo "Drosophila Retina v2.9 Registro" se abrirá. Subir "H.ics" a la imagen de H, "H_transform_transform_registered" desde el paso 3.2.4 de la imagen ", F.ics" a la imagen F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" desde el paso 3.1.7 Transformación en 1-verde-H Registrado (opcional ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" de paso 3.1.12 en la Transformación 2-afines, y "HGray_transform_register.nlt" de paso 3.1.14 Transformación en 3-no lineal (opcional).
- Seleccionar sqrt (Intensidad-H x Intensidad-F) y n rescale en "Cambiar la escala de H F." Mantenga las opciones por defecto para los parámetros restantes. Haga clic en Aceptar; este paso se llevará a unos 3 minutos.
NOTA: Después del procesamiento, se generará 3 series de imágenes: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (la imagen recombinada final), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (canal verde de H, F, y la imagen recombinada final), y redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (canal rojo for H, F, y la imagen recombinada final); todos los archivos de salida se puede cambiar el tamaño de 512 x 512 x 512.
- Seleccionar sqrt (Intensidad-H x Intensidad-F) y n rescale en "Cambiar la escala de H F." Mantenga las opciones por defecto para los parámetros restantes. Haga clic en Aceptar; este paso se llevará a unos 3 minutos.
- Abiertos "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" bajo el software de visualización de imágenes. Guarde la pila de imágenes en el formato IMS y cambiar el nombre del archivo; este archivo de imagen recombinado será utilizado para el seguimiento de las neuritas y el registro.
- Ir al Menú: Complementos / Genérico / Drosophila Retina Registrationl; el cuadro de diálogo "Drosophila Retina v2.9 Registro" se abrirá. Subir "H.ics" a la imagen de H, "H_transform_transform_registered" desde el paso 3.2.4 de la imagen ", F.ics" a la imagen F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" desde el paso 3.1.7 Transformación en 1-verde-H Registrado (opcional ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" de paso 3.1.12 en la Transformación 2-afines, y "HGray_transform_register.nlt" de paso 3.1.14 Transformación en 3-no lineal (opcional).
4. Asignación de neuritas de referencias y envíos Point
NOTA: Este paso es neuritas (4.1) rastrear y asignar los puntos de referencia para el registro (4.2) utilizando el software de visualización de imágenes.
- rastreo de neuritas
- Iniciar el software de visualización de imágenes. Abra el archivo de imagen recombinado. Ir al Menú: Editar / Show de ajuste de visualización y apague el canal fotorreceptor (rojo).
- Visualizar la imagen en el modo de "Supera". Encienda "estéreo" y utilizar el modo "Quad Buffer" para visualizar imágenes en 3D si el ordenador está equipped con un sistema stereograph.
- Ir al Menú: Supera / Filamentos añadir nuevos filamentos. Haga clic en el "Saltar la creación automática, edite manualmente" ficha.
- Haga clic en la pestaña "Draw" y seleccione "AutoDepth."
- Seleccionar "Ajustes", consulte la sección "Línea", y la clave en un número de píxeles apropiado para una mejor visualización (una línea de 4 píxeles se utiliza en este protocolo). Comprobar los "dendritas", "Punto de Inicio" y "puntos de ramificación". Ajuste "calidad de procesamiento" al 100%.
- Seleccione la pestaña "Draw" y comenzar a remontar neuritas. Comenzar con el axón y luego pasar a las dendritas (Figura 2D). El axón y dendritas de las neuronas transmedulla son fáciles de diferenciar.
NOTA: Una neurona Tm se extiende su axón desde el cuerpo celular y proyecta todo el camino a la mayor centro de procesamiento visual, la lobula. El sistema definirá automáticamente el primer filamento siempre que un axón y los filamentos cortos restantes comodendritas. Mantener el punto de partida al comienzo del filamento (axón) durante el trazado y asegúrese de que las neuritas trazadas están conectados. Examinar los puntos de ramificación y el punto de inicio. Si las dendritas no están conectados, un nuevo punto de inicio se define en el filamento no conectado. - Después de trazar, volver a "Configuración" y desactive la casilla "punto de partida" y "Punto de ramificación," y vaya al menú: Supera / exportación Seleccionar objetos ../. Guarde el filamento como un archivo inventor (* .iv).
- La asignación de puntos de referencia
- Seleccione "Mostrar Pantalla de ajuste" y girar en ambos canales de imagen. En este ejemplo, el canal 1 es la tinción de los fotorreceptores y el canal 2 es la neurona TM20 (GFP).
- Ir al Menú: Supera / medición. Seleccione la pestaña "Editar" y marca "Canal específica:" (seleccionar el canal fotorreceptor [rojo]).
- Asignar puntos de referencia para la capa superior. Ir al Menú: / Supera / Medición PoiNTS para crear nuevos puntos de medición. Marcar el inicio de la capa M1 como una capa superior. El orden de los puntos es el siguiente: ecuatorial, ecuatorial-anterior, anterior, anterior-ventral, ventral, posterior-ventral, posterior, posterior-ecuatorial, y el centro (Figura 3F); definir el fotorreceptor centro que la asociada con los procesos más dendríticas.
- Asignar las capas R8 y R7 como en el paso 4.2.3 (Figura 3G). Tres puntos de medición individuales deben ser creados en los pasos 4.2.3 y 4.2.4.
- Exportar las coordenadas de los puntos para cada capa. Haga clic en la pestaña "Estadísticas", seleccione "detallada", "Valores específicos", y "Posición"; y haga clic en "Estadísticas de exportación de ficha Pantalla a archivo." Guardar como "Valores separados por comas" (* .csv).
- Abrir los tres archivos CSV (desde los pasos 4.2.3 - 4.2.4) y combinar las coordenadas de los 27 puntos de referencia en un nuevo archivo csv por copiar y pegar (THPara e es superior, R8, y R7). Ver los Materiales / Tabla Equipo y seguir el formato del archivo de ejemplo.
5. cuerpo rígido y TPS no lineal de registro
NOTA: Este paso es registrar las huellas de las neuritas (en formato iv) a la matriz de la columna de referencia y para generar un archivo SWC registrada utilizando el programa MIPAV. En esta sección se requiere los siguientes archivos: la pila de recombinada (.ids) de la etapa 3.3, el archivo de punto de referencia (.csv) de la etapa 4.2, y el archivo de rastreo de filamentos de neuritas (.iv) desde el paso 4.1.
- Ir al Menú: Complementos / Genérico / DrosophilaStandardColumnRegistration. La ventana "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" pop-up.
- Cargar los archivos de imagen (.ids), el archivo de puntos de referencia (.csv) y el archivo de filamento (.iv).
- Seleccione 9 puntos por capa.
- Seleccione la posición de la neurona con imagen (LV / RD o RV / LD).
- Seleccione "rígido Registroy TPS en "y" Registro rígido "para no lineal y el registro de cuerpo rígido, respectivamente.
- Verificación "Crear archivo SWC" para generar los archivos de salida siguiente: un archivo de rastreo de neuritas registrada en formato SWC (ver Materiales Específicos / Equipo para la definición), un archivo IV registrada (.iv), las coordenadas del neuritas estandarizada (.txt), coordenadas transformadas (.txt), y la imagen combinada (.ids).
- Cambie el nombre del archivo SWC. Aplicar la abreviatura de la ubicación para el final del nombre de archivo (paso 1.7). Por ejemplo, utilice "Tm20_3_RV.swc" para TM20 neurona # 3, en la mitad ventral de la médula derecha.
6. Normalización de configuración Haga ventral
NOTA: Este paso es convertir los restos de neuritas (en formato SWC) a la configuración estándar de RV (derecha-ventral) utilizando la secuencia de comandos personalizada "RV_standardization.m." En este caso, el guión fue escrito en el lenguaje de laboratorio matriz. losnombres de los archivos SWC de entrada deben estar en el siguiente formato: "NeuronName _ _ Número .swc de configuración" (por ejemplo, Tm20_3_LV.swc).
- Abra la secuencia de comandos "RV_standardization.m".
- Editar los siguientes parámetros en la sección "La entrada del usuario":
- Escriba los nombres de las neuronas sin numeración (por ejemplo, TM2, TM20, etc.) en "neuron_names."
NOTA: El valor por defecto en "file_end_in" es "* _ SWC,.", Que busca archivos con nombres que contienen ( "*" es un comodín número de caracteres) "* _ SWC.". El valor por defecto de "swc_file_end_out" es "_f.swc", que se sumarán "_f" al final del nombre de archivo después de la normalización. - Especificar el directorio donde los archivos SWC están en "directory_in". Especificar el directorio donde los archivos normalizados irán en "directory_swcout".
- Escriba los nombres de las neuronas sin numeración (por ejemplo, TM2, TM20, etc.) en "neuron_names."
- Ejecutar el script.
- Opcional: Uso Vaa3D 14 para visualizar los archivos SWC y validar la conversión.
7. Calcular ramificación dendrítica y que termina Frecuencias
NOTA: Este paso se utiliza de cuerpo rígido registrado archivos SWC para calcular los estimadores de Kaplan-Meier de la probabilidad de que un segmento dendrítico alcanzará una longitud determinada sin necesidad de terminar. Este script utiliza dos funciones: Dendritic_Tree_Toolbox extractDendriticSegmentLengthDistribution y estimateDendriticSegmentLengthProbability.
- Abra la secuencia de comandos "Branch_term_P.m".
- Editar los siguientes parámetros en la sección "La entrada del usuario":
- Especifique la ruta de los archivos SWC de cuerpo rígido registrados en "pathToSWCFiles" (por ejemplo, / Rigid_Registered_swc /). Especificar la ruta que llevará a cabo la salida de gráficos en "pathToOutput." Especifique el nombre de las neuronas o tipos neuronales en "neuron_names" (por ejemplo, TM2, Tm20, etc.).
- Ejecutar el script; las salidas son la curva de estimación de Kaplan-Meier de las ramificaciones dendríticas y terminación.
NOTA: Opcional: Aplicar el método de ajuste de la función de extraer de la estimadores de Kaplan-Meier la probabilidad local que el segmento dendrítico se bifurcará o terminar.
8. representar gráficamente la distribución de Terminación-capa específica de los cenadores dendríticas
NOTA: Este paso representa gráficamente la distribución de terminales dendríticas en diferentes capas de la médula como un gráfico de barras. Esto se puede aplicar a una neurona, un grupo de neuronas, o grupos de neuronas. La secuencia de comandos utiliza la función de extractDistributionAlongAxis Dendritic_Tree_Toolbox.
- Abra la secuencia de comandos "Layer_term.m".
- Editar los siguientes parámetros en la sección "La entrada del usuario":
- Especifique el directorio que contiene los archivos SWC no lineales registrada en "pathToSWCFiles" (por ejemplo, / Non_linear_Registered_swc /). Especifique el directorio de salida de gráficos en "pathToOutput." Especifique el nombre de las neuronas o tipos neuronales en "neuron_names" (por ejemplo, TM2, TM20, etc.).
- Ejecutar el script tutorial. La salida es un histograma de la proporción de nodos terminales en capas médula específicos.
9. Trazar la proyección dirección plana de dendritas
NOTA: Este paso representa los planos direcciones de proyección de las dendritas como un gráfico polar. La secuencia de comandos utiliza la función de extractAngularDistribution Dendritic_Tree_Toolbox.
- Abra la secuencia de comandos "Planar_proj.m."
- Editar los siguientes parámetros en la sección "La entrada del usuario".
- Especifique el directorio que contiene el no lineal archivos SWC registrados en "pathToSWCFiles" (por ejemplo, / Non_linear_Registered_swc /). Especificar el directorio para la salida gráfica en "pathToOutput." Especifique el nombre delas neuronas o tipos neuronales en "neuron_names" (por ejemplo, TM2, TM20, etc.).
- Ejecutar el script; la salida es un diagrama polar de direcciones de proyección planas.
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Representative Results
Uso de la vista de doble procedimiento de imagen que se presenta aquí, un cerebro de la mosca que contiene neuronas TM20 escasamente etiquetados fue fotografiada en dos direcciones ortogonales. Antes de la formación de imágenes, el cerebro se tiñeron con anticuerpos primarios y secundarios adecuados para la visualización de GFP y fotorreceptoras axones membrana anclada. Para formación de imágenes, el cerebro se montó primero en la orientación horizontal (Figura 2A, B). Una neurona TM20 GFP-etiquetados y los axones fotorreceptoras circundantes se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio confocal (Figura 3A). El cerebro se volvió a alineado (Figura 2A, B) y la misma neurona TM20 fue re-fotografiada en la orientación frontal (Figura 3B). Durante el proceso de formación de imágenes, la localización de la neurona TM20 se identificó como en el medio ventral de la médula neuropil derecha (configuración RV). Estas dos pilas de imágenes se deconvolved utilizando la imagen del software de deconvolución y recombined usando MIPAV (Figura 3C) para generar una imagen de pila recombinante (Figura 3C). La pila de imagen recombinante mostró una reducción significativa de la distorsión axial en comparación con cualquiera de pila de entrada (Figura 3A ', B').
Usando el software de visualización de imágenes, se trazaron el axón y dendritas de la neurona TM20 (Figura 3D) y se guardan como un archivo de Inventor (iv). 27 puntos de referencia en los axones fotorreceptoras que rodean la neurona TM20 fueron asignados (Figuras 3E - H) y se guardan como un archivo de valores separados por comas (CSV). Los archivos de las dendritas, la búsqueda y archivo de punto de referencia se aplicó posteriormente al plugin personalizado en MIPAV para generar trazas de dendritas de cuerpo rígido registrados y no registrados de forma lineal en formato de archivo SWC. Las huellas dendríticas registrados se convirtieron a la configuración estándar de RV usando el guión "RV_standardization.m". Tse registró y archivos de seguimiento dendríticas estandarizados se visualizaron usando Vaa3D para validar los procesos de registro y de normalización (Figura 3I).
Para el análisis dendríticas, registrada rastros dendríticas de las neuronas se recogieron 15 TM20 y 15 neuronas TM2. Usando el guión "Branch_term_P.m", la ramificación y que termina probabilidad de que estas neuronas se analizó mediante el cuerpo rígido de huellas registradas dendríticas (Figura 4A, B). Las curvas de Kaplan-Meier muestran que ambos tipos neuronales tienen ramificación similar y frecuencias de terminación. Sin embargo, Tm2 tiene una frecuencia de terminación más baja para los segmentos más largos (> 4 micras; Figura 4A) 12. Para el análisis de las propiedades dendríticas asociadas con capas y columnas, se utilizaron las huellas dendríticas registradas por el método de registro no lineal. Utilizando el script personalizado "Layer_term_P.m", la distribucións de la terminación dendrítica-capa específica para TM2 y TM20 se calcularon las neuronas (Figura 4 C, D). Las distribuciones distintas de las terminaciones de capa específica de TM2 y TM20 dendritas son consistentes con sus socios sinápticas específicas en diferentes capas: dendritas TM2 reciben aportaciones de terminales axonales L2 y L4 en M2 y M5, respectivamente, mientras que las dendritas TM20 reciben aportaciones de R8 y L3 en el M3 capa 8, 15, 16. Usando el guión "Planar_proj.m", se analizaron las direcciones de proyección planas de TM2 y TM20 dendritas y se encontró que eran distintas entre sí: Proyecto dendritas Tm2 posterior mientras que el proyecto anterior dendritas TM20 12 (Figura 4 E, F).
Figura 1. El flujo de trabajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Preparación de la muestra para Dual-vista de imagen y la simetría de la matriz de la columna Drosophila médula. (A, B) Ejemplo de montaje para visualización dual de formación de imágenes. (A) La vista se muestra como si estuviera viendo el cerebro a través de un cubreobjetos. (B) Diagramas esquemáticos para el montaje de la muestra. Para el horizonte de imagenTal pilas, el cerebro inmuno-manchado se monta por primera vez en la posición ventral plano. Tras la adquisición de la primera pila, el cerebro se vuelve a colocarse en posición anterior a punto para obtener imágenes de la pila frontal. A: anterior; P: posterior; D: dorsal; V: ventral; R: right; L: izquierdo. (C - E) La simetría y organización de la médula neuropil, visto en la posición frontal. (C) los axones fotorreceptoras, etiquetados por el anticuerpo 24B10 (rojo), se utilizan para visualizar la organización de la neuropil médula. La imagen se muestra como si estuviera mirando desde el exterior en el cerebro. Ant: anterior; Pos: posterior; Dor: dorsal; Ven: ventral; Eq: ecuador. (D) Una vista de gran aumento de (C) en cuatro cuadrantes de la neurópila médula a nivel de capa R7. Los terminales centrales R7 están marcadas por puntos amarillos. El anterior y ecuatorial R7s se marcan con puntos de color verde y cian, respectivamente. (E) Una representación esquemática de la co médulalumnar organización. Tenga en cuenta que las neuropils médula izquierda y derecha son imágenes espejo, y los dorsal y ventral mitades de cada neuropil también son imágenes especulares, separadas por el ecuador. Los puntos rojos indican R7s ecuatoriales, que son los primeros puntos de referencia. Los números (1 - 9) y las flechas indican el orden de asignación de puntos de referencia. Barra de escala: 15 micras de C; 5 micras en D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La recombinación Imagen y Asignación del punto de referencia. (A - C) Las imágenes confocales para una sola neurona TM20 adquirida en la horizontal (A) y las direcciones frontales (B). Las imágenes se muestran como proyecciones de máxima intensidad. fotorreceptor axones y una sola TM20 neuron están etiquetados con el anticuerpo Mb24B10 (rojo) y la membrana de atado GFP (verde), respectivamente. (C) recombinado imagen de (A, rojo) y (B, cian). Para mayor claridad, sólo se muestran los fotorreceptores. (A '- C') de doble proyección de imagen mejora la resolución axial. La imagen recombinada (A ') tiene una resolución mejor que los de la horizontal a la vista (A') y frontal-view (B ') imágenes. paneles inferiores: vistas de gran aumento de las áreas enmarcadas en los paneles superiores. (D) Determinación de la axón (blanco) de una sola neurona TM20. El punto de inicio se indicó como un punto cian. (E) Los 27 puntos de referencia (puntos blancos) en los axones 9 fotorreceptoras que rodean a las neuronas TM20 se utilizan como puntos de referencia. Los puntos de referencia están en tres capas: Arriba, R8 y R7. Asignación de punto (F) de referencia en cada capa. La asignación de punto de referencia sigue el fol orden si-: ecuador (Eq), anterior-ecuador (AE), anterior (A), anterior-ventral (AV), ventral (V), posterior-ventral (PV), posterior (P), posterior-ecuador (PE) , y el centro (C). (G) Una representación esquemática de la matriz de columna de médula utilizada para el registro. Se muestra una neurona TM20 (verde). Las capas de médula (M1-6) son como se indica. (H) Un ejemplo de capa y asignación de punto de referencia para una sola columna. Tres capas se utilizan para definir cada columna: Top, R8, y R7 (la unión de las capas M5 / 6). (I) Un rastro registrado y visualizado utilizando neuritas estandarizada Vaa3D. Barra de escala: 5 micras de A para AC; 5 micras de A 'para A'-C'; 5 micras de D, E, F y G. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 4. Ejemplos de resultados de análisis dendríticas. (A, B) las estimaciones de Kaplan-Meier (eje y) de las ramificaciones dendríticas (A) y de terminación (B) se representa en escala logarítmica con respecto a la longitud del segmento (eje x). Las líneas continuas y discontinuas representan las medias ± desviaciones estándar. Tm2 (rojo) y TM20 (negro) comparten ramificación similar y frecuencias de terminación para los segmentos de menos de 4 micras. (C, D) se presentan histogramas de la proporción media de los nodos terminales dendríticas en cada capa de la médula (M). La proporción de los nodos terminales en una capa de médula determinado se calcula primero para cada neurona de un tipo dado y luego como media de todas las neuronas de ese tipo. Las barras verticales muestran la desviación estándar de la proporción. Tenga en cuenta que para las neuronas TM2 (C), la distribución de los nodos terminales dendríticas se concentra en la capa de médula 2, con un pico menor en la capa 5, mientras que para Tm 20 neuronas(D), la distribución se centra en las capas M2 y M3. (E, F) parcelas polares de la dirección de proyección planar de las dendritas. La proporción de los nodos terminales proyectados dentro de un bin angular (20 °) se calculó en primer lugar para cada neurona de un tipo dado y luego como media de todas las neuronas de ese tipo. Las curvas rojas y azules muestran la proporción media ± desviación estándar. Las esquinas de las curvas son los puntos medios de los intervalos angulares. Los círculos negros muestran los valores proporción indicada por el numeral negro a su lado. Tenga en cuenta que, en promedio, las dos clases de neuronas están orientados en direcciones casi opuestas. A: anterior; P: posterior; D / V: dorsal / ventral; Eq: ecuador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, se muestra cómo reproducir y analizar los árboles dendríticos de neuronas medulares de Drosophila. En la primera sección, de doble punto de vista de imagen, se describe la deconvolución y la combinación de dos pilas de imágenes en una pila de imágenes de alta resolución. La segunda sección, el trazado de las dendritas y el registro, se describe el rastreo y registro de las dendritas de las neuronas medulares en la matriz de la columna de referencia. En la tercera sección, el análisis dendríticas, describe el uso de scripts personalizados para analizar los patrones dendríticas. En conjunto, estos protocolos proporcionan un flujo de trabajo completo para extraer información sobre los patrones dendríticas con respecto a las capas y columnas, y para determinar las ramificaciones dendríticas y las frecuencias de terminación.
El método de imagen de doble vista que aquí se presenta es conceptualmente similar a las técnicas de imagen de vistas múltiples implementadas con microscopios de luz de hoja, en la que dos o más pilas de imágenes de forma ortogonal recogidos son recombinados para lograr una alta resolutio axialn 17, 18. Sin embargo, es técnicamente difícil de implementar ortogonalmente las dos lentes de objetivo de alto NA (apertura numérica) que se requieren para obtener imágenes de dendritas delgados. Por lo tanto, el método de doble vista requiere obtener imágenes de la misma muestra de cerebro en dos pasos consecutivos y volver a orientar la muestra entre imágenes. Las fallas en la combinación de imagen son causados probablemente por el movimiento de la muestra durante la exploración o el aplastamiento de la muestra durante la manipulación. Además, aunque el proceso de la imagen recombinación mitiga el problema de la distorsión axial y da como resultado una resolución casi isotrópica, las imágenes recombinadas están aún en un límite de difracción. Nuestro método de imagen de doble vista sólo necesita microscopía confocal estándar, que está ampliamente disponible. Sin embargo, la microscopía de super-resolución, tales como la iluminación STED o estructura, si está disponible, sería una excelente alternativa al método de imagen de doble vista aquí presentes.
lossección de rastreo y registro de las dendritas que aquí se presenta traza árboles dendríticas y registra árboles dendríticas a la matriz de la columna de referencia. En este protocolo, el Imaris programa comercial se utiliza para el rastreo semiautomático de dendritas y para la asignación de puntos de referencia. Tareas similares podrían llevarse a cabo utilizando una serie de alternativas de dominio público, tales como NeuronJ 19, 20 y neuritas trazador 21. Nuestro protocolo de registro utiliza un plugin personalizado implementado en el MIPAV programa de código abierto para registrar huellas de dendritas a la matriz de la columna de referencia. A nuestro entender, este método de registro es el único método que registra huellas de neuritas a columnas y capas. Este procedimiento utiliza dispuestos regularmente fotorreceptor axones como puntos de referencia para el registro. Las huellas dendríticas generadas por el método de registro no lineal son ideales para la extracción de información sobre los patrones dendríticas relacionados con columnas y capas. En el otroparte, el método de registro de cuerpo rígido alinea los ejes cartesianos de huellas dendríticas a los ejes cardinales de la neuropil sin cambiar las longitudes dendríticas u otras propiedades geométricas locales. Por lo tanto, el cuerpo rígido registrado trazas dendríticas son adecuados para los análisis morfométricos estándar.
Análisis morfométrico dendríticas tradicionales, tales como L-22 medida, caracteriza las propiedades dendríticas locales y globales sin hacer referencia a los tejidos circundantes. Hemos demostrado anteriormente que muchas neuronas médula comparten propiedades geométricas dendríticas y que tales parámetros no son suficientes para diferenciar tipos de neuronas medulares 12. En su lugar, los atributos específicos del tipo dendríticas están asociados directamente con las capas y columnas donde residen las dendritas. En particular, los diferentes tipos de neuronas proyectan médula dendritas en direcciones planas distintas capas que terminan en la médula específicos. Estos dos atributos dendríticas reflect la función dendrítica de las neuronas aferentes médula para recibir dirigidas retinotopically organizados en capas y columnas. Para facilitar la extracción de estas propiedades, hemos desarrollado la caja de herramientas del árbol dendrítico que contiene una serie de funciones personalizadas para el cálculo de propiedades dendríticas. En la sección de análisis dendríticas, se muestra cómo estas funciones pueden ser aplicadas a las trazas dendríticas registrados para calcular la distribución de la terminación de la capa específica y direcciones de proyección planar de dendritas.
La caja de herramientas del árbol dendrítico proporciona una plataforma para añadir otras funciones personalizadas para el análisis dendríticas. En la sección de análisis dendríticas, también se describe el proceso para derivar estimaciones de terminación dendríticas aparente y frecuencias de ramificación. En particular, estas funciones calcular las frecuencias de ramificación y que terminan en base a un estimador no paramétrico de Kaplan-Meier para la probabilidad de que un segmento dendríticas se extenderá a un cierto length sin ramificación o de terminación 12, 23. Es importante tener en cuenta que el cuerpo rígido registrado (pero no las no lineal registrados) trazas dendríticas se debe utilizar para este cálculo debido a que el proceso de registro no lineal altera longitudes de segmento dendríticas. Las ramificaciones dendríticas y terminación de frecuencias son la primera derivada (la pendiente) de las curvas de KM y se pueden calcular utilizando el método de ajuste de función. Además, el cálculo preciso de la ramificación y las frecuencias que terminan a menudo requiere un conjunto de datos de tamaño considerable (> 10 neuronas de neuronas TM) porque las neuronas individuales sólo tienen un número relativamente pequeño de segmentos dendríticas. En los ejemplos proporcionados, Tm2 y TM20 tienen ramificación similar y frecuencias de terminación, pero la frecuencia de ramificación Tm2 no es homogéneo a través de la ramificación de longitud, un rasgo característico de Tm2 dendritas 12.
Mientras que nuestros protocolosestán diseñados para las neuronas médula de Drosophila, que se pueden adaptar para analizar otras neuronas que las dendritas elaboradas en capas y columnas, tales como otros lóbulos ópticos de Drosophila y la retina de los vertebrados y en la corteza. Tales adaptaciones requerirían la construcción de una nueva matriz columna de referencia basado en el sistema de interés 12, así como las modificaciones de menor importancia del plugin MIPAV. Ofrecemos todos nuestros programas como software de código abierto para promover la colaboración y el intercambio.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Salud Infantil y Desarrollo Humano (subvención HD008913 a C-HL), y el Centro de Tecnología de la Información (PGM, NP, ESM y MM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | version 16.05 | for image deconvolution (https://svi.nl). commercial software |
| MIPAV | version 7.3.0 | for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware | |
| MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class |
freeware | ||
| MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class |
freeware | ||
| Imaris | Bitplane | for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software | |
| Vaa3D | for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware | ||
| Matlab | Mathworks | R2014b | for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software |
| Matlab toolbox: TREES1.14 | v1.14 | for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware | |
| Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox | v1.0 | For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Sample files | |||
| SWC file definition | http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html | ||
| The codes and sample files for image combination and registration | https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration | ||
| Reference point example | https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2 |
||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Computer system | |||
| MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later | 3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal) | ||
| Optional: Quadro4000 (or above) graphic card | Nvidia | for stereographic visualization of dendrites. | |
| Optional: NVIDIA 3D vision2 | Nvidia | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html | |
| Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2 | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html | ||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Reagents for imaging | |||
| 24B10 antibody | The Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
| GFP Tag Antibody | Thermofisher Scientific | G10362 | |
| Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermofisher Scientific | A11034 | |
| Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568 | Thermofisher Scientific | A21124 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mounting Clay | Fisher | S04179 | |
| 70% glycerol in 1x PBS | |||
| Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9000-000 |
References
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