Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحديد حاتمة الخطي B-خلية المعترف بها الأجسام المضادة وحيدة النسيلة-الببتيد الضوئي بمساعدة

Published: March 24, 2017 doi: 10.3791/55417
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

Abstract

تحديد حاتمة مولدة من قبل النظام المناعي يسمح لفهم آلية الحماية من الأجسام المضادة التي قد تسهل تطوير اللقاحات والعقاقير الببتيد. الببتيد المسح هي طريقة بسيطة وفعالة تعين مباشر حاتمة الخطية المعترف بها من قبل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب). هنا، والكتاب تقدم منهجية تقرير حاتمة التي تنطوي على البروتينات اقتطاع متسلسل المؤتلف، تصميم الببتيد الاصطناعية، وتهجين نقطة وصمة عار للاعتراف الأنتيجين من فيروس العصبي نخر بروتين معطف باستخدام ماب تحييد. وتعتمد هذه التقنية على تهجين نقطة وصمة عار من الببتيدات الاصطناعية وMABS على (PVDF) غشاء فلوريد البولي. يمكن تضييق المنطقة مولدة الحد الأدنى من البروتين الفيروسي معطف معترف بها من قبل RG-M56 ماب أسفل خطوة بخطوة قلص رسم الخرائط الببتيد على 6 مير الببتيد حاتمة. وبالإضافة إلى ذلك، مسح ألانين الطفرات وبقايا الفرعيةstitution لا يمكن أن يؤديها لتوصيف أهمية ربط كل بقايا الأحماض الأمينية التي تشكل حاتمة. تم العثور على بقايا المرافقة الموقع حاتمة للعب أدوارا حاسمة في تنظيم الببتيد التشكل. ويمكن استخدام الببتيد حاتمة التي تم تحديدها لتشكيل بلورات من المجمعات الببتيد الأجسام المضادة حاتمة لدراسة حيود الأشعة السينية والمنافسة وظيفية، أو العلاجات.

Introduction

في الجهاز المناعي، وإعادة التركيب من شرائح V و D و J يسمح لأجسام مضادة لخلق اختلافات هائلة من المناطق التكامل تحديد (تقارير الإنجاز الموحدة) للربط إلى مختلف المستضدات لحماية المضيف من العدوى المسببة للأمراض. الدفاع تحييد الأجسام المضادة ضد المستضدات يعتمد على التكامل المكاني بين تقارير الإنجاز الموحدة من الأجسام المضادة والحواتم من المستضدات. ولذلك، فإن فهم هذا التفاعل الجزيئي مساعدة تصميم لقاح وقائي والتنمية الببتيد المخدرات العلاجية. ومع ذلك، قد تتأثر هذا التفاعل تحييد كل من المجالات مولدة متعددة من مستضد واحد واحد وتقارير الإنجاز الموحدة متعددة من الأجسام المضادة، والتي بالتالي جعل عملية تحديد حاتمة أكثر تعقيدا. لحسن الحظ، وتطوير تكنولوجيا هجين، التي تدمج الخلايا المنتجة للأجسام المضادة الفردية مع خلايا المايلوما، يسمح لدفعة تقسيم باستمرار من الخلايا ثانية الأجسام المضادة المحددة شبكة شعيرية واحد، والمعروفة باسم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) 1. خلايا هجين تنتج هذه النقية، MABS عالية تقارب ربط إلى مجال الأنتيجين واحد لمستضد معين. مع العلاقة بين مستضد الضد المعمول بها، العديد من الطرق، بما في ذلك المسح الببتيد، ويمكن استخدامها لتحديد حاتمة من مستضد باستخدام ماب المقابلة. جعلت التطورات الحديثة في تكنولوجيا الببتيد الاصطناعية تقنية الببتيد المسح الضوئي أكثر سهولة وأكثر ملاءمة لأداء. لفترة وجيزة، ويتم إنتاج مجموعة من تداخل الببتيدات الاصطناعية وفقا لتسلسل المستضد الهدف وترتبط إلى الغشاء الصلبة المعتمدة لماب التهجين. الببتيد المسح يوفر ليس فقط وسيلة بسيطة لتعيين الأجسام المضادة المنطقة ملزم، ولكن أيضا يسهل الأحماض الأمينية (أأ) الطفرات من خلال مسح بقايا أو استبدال لتقييم تفاعل ملزم بين كل بقايا أأ من الببتيد حاتمة وتقارير الإنجاز الموحدة من الأجسام المضادة.

معشوقة = "jove_content"> هنا، توضح الدراسة بروتوكول لتحديد كفاءة حاتمة خطية من البروتين معطف الهامور الأصفر فيروس نخر العصبي (YGNNV) باستخدام ماب تحييد 2، 3، 4. ويتضمن البروتوكول ماب إعداد والبناء والتعبير عن البروتينات المؤتلف اقتطاع متسلسل، الاصطناعية تصميم الببتيد متداخلة، تهجين نقطة وصمة عار، مسح ألانين، والطفرات تبديل. ونظرا لارتفاع تكلفة تركيب الببتيد، تم تعديل خطوة من اقتطاع متسلسل البروتينات المؤتلف من البروتين الهدف المنشود، وضاقت المنطقة المستضدات إلى حوالي 100-200 بقايا أأ قبل إجراء الببتيد مجموعة تحليل نقطة وصمة عار الاصطناعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد وحيدة النسيلة الأجسام المضادة

  1. ثقافة RG-M56 الماوس وحيدة النسيلة خلايا هجين 2 في المصل خالية المتوسطة في قوارير 175T في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 الملحق. جمع طاف عند لون المتوسطة يتحول إلى اللون الأصفر بعد خمسة أيام من الحضانة.
    ملاحظة: كانت خلايا ورم هجين مثقف في المتوسط ​​خالية من المصل لتجنب تلوث الأجسام المضادة من المصل البقري الجنين.
  2. أجهزة الطرد المركزي لطاف في 4500 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل بيليه الحطام الخلية.
  3. إضافة 2 مل من بروتين G الاغاروز (كما زودت الطين 50٪) إلى عمود 5 مل وتتوازن مع 10 مجلدات الراتنج (10 مل) من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
  4. تحميل 200 مل من طاف الأجسام المضادة (الخطوة 1.2) على عمود وتجاهل المار.
  5. إضافة 10 مل من الجليد الباردة PBS إلى العمود لأنه يغسل. كرر مرتين.
  6. إضافة 10 مل من 50 ملي الجلايسين، ودرجة الحموضة 2.7 إلى العمود إلى أزل الأجسام المضادة بروتين G المصاحب. العقيدlect 900 كسور ميكرولتر في أنبوب microcentrifuge تحتوي على 100 ميكرولتر من 10X العازلة تحييد (1 M تريس، 1.5 M كلوريد الصوديوم، و 1 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0).
  7. تخزين الجسم المضاد النقي في 50٪ الجلسرين مع 0.03٪ نان 3 في -20 درجة مئوية.

2. البناء والتعبير عن تسلسليا اقتطاع البروتينات المؤتلف

  1. إعداد PCR خليط التفاعل: 5 ميكرولتر من العازلة 10X PFU، 0.2 ملم من كل dNTP، 0.2 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام 3 و 0.2 ميكرومتر التمهيدي العكسي 3، 2 ملي MgSO 4، 1 نانوغرام من pET20b-1A59 3 DNA البلازميد، و 2.5 U ( وحدة) من البلمرة PFU الحمض النووي. إضافة ده 2 O إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر.
    1. عينات تشغيل في cycler الحرارية التلقائي باستخدام المعلمات التالية: دورة 1 (94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق)؛ دورات 2-36 (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية). ودورة 37 (72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق).
  2. استخراج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) المنتجات باستخدام تنقية عدة PCR 5 لتسهيل ما يلي انزيم الهضم قيود.
  3. هضم شظايا تضخيم الحمض النووي PCR مع تجربة الاقتراب من الموت أنا وXho أنا أنزيمات التقييد وligate كل هذه الشظايا الحمض النووي في تجربة الاقتراب من الموت أنا وXho I-المشقوق انزيم PET-20B (+) ناقلات. تحويل ثوابت في كولاي DH-5α المختصة خلايا 6.
    1. تحضير خليط الهضم العازلة في الهضم (20 ملي تريس، خلات، 10 ملي المغنيسيوم (CH 3 COO) 2، 50 ملم KCH 3 COO، و 1 ملي DTT، ودرجة الحموضة 7.9) مع 1 ميكروغرام من تضخيم الحمض النووي PCR أو PET-20B (+) الحمض النووي ناقلات، و2 U من تجربة الاقتراب من الموت أنا وتقييد Xho أنا الانزيمات في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر.
    2. مزج الخليط الهضم بلطف وتدور بسرعة إلى أسفل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في حمام جافة لضمان القطع الكامل للقيود الجلوسوفاق.
    3. استخراج تقييد هضم انزيم شظايا الحمض النووي باستخدام تنقية عدة PCR 5 لتسهيل بناء البلازميد التالية.
    4. تحضير خليط ربط العازلة في ربط (66 ملي تريس، 5 ملي MgCl 2، 1 ملم ATP و 5 ملي DTT، ودرجة الحموضة 7.5) مع 100 نانوغرام من مهضوم، تضخيم الحمض النووي PCR، 10 نانوغرام من مهضوم PET-20B (+) الحمض النووي ناقلات، و 5 يغاز U من T4 الحمض النووي في الحجم النهائي من 10 ميكرولتر.
    5. مزج الخليط ربط بلطف وتدور بسرعة إلى أسفل. احتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 18 ساعة في حمام مائي.
    6. وضع 10 ميكرولتر من العينات ربط إلى 100 ميكرولتر من الخلايا DH-5α الحكومية المختصة وتخلط بلطف قبل وضع أنبوب microcentrifuge على الجليد لمدة 30 دقيقة. وضع أنبوب microcentrifuge في حمام الجافة في 42 درجة مئوية لمدة 90 ق للحث على الصدمة الحرارية 7. على الفور نقل أنبوب على الجليد لمدة 2 دقيقة.
    7. إضافة 900 ميكرولتر من لوريا، Bertani (LB) مرق (1٪ Bacto تريبتون، 0.5٪ Bacto الخميرة المقتطفر، و 0.5٪ كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0) لأنبوب. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 150 دورة في الدقيقة تهتز لمدة 45 دقيقة. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 4000 ز س لمدة 10 دقيقة وتجاهل طاف.
    8. Resuspend وبيليه مع 50 ميكرولتر من مرق LB ونشر كل تحول على لوحات LB استعد مسبقا تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
    9. التقاط مستعمرة واحدة باستخدام تلميح 200 ميكرولتر ووضعه في 3 مل من مرق LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين في توج فضفاضة 15 مل أنبوب. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 150 دورة في الدقيقة تهتز لمدة 12 ساعة.
    10. استخراج DNA البلازميد 8 من كل ثقافة وتسلسل ذلك باستخدام المروج T7 وT7 التمهيدي فاصل لتأكيد تسلسل 9.
  4. بعد تأكيد تسلسل، وتحويل 10 نانوغرام من الحمض النووي من هذه الحيوانات الأليفة 20B (+) البلازميدات مع أطوال YGNNV جين البروتين معطف متفاوتة في BL-21 (DE3) سلالة كولاي من قبلناجي طريقة للحرارة صدمة 7. اتبع الخطوات 2.3.6-2.3.8 لتنفيذ التحويل.
  5. نقل مستعمرة واحدة من كل تتحول كولاي BL-21 خلية في 3 مل من مرق LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين في توج فضفاضة 15 مل أنبوب. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية مع 150 دورة في الدقيقة تهتز.
  6. تبريد الثقافة إلى 25 درجة مئوية عند OD 600 من ثقافة حوالي 0.6 وإضافة IPTG إلى تركيز النهائي من 0.4 ملم للحث على التعبير عن بروتين المؤتلف. احتضان الثقافة ل4 ساعات اضافية في 25 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة تهتز.
  7. نقل 1 مل من ثقافة إلى أنبوب microcentrifuge. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف.
  8. Resuspend وبيليه الخلية في 100 ميكرولتر من العازلة تمسخ (8 M اليوريا و 20 ملي فوسفات الصوديوم، وكلوريد الصوديوم 0.5 M، ودرجة الحموضة 7.4) من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع micropipette. مزيج من قبل vortexing قوية.
    ملاحظة: سول عينةالآن يجب أن يكون utions شبه شفافة، لزجة قليلا، وعلى استعداد لتهجين فحص نقطة وصمة عار.

3. تصميم وتجميع من الببتيدات تداخل

  1. تصميم وتركيب 3 مسلسل الببتيدات 20 مير التي تتداخل مع بعضها مع خليفتها بنسبة 10 بقايا أأ من المنطقة 195-338 أأ من البروتين معطف YGNNV لتضييق المنطقة حاتمة من RG-M56 ماب بواسطة النشاف نقطة.
  2. تصميم وتركيب الببتيدات 3 ثلاث 8-مير (195 VNVSVLCR 202، 197 VSVLCRWS 204، و 199 VLCRWSVR 206) مع وجود تداخل من 6 بقايا أأ على الببتيد الاصطناعية المقبل لتضييق المنطقة حاتمة من 195-206 أأ من قبل النشاف نقطة.
  3. تصميم وتركيب 3 7-مير (196 NVSVLCR 202 و 195 VNVSVLC 201)، 6-مير (195 VNVSVL 200، 196 NVSVLC 201، و 197 VSVLCR 202)، و 5 مير الببتيدات (195 VNVSV 199، 196 NVSVL 200، 197 VSVLC 201، و 198 SVLCR 202) مع وجود تداخل بين 6 و 5 و 4 بقايا أأ، على التوالي، على الببتيدات المجاورة لها للحد من المنطقة حاتمة بواسطة النشاف نقطة.

4. نقطة وصمة عار التهجين

  1. حل كل الببتيد توليفها في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) إلى تركيز النهائي من 10 ملغ / مل.
    ملاحظة: للتغلب على الذوبان متنوعة من الببتيدات الاصطناعية، يجب أن يتم حل جميع الببتيدات الاصطناعية في DMSO. DMSO هو مذيب جيد لإذابة تماما الببتيدات مسعور أو ماء.
  2. نقع الغشاء البولي فينيل الفلوريد (PVDF) مع الميثانول لمدة 2 دقيقة.
    ملاحظة: غشاء PVDF هو ما يصل الى مقاومة للDMSO 100٪؛ البعض الآخر قد لا تكون كذلك.
  3. تتوازن غشاء PVDF مع العازلة تعديل Towbin (25 ملي تريس، 192 الجلايسين ملم، و 0.1٪ SDS، ودرجة الحموضة 8.3) ل2 دقيقة.
    ملاحظة: 10-20٪ (ت / ت) من الميثانول يمكن أن تضاف إلى عازلة Towbin تعديلها لتحسين نتائج نقل.
  4. شطف قطعة من الورق اللوني مع العازلة Towbin تعديلها. وضع غشاء PVDF على ورقة اللوني. انتظر حتى اختفى عازلة Towbin معدلة من سطح الغشاء PVDF قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
  5. إضافة 2 ميكرولتر من كل عينة الببتيد إلى الغشاء مع طرف 10 ميكرولتر. الهواء الجاف الغشاء PVDF على ورقة اللوني لمدة 10 دقيقة. إضافة كل عينة الببتيد ببطء وتدريجيا على الغشاء لتجنب الكثير من نشرها.
  6. منع غشاء العازلة في TBST (0.05٪ (ت / ت) توين-20، و 20 ملي تريس، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4) مع الحليب الخالي 5٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
  7. إضافة RG-M56 ماب في التخفيف النهائي من 1: 1000 العازلة في TBST مع الحليب الخالي من 5٪ إلى الغشاء. احتضان الغشاء في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع الهز لطيف.
  8. إزالة الأجسام المضادة لذلكlution. غسل غشاء العازلة في TBST لمدة 5 دقائق مع اهتزاز لطيف. كرر مرتين.
  9. إضافة الضد الثانوية (الماعز المضادة للمفتش الماوس، FC، مترافق الفوسفاتيز القلوية) في التخفيف النهائي من 1: 5000 العازلة في TBST مع الحليب الخالي من 5٪ إلى الغشاء. احتضان الغشاء في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع الهز لطيف.
  10. تجاهل حل الأجسام المضادة. غسل غشاء العازلة في TBST لمدة 5 دقائق مع اهتزاز لطيف. كرر الخطوة غسل مرتين.
  11. تطوير الغشاء مع الحل الركيزة BCIP / NBT في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في الظلام. وقف النامية عن طريق غسل غشاء مع [ده 2 O عندما تظهر إشارة.
  12. الهواء الجاف الغشاء والتقاط صورة نقطة وصمة عار باستخدام نظام الصورة.
  13. قياس كثافة كل وصمة عار نقطة باستخدام صورة برامج التحليل 3.

5. الضوئي ألانين وتبديل

  1. تصميم وتركيب 3 ألانين وميثيالببتيدات استبدال onine. استبدال كل بقايا أأ مع ألانين لالببتيد 8 مير 195 VNVSVLCR 202 وتوليف الببتيد 195 ANVSVLCR 202، 195 VAVSVLCR 202، 195 VNASVLCR 202، 195 VNVAVLCR 202، 195 VNVSALCR 202، 195 VNVSVACR 202، 195 VNVSVLAR 202، و 195 VNVSVLCA 202 . استبدال أأ بقايا يسين 200 إلى ميثيونين لإنشاء SJNNV الوراثي حاتمة الببتيد 195 VNVSVMCR 202.
  2. اتبع القسم 4 لأداء المسح ألانين والطفرات استبدال دوت التنشيف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكان الهدف من هذه التجربة لتحديد حاتمة من خلال نقطة النشاف باستخدام ماب. لتضييق بسرعة وكفاءة أسفل منطقة مولدة معترف بها من قبل ماب، وأعرب عن كامل طول واقتطاع متسلسل YGNNV بروتينات الغلاف المؤتلف مع علامة الانصهار 6xHis في محطة سي من نظام التعبير كولاي PET 10 (الشكل 1A). وقد شوهدت البروتينات المؤتلف الناتجة على الغشاء PVDF باستخدام RG-M56 ماب ومكافحة 6xHis الأجسام المضادة لتهجين نقطة وصمة عار. كشف نقطة النشاف اشارات ايجابية ضد 1-338 أأ (بالطول)، 51-338 أأ، و195-338 أأ، ولكن ليس 1-100 أأ أأ أو 1-200 البروتينات المؤتلف (الشكل 1B). النقطة مجموعة تهجين ضد الأجسام المضادة لمكافحة 6xHis وأكدت التعبير عن جميع البروتينات المؤتلف. وتشير هذه البيانات إلى أن حاتمة الاعتراف RG-M56 ماب يقع في 144 أأ البروتين المؤتلف وكالة الطاقة النوويةص سي محطة من YGNNV بروتين معطف (195-338 أأ).

وفي وقت لاحق، مسلسل الببتيدات 20 مير مع 10 أأ-مخلفات طويلة تتداخل على جارتهم تم تصميمها وتجميعها من تسلسل 144 أأ البروتين المؤتلف للمسح الضوئي الببتيد لتضييق المنطقة حاتمة. وقد رصدت هذه الببتيدات الاصطناعية على غشاء PVDF وتعرض لتهجين نقطة وصمة عار باستخدام RG-M56 ماب. أظهرت نتيجة إشارات إيجابية فقط على أأ الببتيد 195-214 ومراقبة إيجابية، 195-338 أأ البروتين المؤتلف (الشكل 2A). كما يقع حاتمة داخل الببتيد 195-214 أأ المنطقة ولكن ليس في المنطقة أأ الببتيد 205-224، ثلاثة التسلسلية الببتيدات 8 مير مع بقايا 6-أأ أأ تتداخل من بقايا 195-206 (الببتيدات 195-202 أأ، 197- تم تصميم 204 أأ، و199-206 أ أ) وتوليفها. وأظهرت نتائج التهجين نقطة وصمة عار إشارات إيجابية على أأ الببتيد 195-202 والسيطرة الإيجابية الببتيد 195-214 أأ باستخدامRG-M56 ماب (الشكل 2B).

تم تنفيذ مسح ألانين والطفرات استبدال لتقييم خصوصية كل بقايا أأ من حاتمة 8 مير، 195 VNVSVLCR 202. تم استبدال كل بقايا أأ من الببتيد 8 مير بشكل فردي مع ألانين. ثم وضعت في ألانين مجموعة طفرة الببتيد على غشاء PVDF باستخدام الببتيد 195-202 أأ كعنصر تحكم إيجابية. وأشار تحليل نقطة وصمة عار أن الطفرات الثلاث استبدال، V197A، V199A، وC201A، ألغت تقارب ملزمة من RG-M56 ماب (الشكل 3A). على الرغم من أأ بقايا 200 في حاتمة SJNNV النمط الجيني هو الميثيونين، خلافا ليسين في أربعة الحواتم أخرى الوراثي Betanodavirus، وتسلسل SJNNV الوراثي، 195 VNVSVMCR 202، أظهر تقارب إيجابي ملزم ضد RG-M56 ماب، مثلها في ذلك مثل مراقبة إيجابية (الشكل 3A). هذه النتيجة تشير إلى أن الحواتم سو كل المورثات Betanodavirus يمكن التعرف عليه بواسطة RG-M56 ماب. وكان كميا تقارب ملزم من كل بقايا أأ المشاركة إلى الموقع حاتمة أبعد عن طريق قياس كثافة إشارة من نقطة لطخة من استبدال كل ألانين باستخدام برمجيات تحليل الصور (الشكل 3B). تم تخفيض شدة من V197A، V199A، وبدائل C201A إلى 10.2٪، 18.6٪، و 8.5٪، على التوالي، مقارنة مع تلك السيطرة الايجابية (100٪)، في حين أن V195A، S198A، L200A، R202A، و وأظهرت بدائل L200M كثافة أعلى أو مماثلة كما ان من السيطرة الإيجابية. ومن الجدير بالذكر أن قوة التأثير من استبدال N196A غامضة، مع انخفاض 37.4٪ في مراقبة إيجابية. وتشير هذه النتائج إلى أن V197، V199، وC201 هم بقايا أساسية لربط RG-M56 ماب.

وتكشف نتائج المسح ألانين الطفرات إلى أن المخلفات أأ V195، N196، وR202 يمكنيتم استبدال ألانين، مما يعني أن المنطقة حاتمة يمكن مواصلة تضييق على حد سواء ترميني. لذلك، قلصت خطوة بخطوة رسم الخرائط الببتيد خلال 7 مير، 6 مير، و 5 مير الاصطناعية خطوة الببتيدات تم تصميمها لتقليل المنطقة المستضدات. كانت إشارة إيجابية موجودة على الببتيد الاصطناعية 6-mer من 196 NVSVLC 201، ولكن ليس على 7 مير و 5 مير الببتيدات الاصطناعية (الشكل 4). وتشير هذه البيانات إلى أن حاتمة الحد الأدنى من البروتين NNV معطف معترف بها من قبل RG-M56 ماب هي الببتيد 6 مير، 196 NVSVLC 201.

شكل 1
الشكل 1: الحد من منطقة حاتمة استخدام البروتينات المؤتلف اقتطاعها بشكل متسلسل وحيد النسيلة. (A) خريطة NNVCPs المؤتلف اقتطاع متسلسل. NNVCP 1-338 aa غير كامل طول البروتين معطف. (ب) نقطة، المفكرهتحليل طن من NNVCPs المؤتلف. اليسار: خريطة لYGNNV بروتينات الغلاف المؤتلف اقتطاعها بشكل متسلسل على الغشاء PVDF. الأوسط: تم إجراء تحليل نقطة وصمة عار باستخدام معاداة 6xHis الأجسام المضادة. الحق: تم إجراء تحليل نقطة وصمة عار باستخدام RG-M56 ماب. NNVCP: العصبي فيروس نخر بروتين معطف. أأ: الأحماض الأمينية. PVDF: فلوريد البولي فينيل. N: N-محطة. C: C-محطة. ماب: الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: رسم الخرائط الجميلة في المنطقة حاتمة باستخدام الببتيدات الاصطناعية. (A) اليسار: تم الانحياز الأحماض الأمينية تسلسل الببتيدات الاصطناعية 20 مير لNNVCP 195-338 أأ. كان كل الببتيد السابقة تداخل 10 أأ-مخلفات طويل مع الببتيد التالية. الصحيح: خريطة لياليالببتيدات ynthetic على الغشاء PVDF. وقد استخدم المؤتلف NNVCP 195-338 أأ كعنصر تحكم إيجابية. تم إجراء تحليل نقطة وصمة عار باستخدام RG-M56 ماب. (ب) اليسار: تسلسل الأحماض الأمينية من الببتيدات الاصطناعية 8 مير، 195-202 أأ، أأ 197-204، و199-206 أأ. كان كل الببتيد السابقة تداخل 6 أأ-مخلفات طويل مع الببتيد التالية. وقد استخدم الاصطناعية الببتيد 195-214 أأ كعنصر تحكم إيجابية. الحق: تم إجراء تحليل نقطة وصمة عار باستخدام RG-M56 ماب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): مسح ألانين واستبدال الطفرات من 195 VNVSVLCR 202 حاتمة. تسلسل (A) الأحماض الأمينية من الطفرات إحلال وتحليل نقطة وصمة عار. كل أأ صesidue المنطقة حاتمة، 195-202 أأ، تم استبدال فردي مع ألانين. L200M الاستبدال هو تسلسل الوراثي SJNNV في البروتين معطف المنطقة حاتمة Betanodavirus. وقد استخدم الاصطناعية الببتيد 195-202 أأ كعنصر تحكم إيجابية. وشدد على بقايا أأ استبدالها. (ب) الكمي للتقارب إشارة نقطة وصمة عار ملزمة. تم تحديد كثافة إشارة لمراقبة إيجابية (195-202 أ أ) إلى 100٪. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: الحد الأدنى تقرير حاتمة. استخدمت مير 7 (A)، 6-مير (B)، و 5 مير (C) الببتيدات الاصطناعية 195-202 أأ لتحديد الحد الأدنى للحاتمة معترف بها من قبل RG-M56 ماب. pepti الاصطناعيةوقد استخدم دي 195-202 أأ كعنصر تحكم إيجابية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول تقنية سريعة ومباشرة لتحديد حاتمة الخطية المعترف بها ماب. مع الأخذ بعين الاعتبار تكلفة تركيب الببتيد وكفاءة الإنتاج من الببتيدات وتوليفها، تم تخفيض المنطقة مولدة للبروتين معطف الفيروس عن طريق التعبير عن البروتينات المؤتلف اقتطاع متسلسل قبل تحليل الببتيد المسح. على هذا النحو، تم استخدام نظام التعبير كولاي الحيوانات الأليفة موثوقة وفعالة لإنتاج هذه البروتينات المؤتلف اقتطاع بشكل متسلسل، والبروتينات المؤتلف مع الأوزان الجزيئية بين 10 و 50 كيلو دالتون يمكن التعبير بسهولة من خلال هذا النظام. وبهذه الطريقة، حاتمة يمكن ضاقت بسهولة لتصل إلى أكثر قابلية للإدارة 100-200 المنطقة أأ. وقد تم اختيار الناقل الحيوانات الأليفة 20B (+) على وجه التحديد، كما أنه يحتوي على تسلسل الرموز للتعبير عن 6xHis-العلامات، والسماح للبروتينات ينتج 6xHis العلامة الانصهار أن immunodetected استخدام أجسام مضادة لمكافحة 6xHis لتأكيد التعبير عن ع المؤتلفroteins. كانت بروتينات الغلاف المؤتلف المنتجة ثم تحليلها باستخدام RG-M56 ماب عبر نقطة وصمة عار التهجين الفحص. طريقة بديلة لالمؤتلف تحديد بروتين حاتمة هو تنقية البروتينات المؤتلف وأعرب عن طريق المعادن يجمد أيون تقارب اللوني 10، فصل البروتينات المؤتلف مع الكهربائي للهلام SDS-بولكرلميد، وإجراء تحليل لطخة غربية 3.

لخريطة أخرى، وبصورة أكثر دقة، موقع حاتمة تحددها نتائج تحليل التهجين نقطة وصمة عار استخدام البروتينات المؤتلف اقتطاع متسلسل، وقد صممت الببتيدات الاصطناعية متداخلة مع أحجام مختلفة. بين أطوال ممكنة مختلفة من الببتيد الاصطناعية لتجميع، 20 مير مع 10 وقد تم اختيار الببتيدات متداخلة لأول مرة في المسح الببتيد طويلة أأ-مخلفات، سواء بالنسبة عالية النقاء تأليفهم (حوالي 90٪) وطول الببتيد، وبما فيه الكفاية للبحث عن البريد مستمرpitope معترف بها من قبل B-خلية الأجسام المضادة 11. لاحظ أن دقة ونقاء من الببتيدات توليفها تتدهور كما الببتيد توليفها أطول. وبهذه الطريقة، تم تخفيض المنطقة حاتمة بسرعة إلى حوالي 10 بقايا أأ في الطول. بعد أن شملهم الاستطلاع مسلسل الببتيدات تداخل 8 مير، وقد عرفت المنطقة حاتمة الخطية إلى الببتيد 195-202 أأ. وفي وقت لاحق، والمسح الضوئي ألانين هذا 8 مير حاتمة الببتيد يكشف عن قوة تقارب ملزمة الحرجة من كل بقايا أأ، والسماح للبحث عن الحد الأدنى حاتمة. الأدوار الأساسية للV197، V199، وبقايا أأ C201 يعني أن المنطقة حاتمة خطية تغطي 5 على الأقل بقايا أأ، من 197 إلى 201. وعلاوة على ذلك، أأ بقايا V195، N196، وR202 يمكن استبدال مع ألانين دون أن تفقد تماما ملزمة تقارب، مشيرا إلى أن المنطقة حاتمة قد خفضت إلى 7، 6، 5، أو حتى بقايا أأ في الطول. تسلسل الببتيد الصغيرة يمكن توليفها بسهولة واقتصاديا للبحث عن الخطية (شاركntinuous) الحواتم. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب الببتيد المسح الاصطناعية ليست مناسبة لتحديد حاتمة متقطعة من الأجسام المضادة، ما لم يتم دمجها مع استئصال حاتمة والطيفي الشامل يحلل 12.

في هذا البروتوكول، تم استخدام تقنية التهجين نقطة وصمة عار للبحث في حاتمة خطية من ماب. نقطة وصمة عار التهجين هي طريقة بسيطة لكنها فعالة. في بداية البحث، عندما تضيق المنطقة حاتمة أسفل من المناظر الطبيعية على نطاق واسع، ومصدر القلق الرئيسي هو أن نلاحظ أي إشارة إيجابية أو سلبية بعد التهجين من الأجسام المضادة لهدف بروتين بغشاء، حيث أن معظم MABS ربط فقط إلى حاتمة محددة من البروتين الأنتيجين (الشكلان 1 و 2). ومع ذلك، عند استخدام نقطة وصمة عار التهجين لاستكشاف مدى توافر ملزمة من كل بقايا أأ داخل المنطقة حاتمة ضد الأجسام المضادة، مثل الطفرات استبدال ألانين،يجب أن تؤخذ كثافة إشارة من كل بقايا أأ استبداله يحددها النشاف نقطة إلى أهمية الملزمة الشاملة. أن كثافة إشارة يمكن قياسها بسهولة باستخدام برمجيات تحليل الصور (الشكل 3B) أو قياس شدة الضوء. بدلا من ذلك، مقايسة المناعية الماصة انزيم مرتبط (ELISA) لا يمكن أن يؤديها لقياس درجة تقارب ملزمة وما ينتج عنه من قوة الإشارة 3.

في دراسة سابقة، كان البروتين معطف وحيد من غير المغلف للفيروسات تنخر العصبي المناعية التي تعترف بها 10 MABS مع قيمة مؤشر تحييد عالية بين 6،5-4،5 (سجل 10 NI) 2. واستخدمت القدرة الاعتراف محددة للغاية من MABS كذلك إلى تطوير خطوة واحدة، سريعة عدة التشخيص المناعي للكشف عن الأسماك المصابة NNV-13. تم الاعتراف حاتمة مولدة من بروتين العصبي معطف فيروس نخر من قبل RG-M18ماب باعتبارها الببتيد 8 مير، 195 VNVSVLCR 202 3، التي من خلالها تم التعرف رواية NNV مستقبلات (بيانات غير منشورة). في هذه الدراسة، وقد ضاقت حاتمة من نخر العصبي البروتين معطف الفيروس إلى مزيد من الانخفاض لالببتيد 6 مير، 196 NVSVLC 201، قبل ماب الآخرين، RG-M56.

ومن غير المتوقع أن اثنين من الببتيدات 7 مير (196 NVSVLCR 202 و 195 VNVSVLC 201) التي تحتوي على 6 مير الببتيد 196 NVSVLC 201 لا تعترف بها RG-M56 ماب (الشكل 4A). تفسير معقول هو أنه، على الرغم من أن المخلفات المحيطة V195 و R202 قد لا تساهم بشكل مباشر في التفاعل ملزم بين حاتمة والأجسام المضادة، وبقايا المحيطة تؤثر على تشكيل التشكل الببتيد الصحيح للاعتراف الأجسام المضادة. ظهور V195 أو R202 في محطة المرافقة وحدها قد تشوه الببتيد الاصطناعيةالتشكل للاعتراف الأجسام المضادة وملزمة. هو الدافع وراء التشكل حاتمة من قبل قوة من كلا ترميني، V195 و R202، وهي متوازنة ضد بعضها البعض في الببتيد الاصطناعية 8 مير، 195 VNVSVLCR 202، وتصدى في الببتيد الاصطناعية 6 مير، 196 NVSVLC 201. بقايا أأ، V195، N196، وR202، يمكن استبدال بشكل فردي مع ألانين دون القدرة ملزمة فقدان تماما، وبالتالي، فإن النتائج ألانين المسح الطفرات تشير إلى أن هذه المخلفات أأ ثلاثة قد لا تلعب دورا هاما في الاعتراف وملزمة من RG -M56 ماب. ومع ذلك، بعد تقليم أكثر واحد بقايا من الببتيد الاصطناعية 6-مير، 196 NVSVLC 201، الببتيد 5 مير، 197 VSVLC 201، دون N196 في المنطقة N-محطة المرافقة، يفقد القدرة على الاعتراف بها والالتزام RG -M56 ماب (الشكل 4C). وتشير هذه النتيجة إلى أن بقايا N196 يجوز أيضا صوضع دورا هاما في المنطقة المحيطة للحاتمة لتحقيق الاستقرار في التشكل حاتمة الصحيح من أجل تسهيل الاعتراف وتجليد RG-M56 ماب. كما تم استكشاف أهمية المرافقة المخلفات المحيطة بالمنطقة حاتمة دراسات أخرى ملزمة ضد مستضد. وكان التحقيق أهمية المرافقة بقايا أأ المحيطة بالمنطقة حاتمة α-بنغاروتوكسين لملزمة من الأجسام المضادة باستخدام بدائل أأ مختلفة داخل نفس فرعي الكوليني. ثم تم تقييمها على أنها إما ضرورية، مؤثرة، أو ليس مؤثرا 14. وتبين أيضا أن خصوصية حاتمة المعترف بها الأجسام المضادة من mucins الظهارية المرتبطة سرطان يمكن زيادة تتأثر بقايا أأ المرافقة. هذه الآثار قد تقدم الحواجز بتكوين التي يمكن أن تعيق ملزمة من الأجسام المضادة للحاتمة 15.

حاتمة 6 مير، 196 NVSVLC 201 </ دون>، لديها ميزات مسعور للغاية، مع أربعة بقايا مسعور، من بينهم اثنان من valines (197 و 199)، ليسين واحد (200)، والسيستين واحد (201) (شكل انخفاض). بقايا V197، V199، وC201 حاسمة للاعتراف RG-M56 ماب وملزمة، على النحو الذي يحدده الطفرات المسح ألانين. وتقع المنطقة حاتمة في واحد من ثمانية لمكافحة موازية β-خيوط المجال قذيفة (S-المجال) من NNV بروتين معطف (16). ومن المثير للاهتمام، لا يظهر حاتمة على المجال نتوء خارجي، ولكن يخفي في هيكل هلام لفة من S المجال تحت الأخرى المضادة للالموازية β-فروع. حاتمة، مع للا مائية عالية، قد الحصول على المكروية أكثر استقرارا في هذا الاكتئاب. وعلاوة على ذلك، تم العثور على 195 VNVSVLCR 202 3 الببتيد من هذا حاتمة لعرقلة انتشار الهامور العملاق فيروس نخر العصبي في الخلايا الهامور الدماغ. لذلك، اقترح هذا الببتيد حاتمة أن يكون المشاركmpetitor تشارك في المجال ملزم مستقبلات المطلوبة للدخول الفيروس 3. كان الافتراض بأن مثبطات دخول الببتيد متضمنه بقايا مسعور و / أو متقابلة الزمر يمكن أن تغير التشكل الطبيعية والكيمياء واجهات الغشاء الخلوي، ويمكن أن تعوق اندماج الأغشية الخلوية والفيروسية 17. وعلاوة على ذلك، أظهرت العديد من مثبطات دخول الببتيد الاصطناعية خصائص مثبطة قوية ضد مختلف العدوى بالفيروس 17 و 18. وبالتالي، الببتيد حاتمة التي تم تحديدها مع بقايا مسعور وتثبيط دخول قوي ضد العدوى NNV قد تسهل تطوير عقاقير الببتيد العلاجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hybrid-SFM medium Gibco 12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) Gibco 21600-069
Pfu DNA Polymerase  Thermo Scientific  EP0502  Including buffers
T4 DNA Ligase Roche 10799009001 Including buffers
NdeI  New England Biolabs R0111S Including buffers
XhoI  New England Biolabs R0146S Including buffers
pET-20b(+) vector Novagen, Merck Millipore 69739
E. coli DH-5α competent cell RBC Bioscience RH617
E. coli BL-21(DE3) competent cell RBC Bioscience RH217
Ampicillin Amresco 0339-25G
LB broth  Invitrongen 12780-052
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) MDBio, Inc. 101-367-93-1
Methanol Merck Millipore 106009
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T.Baker X251-07
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Glycine Amresco 0167-5KG
Tris Affymetrix, USB 75825
NaCl Amresco 0241-1KG
EDTA Amresco 0105-1KG
Glycerol Amresco 0854-1L
NaN3 Sigma S2002-500G
BCIP/NBT PerkinElmer NEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody Jackson ImmunoResearch 115-055-008
Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) Merck Millipore IPVH00010
Protein G Agarose Fast Flow Merck Millipore 16-266
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106
UVP BioSpectrum 600 Image System UVP n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 UVP n/a
MyCycler thermal cycler BioRad 1709713

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
  2. Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
  3. Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
  4. Lai, Y. -S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
  5. Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
  6. Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
  7. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  8. Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
  9. Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
  10. Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
  11. Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
  12. Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
  13. Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. The Aquaculture of Groupers. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).
  14. Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
  15. Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
  16. Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
  17. Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
  18. Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).

Tags

علم المناعة، العدد 121، ورسم الخرائط الببتيد، الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، حاتمة الخطية، نقطة وصمة عار التهجين والمسح الضوئي ألانين، والاستبدال، المستضدية، وتحييد الأجسام المضادة، فلوريد البولي
تحديد حاتمة الخطي B-خلية المعترف بها الأجسام المضادة وحيدة النسيلة-الببتيد الضوئي بمساعدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. W., Chang, C. Y. Peptide… More

Chen, C. W., Chang, C. Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J. Vis. Exp. (121), e55417, doi:10.3791/55417 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter