Analysera Dendritic morfologi i kolumner och lager

Summary

Här visar vi hur man analyserar dendritiska dirigering av Drosophila medulla neuroner i kolumner och skikt. Arbetsflödet innehåller en dubbel-view bildteknik för att förbättra bildkvaliteten och beräkningsverktyg för att spåra, registrera dendritiska hållare till referens kolumnen array och för att analysera de dendritiska strukturer i 3D-rymden.

Abstract

I många regioner i det centrala nervsystemet, såsom fly optiska loberna och ryggradsdjur cortex är synaptiska kretsar anordnas i skikt och kolumner för att underlätta hjärnans ledningar under utveckling och informationsbehandling i utvecklade djur. Postsynaptiska neuroner arbetade Dendrites i typspecifika mönster i särskilda lager för att synaps med lämpliga presynaptiska terminaler. Flugan förlängda neuropil består av 10 lager och cirka 750 kolumner; varje kolumn innerveras av dendriter på över 38 olika typer av medulla neuroner, som matchar med axonal terminaler cirka 7 typer av afferenter i en typ-specifikt sätt. Denna rapport redovisar de förfaranden som bild och analysera dendriter av medulla nervceller. Arbetsflödet innehåller tre delar: (i) bildsektionen dual-view kombinerar två konfokala bildstaplar som samlats på ortogonala orienteringar i en hög upplösning 3D-bild av dendriter; (Ii) Dendrite spåra och registrering avsnitt spår dendritiskahållare i 3D och registrerar dendritiska spår till referens kolumnen array; (Iii) den dendritiska analys avsnitt analyseras dendritiska mönster med avseende på kolumner och skikt, inklusive lager specifika terminering och planprojektionsriktningen av dendritiska hållare, och härleder uppskattningar av dendritiska förgrening och termineringsfrekvenser. Protokollen utnyttjar anpassade plugins som bygger på öppen källkod MIPAV (Medical Imaging Processing, analys och visualisering) plattform och anpassade verktygslådor i matrisen laboratorie språk. Tillsammans dessa protokoll ger en komplett arbetsflöde för att analysera den dendritiska dirigering av Drosophila medulla neuroner i skikt och kolumner för att identifiera celltyper, och för att bestämma defekter i mutanter.

Introduction

Under utveckling, neuroner arbetade Dendrites i komplexa men stereotypa grenade mönster bildar synapser med sina presynaptiska partner. Dendritiska förgrening mönster korrelerar med neuronal identitet och funktioner. Platserna för dendritiska hållare avgöra vilken typ av presynaptiska ingångar de får, medan dendritiska förgrening komplexitet och fältstorlek styr ingångsnummer. Således, dendritiska morfologiska egenskaper har en avgörande betydelse för synaptiska uppkoppling och neuronal beräkning. I många regioner i komplexa hjärnor, såsom fly optiska loberna och ryggradsdjur näthinnan, är synaptiska kretsar organiserade i kolumner och lager för att underlätta informationsbehandling ^{1, 2.} I en sådan kolonn och skikt organisation, till presynaptiska neuroner på en avgränsad modalitet projekt axoner slutar vid ett visst lager (s k skiktet specifik inriktning) och bilda en ordnad två-dimensionell array (så called topografisk karta), medan postsynaptiska neuroner sträcker dendriter av lämplig storlek i särskilda lager för att få presynaptiska ingångar rätt typer och siffror. Medan axonal inriktning på lager och kolumner har studerats ^{3, 4,} är mycket mindre känt om hur dendriter dirigeras till specifika skikt och expandera lämplig storlek receptiva fält för att bilda synaptiska kontakter med rätt presynaptiska partner ^5. Svårigheten att avbildning och kvantifiering av dendritiska inriktning på lager och kolumner har hindrat studiet av dendritiska utveckling i kolonn och laminerade hjärnstrukturer.

Drosophila medulla nervceller är en idealisk modell för att studera dendritiska routing och kretsenheten i kolumnerna och lager. Flugan förlängda neuropil är organiserat som en 3D-gitter av 10 lager och cirka 750 kolumner. Varje kolumn innerveras av en uppsättning av afferenter, inklusive photoreceptors R7 / R8 och lamina neuroner L1 - L5, vars axonal terminaler bildar topografiska kartor i ett lager-specifikt sätt ^6. Cirka 38 typer av medulla neuroner förekommer i varje förlängda kolonn och genomarbetade dendriter i specifika skikt och med lämplig storlek fält att ta emot insignaler från dessa afferenter ^7. De synaptiska kretsar i märgen har rekonstruerats på elektronmikroskopnivå; sålunda är de synaptiska partnerskap väletablerat ^{7, 8.} Vidare genetiska verktyg för märkning av olika typer av medulla nervceller är tillgängliga ^{9, 10, 11.} Genom att undersöka tre typer av transmedulla (TM) neuroner (Tm2, TM9 och TM20), har vi tidigare identifierat två cell typspecifika dendritiska egenskaper: (i) Tm neuroner skjuter dendriter i antingen den främre eller bakre riktningen (plan projektion riktningen), beroende på de celltyper och (ii) dendriterna i medulla neuroner slutar i specifika medulla skikt i en cell-typ-specifikt sätt (skikt-specifik terminering) ^12. Planprojektion riktning och lager specifika terminering är tillräckliga för att skilja mellan dessa tre typer av Tm neuroner, medan mutationer som stör Tm svar på lager och kolumn ledtrådar påverkar olika aspekter av dessa attribut.

Här presenterar vi ett komplett arbetsflöde för att undersöka dendritiska mönstring av Drosophila medulla neuroner i kolumner och skikt (Figur 1). Först visar vi en dubbel-view avbildningsmetod, som använder anpassad programvara för att kombinera två konfokala bild stackar att generera isotropa bilder av hög kvalitet. Denna metod kräver endast konventionell konfokalmikroskopi att generera bilder med hög kvalitet som möjliggör tillförlitlig spårning av dendritiska grenar, utan att tillgripa superupplösning mikroskopi, en sådans STED (stimulerad emission Utarmning) eller strukturell belysning. För det andra presenterar vi en metod för att spåra dendritiska hållare och för att registrera de resulterande neurite spår till en referenskolonn array. För det tredje visar vi de datormetoder för att extrahera information om den plana projektionsriktningen och skiktet specifika uppsägning av dendriter, samt för att härleda skattningar för dendritiska förgrening och termineringsfrekvenser. Tillsammans utgör dessa metoder gör det möjligt att karakterisera dendritiska mönster i 3D, klassificeringen av celltyper baserade på dendritiska morfologier, och att identifiera potentiella brister i mutanter.

Protocol

Obs: Protokollet innehåller tre delar: dual-view imaging (avsnitt 1 - 3), dendritiska spårning och registrering (avsnitt 4 - 6), och dendritiska analys (avsnitt 7 - 9) (Figur 1). Koderna och exempelfiler finns i Tabell över Materials / utrustning.

1. dubbla bildtagning

OBS: Detta steg är utformad för att förvärva två bild staplar av neuron av intresse i två ortogonala (horisontella och frontala) riktlinjer.

1. Förbereda gylf hjärnor som innehåller glest märkta medulla neuroner (~ 10 celler / hjärna lobe) med ett membran GFP markör (mCD8GFP), såsom tidigare beskrivits ^12. Fläcka hjärnan med kanin-anti-GFP (till medulla neuron dendriter) och mus mAb24B10 (för fotoreceptor axoner), primära antikroppar, och fluorescerande sekundära antikroppar (Alexa 488 anti-kanin och Alexa 568-anti-mus-antikroppar), såsom beskrivits tidigare13. Rensa hjärnan i 70% glycerol i 1x PBS.
2. För att montera hjärnan i horisontellt läge (figurerna 2A, B), överföra glycerol-rensas fly hjärnan till en 20 mikroliter droppe av antifade monteringsmedium i mitten av en bild.
3. Fäst små fläckar av lera på 4 hörnen av täck att förhindra att täck från krossa hjärnan provet under montering.
   OBS! Lera patchar ge dämpning för att förhindra att täck från krossa provet. Varje lera plåster bör vara ca 1 mm i diameter.
4. Under ett dissektionsmikroskop, positionera hjärnorna i ventrala-up position och placera täckglaset ovanpå för att säkra hjärnan. Använda den konvexa dorsala ytan av hjärnan som ett landmärke för att identifiera orienteringen av hjärnan provet (Figur 2A).
5. Få den första bildstapel (horisontell vy) med en konfokalmikroskop. Använda en hög-NA objektivlins (såsom en 63X 1,3 NA glycerol eller oljeimmersion OBJEctive lins) och 2,5X digital zoom (pixelstorleken är 0,105 um per pixel, medelvärdes nummer är 2). Förvärva mer än 180 optiska sektioner (512 x 512 pixlar) för att täcka märgen neuropil med en steglängd på 0,2 pm.
6. Montera hjärnan som beskrivs i steg 1,3 - 1,4, men rikta hjärnan i anterior-up läge (frontvy).
7. Förvärva den andra bildstapel (frontvy) av samma neuron, såsom beskrivs i steg 1,5.
   OBS: Att hitta samma neuron kan vara en utmaning när det finns många neuroner märkta i synnerven lob. Att identifiera samma nervceller från båda riktningarna, kan lägre förstoring bildstaplar från båda vyerna krävas (till exempel använda en zoom på 0,7, och en steglängd av 0,45 um till förvärva lågupplösta bildstaplar). Om bilden är större än 512 x 512, bör bilden att beskäras till 512 x 512 innan bild kombination, och pixelstorleken bör hålla på 0,105 um per pixel medan avbildning det stora fältet. Signalförlustär ett potentiellt problem för djup vävnad. Om signalen är svag, bilden den ventrala delen av hjärnan. För att minska fotoblekning under avsökning använder så låg lasereffekt som möjligt. Använd indikator intervallet för att kontrollera om överexponering innan förvärva bildstaplar. Använd om möjligt en konfokalmikroskop utrustad med Gaasp detektorer.
8. Identifiera och registrera placeringen av neuron av intresse med avseende på medulla neuropil (höger / vänster [R / L] och rygg / ventrala [D / V]). Kontrollera om provet flyttas under bildtagning genom att undersöka bildstapel.
   OBS: Prov rörliga beror ofta på felaktig montering. Om prov rörelse sker, kan bildstapel inte användas för registrering och skall kasseras. Åter montera provet och förvärva bildstaplar från samma neuron.

2. Bild Deconvolution

OBS! Avfaltning steget använder bild avfaltning programvara för att återställa de förvärvade bilder som bryts ned genom att suddaoch buller. Även om detta steg är valfritt, avsevärt förbättrar det bildkvalitet. Det rekommenderas att använda dekonvolvering bildstaplar för bildregistrering och kombination i avsnitt tre.

1. Starta avfaltning programmet i interaktivt läge. Ladda bildstapel (i LSM eller specifik mikroskopisk format) genom att välja Meny: Arkiv / Öppna (eller Ctrl-o) i huvudfönstret.
2. Markera den inlästa bilden stapeln och väljer Meny: Ops för att öppna bildoperation fönstret. Använd standard Classic Maximum Sannolikheten Uppskattningen (CMLE) algoritm.
3. Vid drift fönstret bild, klicka på fliken "Parameters". Ange lämpliga parametrar för lins nedsänkning mediet, bädda medium och numerisk bländare (t.ex. olja, glycerin, etc.) (T.ex. immersionsolja, etc.) (NA, här var 1,3 används). Kontrollera de återstående parametrarna för att säkerställa att de korrekt återspeglar bildförhållanden. Klicka på fliken "Ställ alla verifieras" till finAlizé parameterinställningarna.
4. Vid drift fönstret bilden, klicka på "Operation" -fliken. Tilldela en utgång destination (t.ex. c). Ange lämpligt antal i "Signal / brus per kanal" (t.ex. "12 12 12 12" är en bra utgångspunkt, medan standardinställningen är "20 20 20 20"). Använd standardinställningar för övriga parametrar.
5. Klicka på fliken "Kör kommando" för att starta deconvoluting bildstacken; Denna process kan ta upp till tiotals minuter att slutföra, beroende på datorn.
6. I huvudfönstret klickar du och väljer dekonvolvering bildstapel. Välj Meny: Spara som för att spara dekonvolvering bilden i ICS bildfilsformat (ICS och .ids).
   OBS: Varje bildstapel har två filer: ICS-filen innehåller rubrikinformation och ids filen innehåller den råa bildinformation.
   1. Byt namn på bildstapel filer enligt bildorienteringen (t.ex. namnge horisontella-view bild snubb H.ids och H.ics och front-view bildstapel F.ids och F.ics).

3. Dual-view Image Kombination

Obs: Detta steg kombinerar två bild stackar att generera högupplösta 3D-bilder med hjälp av MIPAV programvara.

1. Generera matriser för bild kombination.
   1. Starta MIPAV programmet. Ladda H- och F-bildstaplar genom att välja Meny: Arkiv / Öppna bild (A) från disk (eller Ctrl-f) /H.ids och F.ids; fönstret kommer att visa två bilder.
   2. Välj H bilden genom att klicka på bilden och välj Meny: Verktyg / konverteringsverktyg / RGB / Grays; fönstret visar GrayG, GrayB och GrayR bilder.
   3. Stäng GrayR och GrayB, endast hålla GrayG på fönstret.
   4. Välj F bilden genom att klicka på bilden och välj Meny: Verktyg / konverteringsverktyg / RGB / Grays. Fönstret visar GrayG1, GrayB1 och GrayR1 bilder.
   5. Nära GrayR1 och GrayB1 och hålla bara GrayG1 på fönstret. I detta steg, endast GrayG och GrayG1 är på fönstret.
   6. Välj GrayG (markera), välj Meny: Algoritmer / Registrering / Optimerad automatisk bildregistrering; "Optimerad automatisk bildregistrering 3D" dialogruta dyker upp.
      1. I inmatningsalternativ, ändra "Frihetsgrader" från default "Affine-12" till "Specific Rescale-9." I "Rotations," nyckeln i -105 till 105 i "Rotationsvinkel provtagning intervall" (standard: -30 till 30 grader), 10 i "Grov vinkelsteg" (default: 15 grader), och 3 i "Fine vinkelsteg "(default: 6 grader).
   7. Klicka på OK; den första Matrix "GrayG_To_GrayG1.mtx" kommer att genereras och sparas i bildmappen. Stäng alla bild fönstren och gå vidare till nästa steg; detta steg kommer att ta minst 15 minuter.
   8. Ladda H- och F-bildstaplar genom att välja Meny: Arkiv / Öppna bild (A) från disk (eller Ctrl-f) /H.ids och F.ids, som i steg 3.1.1.
   9. Välj H bilden genom att klicka på bilden och välj Meny: Verktyg / konverteringsverktyg / RGB / Gray; den "RGB-> Gray" dialogruta dyker upp. Klicka på OK; fönstret kommer att visa "HGray" bilder. Håll HGray och stänga H bilden.
   10. Upprepa steg 3.1.9 för F bild; de "FGray" bilder visas på fönstret. Håll FGray och stänga F bild; Endast HGray och FGray kommer att finnas kvar i fönstret.
   11. Välj HGray bild (markera) och gå till Meny: Algoritmer / Transformation verktyg / Trans. Den "Trans / Ändra bildupplösning" dialogruta dyker upp. Klicka på "Resample" -fliken och ändra sampla storleken på "HGray" till "FGray". Klicka sedan på "Transform" -fliken och last "GrayG_To_GrayG1.mtx" genom att välja "Läs matris från filen." Klicka på OK; fönstret visar HGray_transform bilden. Stäng HGray bilden så bara HGray_transform och FGray är kvar på fönstret.
   12. Välj "HGray_transform & #34; bild (markera) och gå till Meny: Algoritmer / Registrering / Optimerad automatisk bildregistrering. "Optimerad automatisk bildregistrering 3D" dialogruta dyker upp. I "Rotations" nyckeln i -5 till 5 i "Rotationsvinkel provtagning intervall" (default: -30 till 30 grader), 3 i "Grov vinkelsteg" (default: 15 grader), och en i "Fine vinkelsteg "(default: 6 grader). Klicka på OK.
       OBS: Affine Matrix (HGray_transform_To_FGray.mtx) kommer att genereras och sparas i mappen bilden och den "HGray_Transform_register" bilden kommer att visas på fönstret. Detta steg kommer att ta minst 40 min.
   13. Stäng "HGray_transform" bild; endast "HGray_Transform_register" och "FGray" bör överlåtas på fönstret.
   14. Välj "HGray_Transform_register" bild (markera) och gå till Meny: Algoritmer / Registrering / B-Spline automatisk registrering 2D / 3D. "B-Spline Automatisk Registrerapå 3D intensitet "dialogruta dyker upp. Välj" Least Squares "i kostnadsfunktionen (standard är Korrelation Ratio).
       1. Klicka på "Utför två-pass registrering". I Pass ett avsnitt nyckel i två till "Gradient Descent Minimera Stegstorlek (delprov)" (standard är 1) och knappa in 10 in "Maximum antal iterationer" (standard är 10). I Pass två avsnitt, skriv in en till "Gradient Descent Minimera Stegstorlek (delprov)" (standard är 0,5) och knappa in 2 i "Max antal iterationer" (standard är 10).
          OBS: NLT matris "HGray_transform_register.nlt," kommer att sparas i bildmappen och "HGray_transform_register_registered" bilden visas i fönstret. Detta steg kommer att ta minst fem minuter.
   15. Stäng alla bilder i fönstret.
2. Generering av referensbilden för bildkombination.
   OBS: Detta steg är tänkt att Generåt ett registrerat horisontell bild för kombination.
   1. Last H och F bildstaplar genom att välja Meny: Arkiv / Öppna bild (A) från disk (eller Ctrl-f) /H.ids och F.ids; två bilder kommer att visas i fönstret.
   2. Välj H bilden (markera) och gå till Meny: Algoritmer / Transformation verktyg / Trans; den "Trans / Ändra bildupplösning" dialogruta dyker upp. Klicka på "Resample" -fliken och ändra sampla från en storlek på "H" till "F." Klicka sedan på "Transform" -fliken och last "GrayG_To_GrayG1.mtx" genom att välja "Läs matris från filen." Klicka på OK; den H_transform bilden visas i fönstret. Stäng H bilden men behålla H_transform och F i fönstret.
   3. Välj "H_transform" bild (markera) och gå till Meny: Algoritmer / Transformation verktyg / Trans; den "Trans / Ändra bildupplösning" dialogruta dyker upp. Klicka på "Resample" -fliken och ändra sampla från en storlek på "H_transform" till "F. & #34; Klicka sedan på "Transform" -fliken och last "HGray_transform_To_FGray.mtx" genom att välja "Läs matris från filen." Klicka på OK; den "H_transform_transform" bilden visas i fönstret. Stänga H_transform bild; vid denna punkt, kommer endast H_transform_transform och F lämnas kvar på fönstret.
   4. Välj "H_transform_transform" bild (markera) och gå till Meny: Algoritmer / Transformation verktyg / Trans olinjär; den "Nonlinear B-Spline Transformation" dialogruta dyker upp. Därefter last "HGray_transform_register.nlt" och klicka på OK; den "H_transform_transform_registered" bilden visas i fönstret. Spara bilden som en ICS-fil. Stäng alla bilder i fönstret.
3. Kombinera bildstaplar
   OBS: Detta steg är att kombinera två bildstaplar som förvärvats i ortogonala riktningar (horisontellt och frontala) i en hög upplösning stack.
   1. Gå till Meny: Plugins / Generic / Drosophila retinal Registrationl; den "Drosophila näthinnan Registration v2.9" dialogruta dyker upp. Ladda upp "H.ics" i bilden H "H_transform_transform_registered" från steg 3.2.4 i Bild H-registrerade "F.ics" i Bild F "GrayG_To_GrayG1.mtx" från steg 3.1.7 i Transformation 1-Green (tillval ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" från steg 3.1.12 i Transformation 2-Affine och "HGray_transform_register.nlt" från steg 3.1.14 i Transformation 3-Nonlinear (tillval).
      1. Välj SQRT (Intensity-H x Intensity-F) och No Rescale i "Rescale H till F." Håll standardalternativen för övriga parametrar. Klicka på OK; Detta steg tar ca 3 min.
         OBS: Efter bearbetning 3 uppsättningar av bilder kommer att genereras: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (den slutliga rekombineras bilden), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (grön kanal för H, F, och den slutliga rekombineras bilden), och redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (röd kanal for H, F, och den slutliga rekombinerade bilden); alla utfiler kommer att skalas till 512 x 512 x 512.
   2. Öppna "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" under bildvisualiseringsprogram. Spara bildstapel i ims format och byt namn på filen; detta rekombinerade bildfil kommer att användas för neurite spårning och registrering.

4. neurite Tracing och referenspunkt Uppdrag

OBS: Detta steg är att spåra neuriter (4,1) och för att tilldela referenspunkter för registrering (4,2) med hjälp av bildvisualiseringsprogram.

1. spåra neuriter
   1. Starta bildvisualiseringsprogram. Öppna den rekombinerade bildfilen. Gå till Meny: Redigera / Visa Display Justering och stänga av ljusmätare kanalen (röd).
   2. Visualisera bilden i "Surpass" -läge. Slå på "stereo" och använd "Quad Buffer" läge för att visualisera 3D-bilder om datorn är equipped med ett stereograph system.
   3. Gå till Meny: Surpass / Filament att lägga till nya trådar. Klicka på "Hoppa skapas automatiskt, manuellt redigera" -fliken.
   4. Klicka på fliken "Rita" och välj "AutoDepth."
   5. Välj "Inställningar" kontrollera "Line" och knappa in ett lämpligt antal pixlar för bättre visualisering (en fyra-pixel linje används i detta protokoll). Check "Show dendriter," "startpunkt," och "förgreningspunkter". Ställ in "Render Kvalitet" till 100%.
   6. Välj "Rita" -fliken och börja spåra neuriter. Börja med axonet och sedan flytta till dendriter (Figur 2D). Axonet och dendriter av transmedulla nervceller är lätta att skilja.
      OBS: En Tm neuron utökar sitt axon från cellkroppen och projekt hela vägen till högre visuell bearbetning centrum, lobula. Systemet kommer automatiskt att definiera den första långa filament som en axon och de återstående korta trådar somdendriter. Håll startpunkten i början av glödtråden (axonet) under spårning och se till att den spårade neurites är anslutna. Undersök grenpunkterna och startpunkten. Om dendriter inte är ansluten, kommer en ny startpunkt definieras i icke-anslutna filament.
   7. Efter spårning, gå tillbaka till "Inställningar" avmarkera "startpunkt" och "förgreningspunkt," och gå till Meny: Surpass / Export markerade objekt ../. Spara tråden som en uppfinnare fil (* .iv).
2. Tilldela referenspunkter
   1. Välj "Show Display Justering" och slå på båda avbildnings kanaler. I detta exempel är kanal en fotoreceptorn färgning och kanal 2 är TM20 neuron (GFP).
   2. Gå till Meny: Surpass / värdering. Välj "Redigera" -fliken och kontrollera "specifik kanal" (välj ljusmätare kanal [red]).
   3. Tilldela referenspunkter för det översta lagret. Gå till Meny: / Surpass / Mätning PoiNTS att skapa nya mätpunkter. Markerar början av M1 skiktet som ett toppskikt. Ordningen på punkterna är följande: ekvators, anterior-ekvatorial, främre, anterior-ventrala, ventrala, bakre-ventrala, bakre, bakre-ekvatorial, och centrum (figur 3F); definiera mittljusmätare som en associerad med de dendritiska processerna.
   4. Tilldela R8 och R7 lager som i steg 4.2.3 (figur 3G). Tre individuella mätpunkter bör skapas i steg 4.2.3 och 4.2.4.
   5. Exportera koordinaterna för punkter för varje skikt. Klicka på "Statistik", välj "Detaljerad", "specifika värden" och "Position;" och klicka på "Export Statistik över Tab Display till fil." Spara som "kommaseparerade värden" (* .csv).
   6. Öppna de tre CSV-filer (från steg 4.2.3 - 4.2.4) och kombinera koordinaterna för de 27 referenspunkter i en ny CSV-fil genom att kopiera och klistra in (the ordning är Top, R8 och R7). Se Material / utrustning Bord och följa formatet på exempelfilen.

5. Rigid kroppen och TPS Nonlinear Registrering

OBS: Detta steg är att registrera neurite spår (i IV-format) till referens kolumnen matris och att generera ett registrerat SWC-fil med hjälp av MIPAV programmet. Detta avsnitt kräver följande filer: det rekombinerade bildstapel (.ids) från steg 3,3, referenspunkten fil (.csv) från steg 4,2 och neurite spår glöd fil (.iv) från steg 4,1.

1. Gå till Meny: Plugins / Generic / DrosophilaStandardColumnRegistration. Den "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" fönster kommer att dyka upp.
2. Ladda bildfiler (.ids), referenspunkter filen (.csv) och glöd fil (.iv).
3. Välj 9 poäng per skikt.
4. Välj position avbildade neuron (LV / RD eller RV / LD).
5. Välj "Rigid Registrerapå och TPS "och" Styv Registration "till icke-linjära och stela kropps registrering, respektive.
6. Kontrollera "Skapa SWC-fil" för att generera följande utdatafiler: ett registrerat neurite spårningsfil i SWC-format (se särskilda material / Utrustning för definition), ett registrerat IV fil (.iv), koordinaterna för standardiserade neurit (.txt), transformerade koordinater (.txt), och den kombinerade bilden (.ids).
7. Ändra namnet på SWC-filen. Applicera förkortning i den position till slutet av filnamnet (steg 1,7). Använd till exempel "Tm20_3_RV.swc" för TM20 neuron # 3 ligger på den ventrala delen av den högra märgen.

6. Standardisering till högerventrala konfiguration

OBS: Detta steg är att omvandla neurite spår (i SWC-format) till standard RV (högerventrala) konfiguration med hjälp av anpassade skript "RV_standardization.m." Här var script skrivet i matrisen laboratorie språk. DeNamnen på de ingående SWC-filer bör vara i följande format: "NeuronName _ Antal _ Configuration .swc" (t.ex. Tm20_3_LV.swc).

1. Öppna "RV_standardization.m" manus.
2. Redigera följande parametrar i avsnittet "Skriv in":
   1. Skriv namnen på de nervceller utan numrering (t.ex. Tm2, TM20, etc.) i "neuron_names."
      OBS! Standard i "file_end_in" är "_ * SWC,.", Som söker efter filer med namn som innehåller ( "*" är en jokertecken valfritt antal tecken) "_ * SWC.". Standardvärdet "swc_file_end_out" är "_f.swc", som kommer att lägga till "_F" i slutet av filnamnet efter standardisering.
   2. Ange den katalog där SWC-filer är i "directory_in". Ange den katalog där de standardiserade filer kommer att gå i "directory_swcout".
3. Kör skriptet.
4. Orivillig: Använd Vaa3D ¹⁴ att visualisera SWC-filer och validera omvandlingen.

7. Beräkna Dendritic förgrening och avslutnings Frekvenser

OBS: Detta steg använder stela kroppen registrerade SWC-filer för att beräkna Kaplan-Meier uppskattning för sannolikheten att en dendritisk segment kommer att nå en given längd utan att avsluta. Detta skript använder två Dendritic_Tree_Toolbox funktioner: extractDendriticSegmentLengthDistribution och estimateDendriticSegmentLengthProbability.

1. Öppna "Branch_term_P.m" manus.
2. Redigera följande parametrar i avsnittet "Skriv in":
   1. Ange sökvägen till den stela kroppen registrerade SWC-filer i "pathToSWCFiles" (t.ex. / Rigid_Registered_swc /). Ange sökvägen som kommer att hålla grafik produktionen i "pathToOutput." Ange namnet på nervceller eller neurala typer i "neuron_names" (t.ex. Tm2, Tm20, etc).
3. Kör skriptet; utgångarna är Kaplan-Meier-estimatet kurva för dendritiska förgrening och avslutning den.
   OBS: Valfritt: Tillämpa funktionen lutande metod för att extrahera från Kaplan-Meier Uppskattning den lokala sannolikheten att den dendritiska segmentet filial eller avsluta.

8. Rita Fördelning av Layer specifika Uppsägning av dendritiska Arbors

OBS: Detta steg plottar fördelningen av dendritiska terminaler i olika medulla lager som ett stapeldiagram. Detta kan tillämpas på en neuron, en grupp av neuroner, eller grupper av nervceller. Skriptet använder extractDistributionAlongAxis funktion från Dendritic_Tree_Toolbox.

1. Öppna "Layer_term.m" manus.
2. Redigera följande parametrar i avsnittet "Skriv in":
   1. Ange den katalog som innehåller icke-linjära registrerade SWC-filer i "pathToSWCFiles" (t.ex. / Non_linear_Registered_swc /). Ange katalogen för grafik utgång i "pathToOutput." Ange namnet på nervceller eller neurala typer i "neuron_names" (t.ex. Tm2, TM20, etc.).
3. Kör handledningen skriptet. Utgången är ett histogram över andelen terminalnoder i specifika medulla lager.

9. Rita Planar projektionsriktningen dendriter

OBS: Detta steg plottar plana projektionsriktningar dendriter som en polär tomt. Skriptet använder extractAngularDistribution funktion från Dendritic_Tree_Toolbox.

1. Öppna skript "Planar_proj.m."
2. Redigera följande parametrar i avsnittet "Skriv in".
   1. Ange den katalog som innehåller den olinjära registrerade SWC-filer i "pathToSWCFiles" (t.ex. / Non_linear_Registered_swc /). Ange katalog för grafiska produktionen i "pathToOutput." Ange namnnervceller eller neurala typer i "neuron_names" (t.ex. Tm2, TM20, etc.).
3. Kör skriptet; utsignalen är en polär kurva över plana projektionsriktningar.

Representative Results

Under användning av förfarandet med dubbla view avbildning som presenteras här, var en fluga hjärnan innehållande glest märkta TM20 neuroner avbildas i två ortogonala riktningar. Före avbildning, var hjärnan färgas med lämpliga primära och sekundära antikroppar för att visualisera membran bundna GFP och fotoreceptor axoner. För avbildning, var hjärnan först monterad i horisontell orientering (figur 2A, B). En GFP-märkt TM20 neuron och de omgivande fotoreceptor axoner avbildades med användning av ett konfokalmikroskop (figur 3A). Hjärnan därefter åter i linje (Figur 2A, B) och samma TM20 neuron åter avbildas i den främre orientering (Figur 3B). Under avbildningsprocessen, var platsen för TM20 neuron identifieras som vid den ventrala delen av den högra medulla neuropil (RV-konfiguration). Dessa två bildstaplar var dekonvolvering hjälp av bild avfaltning programvara och recombined använder MIPAV (figur 3C) för att generera en rekombinant bildstapel (Figur 3C). Den rekombinanta bildstapel visade en signifikant minskning av axiell distorsion jämfört med antingen ingångs stack (Figur 3A ', B').

Använda bildvisualiseringsprogram, var axonet och dendriter av TM20 neuron spåras (figur 3D) och sparas som en uppfinnare (iv) fil. 27 referenspunkter på fotoreceptor axoner omger TM20 neuron tilldelades (figurerna 3E - H) och sparas som en kommaseparerade värden (CSV-fil). De spåras Dendrite filer och referenspunkt fil därefter appliceras på anpassade plugin i MIPAV att generera stela kropps registrerade och icke-linjärt registrerade Dendrite spår i SWC-format. De registrerade dendritiska spår omvandlades till standard RV konfiguration med "RV_standardization.m" manus. Than registrerade och standardiserade dendritiska spårningsfiler visualiserades med hjälp av Vaa3D att validera registrerings- och standardiseringsprocesser (Figur 3I).

För dendritiska analys registrerade dendritiska spår för 15 TM20 neuroner och 15 TM2 nervceller samlades. Använda "Branch_term_P.m" manus, förgreningen och avslutande sannolikheten för dessa neuroner analyserades med den stela kroppen registrerade dendritiska spår (Figur 4A, B). Kaplan-Meier kurvor visar att både neuronala typerna har liknande förgrening och avslutande frekvenser. Dock har Tm2 lägre avslutande frekvens för längre segment (> 4 um, Figur 4A) ^12. För att analysera dendritiska egenskaper som förknippas med lager och kolumner, var de dendritiska spår som registrerats av den icke-linjära registreringsmetod som används. Använda anpassad "Layer_term_P.m" manus, distributionens av skiktspecifika dendritiska avslutning för TM2 och TM20 neuroner beräknades (Figur 4C, D). De distinkta fördelningarna av skiktspecifika avslutningar av TM2 och TM20 dendriter är förenliga med deras specifika synaptiska partners i olika skikt: TM2 dendriter emot input från L2 och L4 axonal terminaler i M2 och M5, respektive, medan TM20 dendriter emot input från R8 och L3 i M3 skiktet ^{8, 15, 16.} Använda "Planar_proj.m" manus, var de plana projektionsriktningar TM2 och TM20 dendriter analyseras och befanns vara åtskilda från varandra: Tm2 dendriter projekt posteriort medan TM20 dendriter projekt anteriort ¹² (Figur 4E, F).

Figur 1. Workflow. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Provberedning för Dual-view Imaging och Symmetry av Drosophila Medulla Kolumn Array. (A, B) Prov montering för dual-view avbildning. (A) vyn visas som om att titta på hjärnan genom ett täckglas. (B) Schematisk diagram för provmontering. För avbildning horisonttal staplar, den immun färgade hjärnan monteras först vid den ventrala-up läge. Efter att ha förvärvat den första stapeln, är hjärnan nytt läge i den främre-up läge för avbildning av front stacken. A: anterior; P: bakre; D: rygg; V: ventral; R: höger; L: vänster. (C - E) Symmetrin och organisation av märgen neuropil, sett i den främre positionen. (C) ljusmätare axoner, märkta av 24B10 antikropp (röd), användes för att visualisera organisationen av märgen neuropil. Bilden visas som om ser från utsidan in i hjärnan. Ant: anterior; Pos: posterior; Dor: dorsal; Ven: ventral; Eq: ekvatorn. (D) En hög-förstoring vy av (C) vid fyra kvadranter av medulla neuropil vid R7 skiktsnivån. De centrala R7 terminaler är markerade med gula prickar. Den främre och Ekvatorial R7s är märkta med gröna och cyan punkter, respektive. (E) En schematisk representation av medulla columnar organisation. Observera att de vänstra och högra medulla neuropils är spegelbilder, och rygg och ventrala halvorna av varje neuro är också spegelbilder, åtskilda av ekvatorn. Röda prickarna visar ekvatorn R7s, som är de första referenspunkter. Numbers (1 - 9) och pilar indikerar ordningen referenspunkt uppdrag. Skala bar: 15 pm i C; 5 um i D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Bild rekombination och referenspunkttilldelning. (A - C) Confocal bilder för en enda TM20 neuron förvärvats i den horisontella (A) och frontala (B) riktningar. Bilderna visas som maximal intensitet projektioner. Fotoreceptor axoner och en enda TM20 nEURON är märkta med Mb24B10 antikropp (röd) och membran bundna GFP (grön), respektive. (C) rekombinerade bilden av (A, röd) och (B, cyan). För tydlighets skull är endast fotoreceptorer visas. (A '- C) Dual-avbildning förbättrar axiell upplösning. Den rekombinerade bilden (A ') har en bättre upplösning än de i den horisontella-view (A') och frontal-vy (B ') bilder. Lägre paneler: hög förstoring utsikt över inramade områdena i de övre panelerna. (D) Tracing axonet (vit) av en enda TM20 neuron. Begynnelsepunkten angavs som ett cyan prick. (E) De 27 referenspunkter (vita prickar) på 9 fotoreceptor axoner omger TM20 nervceller används som landmärken. Referenspunkterna är i tre skikt: Top, R8 och R7. (F) Referenspunkt uppdrag i varje skikt. Referenspunkten uppdraget följer fol jande ordning: ekvatorn (EQ), anterior-ekvatorn (AE), främre (A), anterior-ventrala (AV), ventrala (V), posterior-ventrala (PV), bakre (P), bakre-ekvatorn (PE) och centrum (C). (G) En schematisk representation av medulla kolumnen array används för registrering. En TM20 neuron visas (grön). Märgen skikten (M1-6) är angivna. (H) Ett exempel på skiktet och referens punkttilldelning för en enskild kolumn. Tre lager används för att definiera varje kolumn: Top, R8 och R7 (korsningen av M5 / 6 skikt). (I) Ett registrerat och standardiserad neurite spår visualiseras med Vaa3D. Skala bar: 5 nm i A för AC; 5 nm i A 'för A'-C; 5 pm i D, E, F och G. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

410fig4.jpg "/>
Figur 4. Exempel på resultat från dendritiska analyser. (A, B) Kaplan-Meier-uppskattningar (y-axeln) av dendritisk förgrening (A) och terminering (B) avsattes i logaritmisk skala med avseende på segmentlängd (x-axeln). Fasta och streckade linjerna betecknar medelvärden ± SD. TM2 (röd) och TM20 (svart) har liknande förgrening och terminerande frekvenser för segment mindre än 4 pm. (C, D) Histogram som visar den genomsnittliga andelen terminala dendritiska noder i varje medulla (M) skikt. Andelen terminalnoder i ett givet medulla skikt beräknas först för varje neuron av en given typ och sedan ett medelvärde för alla neuronerna i den typen. De vertikala staplarna visar standardavvikelsen för andelen. Observera att för TM2 neuroner (C), fördelningen av terminal dendritiska noder koncentreras i medulla skiktet 2, med en mindre topp i skiktet 5, medan det för Tm 20 neuroner(D), är fördelningen centrerad kring M2 och M3 skikten. (E, F) Polära plottar av den plana projektionsriktningen av dendriter. Andelen terminalnoder projicerade inom ett vinkel bin (20 °) först beräknas för varje neuron av en given typ och sedan som medelvärde över alla neuroner av den typen. De röda och blå kurvorna visar den genomsnittliga andelen ± standardavvikelse. Hörnen på kurvorna är mittpunkterna på de vinkellagerplatser. De svarta cirklar visar andelen värden som anges av den svarta siffran på sin sida. Notera att, i genomsnitt, är de två klasserna av neuroner orienterade i nästan motsatta riktningar. A: anterior; P: bakre; D / V: dorsal / ventral; Eq: ekvatorn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här visar vi hur bilden och analysera dendritiska hållare av Drosophila medulla nervceller. Den första delen, dual-view avbildning beskriver deconvolution och kombinationen av två bildstaplar i en högupplöst bildstapel. Den andra delen, dendrit spårning och registrering, beskriver spårning och registrering av dendriter av medulla nervceller till referens kolumnen array. Den tredje delen, dendritiska analys, beskriver användningen av anpassade skript för att analysera dendritiska mönster. Tillsammans dessa protokoll ger en komplett arbetsflöde för att extrahera information om dendritiska mönster i förhållande till lager och kolumner och bestämma dendritiska förgrening och avslutande frekvenser.

Den dubbla-view-metoden avbildning presenteras här är konceptuellt liknar de multi-view avbildningstekniker som genomförs med mikroskop ljus ark, där två eller flera bildstaplar uppsamlade ortogonalt rekombineras att uppnå en hög axial Upplösning in ^{17, 18.} Det är dock tekniskt utmanande att ortogonalt genomföra de två höga NA (numerisk bländare) objektiv som krävs för avbildning slanka dendriter. Sålunda kräver dubbla visa metoden avbildning av samma prov hjärnan i två steg i följd och åter orientera provet mellan avbildning. Misslyckanden i bild kombination är mest sannolikt orsakas av prov rörelse under avbildning eller prov squash under manipulation. Dessutom medan bilden rekombination processen minskar den axiella distorsion problem och resulterar i nästan isotropiska upplösning, de rekombinerade bilderna är fortfarande under en diffraktionsgränsen. Vår dubbla visa avbildningsmetod behöver bara standard konfokalmikroskopi, som är allmänt tillgänglig. Men superupplösning mikroskopi, såsom STED eller struktur belysning, om sådana finns, skulle vara ett utmärkt alternativ till den dubbla visa avbildningsmetod närvarande här.

Dedendrit spårning och registrering avsnitt presenteras här spår dendritiska träd och registrerar dendritiska träd referens kolumnen array. I detta protokoll är kommersiellt program Imaris används för halvautomatisk dendrit spårning och för tilldelning av referenspunkter. Liknande uppgifter kan utföras med hjälp av ett antal gratisprogram alternativ, såsom NeuronJ ^{19, 20} och neurit Tracer ^21. Vår registrering protokollet använder en anpassad plugin implementeras i open source-program MIPAV att registrera Dendrite spår referens kolumnen array. Såvitt vi vet är detta registreringsmetod den enda metod som registrerar neurite spår till kolumner och skikt. Detta förfarande använder regelbundet arrangerat fotoreceptor axoner som landmärken för registrering. De dendritiska spår som genereras av den icke-linjära registreringsmetod är idealiska för att extrahera information om dendritiska mönster som avser kolumner och skikt. På den andrahand riktar den styva kroppen registrerings metoden kartesiska axlar dendritiska spår till kardinalaxlar neuro utan att ändra dendritiska längder eller andra lokala geometriska egenskaper. Därför registrerades den stela kroppen dendritiska spår är lämpliga för standard morfometriska analyser.

Traditionell dendritiska morfometrisk analys, såsom L-mått ^22, karaktäriserar lokala och globala dendritiska egenskaper utan att referera till omgivande vävnad. Vi har tidigare visat att många medulla nervceller dela dendritiska geometriska egenskaper och att dessa mått är otillräckliga för att skilja medulla neuron typer ^12. Istället är typspecifika dendritiska attribut direkt samband med lager och kolumner där dendriter bor. I synnerhet olika typer av medulla neuroner skjuter dendriter i olika plana riktningar för att sluta i specifika medulla lager. Dessa två dendritiska attribut reflekt den dendritiska funktion av medulla neuroner att få retinotopically riktade afferenter organiserade i skikt och kolumner. För att underlätta utvinning av dessa egenskaper har vi utvecklat den dendritiska trädet verktygslåda som innehåller en rad egna funktioner för beräkning av dendritiska egenskaper. I dendritiska analys avsnittet visar vi hur dessa funktioner kan tillämpas på registrerade dendritiska spår för att beräkna fördelningen av skiktspecifika terminering och plana projektionsriktningar dendriter.

Den dendritiska träd verktygslåda ger en plattform för att lägga till andra anpassade funktioner för dendritiska analys. I dendritiska analys avsnittet beskriver vi också processen att härleda uppskattningar för uppenbara dendritiska avslutande och förgrenings frekvenser. I synnerhet är dessa funktioner beräknar förgrening och avslutande frekvenser baserade på en Kaplan-Meier nonparametric estimatorn för sannolikheten att en dendritisk segment kommer att sträcka sig till en viss length utan förgrening eller avsluta ^{12, 23.} Det är viktigt att notera att den stela kroppen registreras (men inte de icke-linjärt registrerade) dendritiska spår bör användas för denna beräkning, eftersom det icke-linjära registreringsprocessen förändrar dendritiska segmentlängder. De dendritiska förgrening och termineringsfrekvenser är förstaderivatan (lutningen) av KM kurvor och kan beräknas med hjälp av funktionen lutande metod. Dessutom exakt beräkning av förgreningen och terminer frekvenser kräver ofta en betydande datamängd (> 10 neuroner för Tm neuroner) eftersom enstaka neuroner har endast ett relativt litet antal dendritiska segment. I de medföljande exemplen, Tm2 och TM20 har liknande förgrening och avslutande frekvenser, men Tm2 förgreningsfrekvensen är inte homogen över förgrenings längd, ett utmärkande drag av Tm2 dendriterna ^12.

Medan våra protokollär konstruerade för Drosophila medulla neuroner, kan de anpassas för att analysera andra nervceller som elaborate dendriter i skikten och kolumner, till exempel andra Drosophila-optiska loberna och ryggradsdjuret näthinnan och cortex. Sådana anpassningar skulle kräva att bygga en ny referens kolonn array baserad på systemet med intresse ^12, samt mindre ändringar av MIPAV plugin. Vi erbjuder alla våra program som öppen källkod för att främja samarbete och utbyte.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	version 16.05	for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV		version 7.3.0	for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class			freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class			freeware
Imaris	Bitplane		for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D			for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab	Mathworks	R2014b	for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14		v1.14	for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name	Company	Catalog number	Comments
Sample files
SWC file definition			http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2
Name	Company	Catalog number	Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later			3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card	Nvidia		for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name	Company	Catalog number	Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody	The Developmental Studies Hybridoma Bank	24B10
GFP Tag Antibody	Thermofisher Scientific	G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Mounting Clay	Fisher	S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9000-000