Abstract
Идентификация антигенный эпитоп иммунной системой позволяет для понимания защитного механизма нейтрализующих антител, которые могут способствовать разработке вакцин и пептидных лекарственных средств. Сканирование Пептид представляет собой простой и эффективный метод, который отображает прямолинейно линейный эпитоп, распознаваемый моноклональным антителом (МАБ). Здесь авторы представляют методологию определения эпитопов с участием последовательно укороченные рекомбинантных белков, синтетический пептид дизайн и дот-блот-гибридизацию для антигенного распознавания нервного вируса некроза белка оболочки, используя нейтрализующий мАт. Этот метод основан на дот-блот-гибридизации синтетических пептидов и моноклональных антител на поливинилиденфторида (PVDF) мембрану. Минимальная антигенную область вирусного белка оболочки, признанной RG-М56 мАт может быть сужен на шаг за шагом отделан пептидный отображение на 6-мерный пептид эпитопа. Кроме того, аланин-сканирующий мутагенез и остаток субзаместительной может быть выполнена, чтобы характеризовать связывающую значимость каждого аминокислотного остатка, составляющих эпитоп. Были найдены остатки, фланкирующие сайт эпитоп играть решающую роль в регуляции пептидный конформации. Указанный эпитоп пептид может быть использован для образования кристаллов эпитипа пептидных-антитело для дифракции исследования рентгеновского и функциональной конкуренции, или для терапии.
Introduction
В иммунной системе, рекомбинация сегментов V, D и J позволяет создавать антитела огромные вариации определяющие комплементарность области (CDR) , для связывания с различными антигенами , чтобы защитить хозяина от патогенных инфекций. Нейтрализатор защита антител против антигенов, зависит от пространственной комплементарности между CDRs антител и эпитопов антигенов. Таким образом, понимание этого молекулярного взаимодействия будет способствовать профилактический дизайн вакцин и терапевтический пептид наркотиков. Тем не менее, это взаимодействие нейтрализация может влиять как несколькими антигенные домены из одного антигена и множественными CDRs антител, которые, следовательно, делает процесс определения эпитопов более сложным. К счастью, развитие гибридомной технологии, которая плавит отдельные антитело-продуцирующих клеток с клетками миеломы, позволяет постоянно делящей партии клеток в сексплетение одно специфическое антитело, известное как моноклональное антитело (монАТ) 1. Клетки гибридомы производят эти чистые, высоким сродством мАт связываться с одного антигенного домена специфического антигена. При соотношении антиген-антитело, установленного несколько подходов, в том числе пептидов сканирования, могут быть использованы для определения эпитопа антигена с использованием его соответствующего мАт. Последние разработки в области синтетической пептидной технологии сделали метод пептидного сканирования более доступной и удобной для выполнения. Если коротко, то множество перекрывающихся синтетических пептидов, получают в соответствии с последовательностью антигена-мишени и связаны с твердой подложке мембраны для монАТ гибридизации. сканирование Пептид не только предлагает простой способ отображения антитела область связывания, но также облегчает аминокислоту (аа) мутагенеза с помощью сканирования остатка или замещения для оценки связывания взаимодействия между каждым аа остатком эпитопа пептида и CDR-антитела.
2, 3, 4. Протокол включает MAB подготовку, конструкции и экспрессии серийно усеченных рекомбинантных белков, синтетический перекрывающийся дизайн пептид, дот-блот-гибридизацию, сканирование аланин, а также заместительную мутагенеза. Принимая во внимание высокую стоимость синтеза пептидов, стадия последовательно усечения рекомбинантных белков желаемого целевого белка был изменен, и антигенную область была сужена до приблизительно 100 до 200 аминокислотных остатков, прежде чем синтетический пептид массив анализ дот-блот был проведен.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление моноклонального антитела
- Культура RG-M56 мышиные моноклональные гибридомные клетки 2 в среде без сыворотки в 175T колбах при температуре 37 ° С с 5% CO 2 дополнения. Собирают супернатант, когда цвет среды становится желтым после пяти дней инкубации.
Примечание: гибридомы клетки культивировали в среде без сыворотки, чтобы избежать загрязнения антител из сыворотки плода коровы. - Центрифуга супернатант при 4500 х г в течение 30 мин при 4 ° С и отбросить клеточных остатков гранул.
- Добавляют 2 мл белка G агарозы (поставляется в виде 50% -ной суспензии) в колонку с 5 мл и уравновешивают 10 объемами смолы (10 мл) охлажденного льдом PBS.
- Нагрузка 200 мл супернатанта антитела (шаг 1,2) на колонку и отбрасывать сквозную.
- Добавить 10 мл охлажденного льдом PBS в колонну, чтобы вымыть его. Повторите дважды.
- Добавляют 10 мл 50 мМ глицина, рН 2,7 в колонку для элюирования белка G-связанного антитела. седлоLect 900 мкл фракции в микроцентрифуге пробирку, содержащую 100 мкл 10-кратного буфера для нейтрализации (1 М Трис, 1,5 М NaCl и 1 мМ ЭДТА, рН 8,0).
- Храните очищенного антитела в 50% глицерина с 0,03% NaN 3 при температуре -20 ° С .
2. Конструирование и экспрессия Серийно усеченных рекомбинантных белков
- Приготовьте Реакционная смесь для ПЦР: 5 мкл 10 - кратного Pfu буфера, 0,2 мМ каждого из дНТФ, 0,2 мкМ прямого праймера 3, 0,2 мкМ обратного праймера , 3, 2 мМ MgSO 4, 1 нг pET20b-1A59 3 плазмидной ДНК, и 2,5 ед ( блок) ПФУ ДНК - полимеразы; добавить DDH 2 O до конечного объема 50 мкл.
- Запуск образцов в автоматическом термоциклеру с использованием следующих параметров: Цикл 1 (94 ° С в течение 5 мин); циклы 2-36 (94 ° С в течение 30 с, 63 ° С в течение 30 с, и 72 ° С в течение 60 сек); и цикл 37 (72 ° С в течение 7 минут).
- Экстракт полимеразной цепной реакции (ПЦР) продуктов с использованием набора для очистки ПЦР - 5 , чтобы облегчить следующую расщепления ферментами рестрикции.
- Переваривать ПЦР-амплифицированные фрагменты ДНК с помощью ферментов рестрикции Nde I и Xho I и перевязывать каждый из этих фрагментов ДНК в Nde I и Xho I фермент расщепляется пет-20b (+) вектора. Transform конструкции , в кишечной палочки DH-5-альфа-компетентных клеток 6.
- Готовят Переваривание смеси в пищеварении буфере (20 мМ Трис-ацетат, 10 мМ Mg (CH 3 COO) 2, 50 мМ KCH 3 СОО, и 1 мМ ДТТ, рН 7,9) с 1 мкг ПЦР-амплифицированной ДНК или полиэтилентерефталата-20B (+) , ДНК - вектор, и 2 ед Nde I и ограничение Xho I ферменты в конечном объеме 20 мкл.
- Смешайте переваривания смесь осторожно и быстро вращаться вниз. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 ч в бане сухой, чтобы обеспечить полное разрезание ограничение сидетьэс.
- Экстракт энзим-расщепленный ДНК - фрагментов рестрикции с использованием набора для очистки ПЦР - 5 , чтобы облегчить следующую конструкцию плазмиды.
- Готовят смесь лигирования в лигирующем буфере (66 мМ Трис, 5 мМ MgCl 2, 1 мМ АТФ и 5 мМ ДТТ, рН 7,5) с 100 нг легкоусвояемым, ПЦР-амплификации ДНК, 10 нг предварительно переваренный пет-20b (+) ДНК-вектор, и 5 ед ДНК-лигазы Т4 в конечном объеме 10 мкл.
- Смешайте лигирования смесь осторожно и быстро вращаться вниз. Инкубируют при 16 ° С в течение 18 часов на водяной бане.
- Поместите 10 мкл образцов лигирования в 100 мкл DH-5α-компетентных клеток и осторожно перемешать до размещения микроцентрифужных трубки на льду в течение 30 мин. Поместите микроцентрифужных трубку в сухом бане при температуре 42 ° С в течение 90 секунд , чтобы вызвать теплового шока 7. Сразу передачи трубки на льду в течение 2 мин.
- Добавить 900 мкл Лурии-Бертани (LB) бульона (1% Васто триптона, 0,5% Васто дрожжи Extracт, и 0,5% NaCl, рН 7,0) к трубе. Инкубируют при 37 ° С при 150 оборотов в минуту встряхивания в течение 45 мин. Гранул клетки центрифугированием при 4000g в течение 10 мин и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют осадок с 50 мкл LB бульона и распространить каждое преобразование на предварительно нагретый пластин LB, содержащей 100 мкг / мл ампициллина. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 16 ч.
- Возьмите одну колонию с использованием наконечника 200 мкл и поместить его в 3 мл LB бульона, содержащего 100 мкг / мл ампициллина, в неполностью закрываютс крышкой 15 мл трубки. Инкубируют при 37 ° С при 150 оборотов в минуту встряхивания в течение 12 ч.
- Извлечение ДНК плазмиды 8 из каждой культуры и последовательность его , используя Т7 промотор и терминатор Т7 праймеров для подтверждения последовательности 9.
- После подтверждения последовательности, преобразование 10 нг ДНК из этих пет-20b (+) плазмиды с различной длины гена белка оболочки YGNNV в штамм BL-21 (DE3) кишечной палочки намиИНГ метод теплового шока 7. Выполните шаги 2.3.6-2.3.8 для выполнения преобразования.
- Перенести одну колонию от каждого трансформированной Е.coli BL-21 клеток в 3 мл LB бульона , содержащего 100 мкг / мл ампициллина , в неполностью закрываютс крышкой 15 мл трубки. Инкубируйте культуру при 37 ° С с 150 оборотов в минуту дрожать.
- Охлаждают культуру 25 градусов Цельсия при OD 600 культуры составляет около 0,6 и добавляют IPTG до конечной концентрации 0,4 мМ , чтобы индуцировать экспрессию рекомбинантного белка. Выдержите культуры за дополнительную 4 ч при 25 ° С при 200 оборотов в минуту дрожать.
- Перенесите 1 мл культуры в микроцентрифужных трубки. Гранул клетки центрифугированием при 12000 х г в течение 1 мин и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл буфера для денатурации (8 М мочевины, 20 мМ фосфата натрия и 0,5 М NaCl, рН 7,4) с помощью пипетки вверх и вниз с помощью микропипетки. Смешайте энергичным встряхиванием.
Примечание: Образец зольТеперь utions должны быть полупрозрачными, немного липкое, и готов к гибридизации дот-блот.
3. Проектирование и синтез перекрывающихся пептидов
- Дизайн и синтезировать 3 последовательных 20-мерные пептиды , которые каждая пересекаются с его преемником на 10 аминокислотных остатков от 195-338 аа области белка YGNNV пальто сужать эпитоп область RG-М56 мАт по блоттинг.
- Дизайн и синтезирующие 3 три 8-мерные пептиды (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204 и 199 VLCRWSVR 206) с перекрытием 6 аминокислотных остатков на следующий синтетический пептид , чтобы сузить область эпитоп 195-206 аа по блоттинг.
- Дизайн и синтезировать 3 7-меров (196 NVSVLCR 202 и 195 VNVSVLC 201), 6-мерный (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, и 197 VSVLCR 202), а также 5-мерные пептиды (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201 и 198 SVLCR 202) с перекрытием 6, 5 и 4 аминокислотных остатков, соответственно, на их соседних пептидов минимизирующих эпитоп область по блоттинг.
4. Dot-блотгибридизации
- Растворите каждый синтезированный пептид в диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации 10 мг / мл.
Примечание: Для того, чтобы преодолеть разнообразные растворимость синтетических пептидов, все синтетические пептиды должны быть растворены в ДМСО. ДМСО является хорошим растворителем для полного растворения гидрофобные или гидрофильные пептиды. - Замачивание поливинилиденфторид (PVDF) мембрану с метанолом в течение 2 мин.
Примечание: ПВДФ мембраны до 100% устойчив к ДМСО; другие не могут быть так. - Равновесие ПВДФ мембраны с модифицированным буфером Towbin (25 мМ Трис, 192 мМ глицина и 0,1% SDS, рН 8,3) для2 мин.
Примечание: на 10-20% (об / об) метанола может быть добавлен в модифицированном буфере Towbin, чтобы улучшить результаты передачи. - Промыть кусок хроматографической бумаги с модифицированным буфером Towbin. Поместите PVDF мембрану на бумажной хроматографии. Подождите, пока модифицированный буфер Towbin не исчез с поверхности мембраны ПВДФ прежде чем переходить к следующему шагу.
- Добавляют 2 мкл каждого образца пептида к мембране с наконечником 10 мкл. Высушите PVDF мембрану на бумажной хроматографии в течение 10 мин. Добавьте каждый пептид образец медленно и постепенно на мембрану, чтобы избежать слишком большого количества диффузии.
- Блок мембраны в буфере TBST (0,05% (об / об) твина-20, 20 мМ Трис и 150 мМ NaCl, рН 7,4) с 5% обезжиренным молоком в течение 30 мин при комнатной температуре при осторожном встряхивании.
- Добавить RG-M56 мАт при конечном разведении 1: 1000 в буфере TBST с 5% обезжиренным молоком в мембране. Инкубируйте мембраны при 37 ° С в течение 1 ч при осторожном встряхивании.
- Удалить антитела таклюция. Промывают мембрану в буфере TBST в течение 5 мин при осторожном встряхивании. Повторите дважды.
- Добавить вторичные антитела (козье антитело против мышиного IgG, Fc, конъюгированный щелочной фосфатазы) при конечном разведении 1: 5000 в буфере TBST с 5% обезжиренным молоком в мембране. Инкубируйте мембраны при 37 ° С в течение 1 ч при осторожном встряхивании.
- Выбросьте раствор антител. Промывают мембрану в буфере TBST в течение 5 мин при осторожном встряхивании. Повторите стадию промывки дважды.
- Разработка мембраны с раствором субстрата BCIP / NBT при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте. Остановить развиваемого промывки мембраны с DDH 2 O при появлении сигнала.
- Высушите мембрану и захватить дот-блот изображение, используя систему изображения.
- Измерьте интенсивность каждого дот - блоттинга с использованием программного обеспечения для анализа изображения 3.
5. аланин Сканирование и Замена
- Дизайн и синтезировать 3 аланин и Methionine замещения пептидов. Сменяют друг аа остатки аланина для 8-мерного пептида 195 VNVSVLCR 202 и синтезируют пептиды 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202 и 195 VNVSVLCA 202 , Заменить аа остаток лейцина 200 в метионин для создания SJNNV генотип эпитоп пептида 195 VNVSVMCR 202.
- Следуйте Раздел 4 для выполнения аланин сканирования и замещение мутагенеза дот-блоттинга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цель этого эксперимента заключалась в определении эпитоп через блоттинг с использованием мАт. Для того, чтобы быстро и эффективно сузить антигенный область признана мАт, полнометражный и серийно усеченные YGNNV рекомбинантные белки оболочки с слитого тегом 6xHis на С-конце были выражены из системы экспрессии кишечной палочки ПЭТ 10 (рис 1А). Полученные рекомбинантные белки были замечены на PVDF мембрану с помощью RG-M56 МАБ и анти-6xHis антитела для дот-блот-гибридизации. Блоттинг показал положительные сигналы от 1-338 аа (полноразмерного), 51-338 аа и аа 195-338, но не 1-100 аа или 1-200 аа рекомбинантных белков (Фигура 1В). Массив точек гибридизуют против антитела против 6xHis и подтвердил экспрессию всех рекомбинантных белков. Эти данные указывают на то, что эпитоп распознавания RG-М56 мАт расположен в 144-AA рекомбинантного белка СВАR С-конец YGNNV белка оболочки (195-338 а.о.).
Впоследствии, серийные 20-мерные пептиды с 10 AA-остатки длиной перекрывается на их сосед были разработаны и синтезированы из последовательности 144-аа рекомбинантного белка для пептида сканирования, чтобы сузить область эпитоп. Эти синтетические пептиды были замечены на PVDF мембрану и подвергали дот-блот-гибридизации с использованием RG-M56 мАт. Результаты показали положительные сигналы только на пептид 195-214 а.о. и положительным контролем, 195-338 аа рекомбинантного белка (фиг.2А). По мере того как эпитоп расположен внутри пептида 195-214 аа области, но не аа области пептида 205-224, три последовательных 8-мерные пептиды с 6-аминокислотных остатков перекрываются из аа остатков 195-206 (пептиды 195-202 а.о., 197- 204 аа, и 199-206 аа) были разработаны и синтезированы. Дот-блот результаты гибридизации показали положительные сигналы на пептид 195-202 а.о. и позитивного контрол пептида 195-214 а.о., используяRG-М56 мАт (Фигура 2В).
Аланин - сканирующий мутагенез и замещение проводили для оценки специфичности каждого аа остатка 8-членного эпитопа, 195 VNVSVLCR 202. Каждый аа остаток 8-членного пептида по отдельности заменены на аланин. Аланин пептид массив затем помещали на ПВДФ-мембрану с использованием пептида 195-202 AA в качестве положительного контроля. Анализ Дот-блот показал , что три мутации заменяющие, V197A, V199A и C201A, отменила сродство связывания RG-М56 мАт (рис 3А). Хотя аа остаток 200 в SJNNV генотипа эпитоп представляет собой метионин, в отличие от лейцина в остальных четырех Betanodavirus генотип эпитопов, последовательность SJNNV генотип, 195 VNVSVMCR 202, показали положительную связывающую аффинность в отношении RG-М56 мАт, как у положительного контроля (Рисунок 3А). Этот результат указывает на то, что эпитопы Oе все генотипы Betanodavirus могут быть признаны RG-М56 мАт. Сродство каждого участвующего аа остатка на сайт эпитоп дополнительно количественно путем измерения интенсивности сигнала дот - блоттинга каждого аланин замещения с использованием программного обеспечения для анализа изображений (Рисунок 3B). Интенсивности V197A, V199A и C201A замен были снижены до 10,2%, 18,6% и 8,5%, соответственно, по сравнению с таковыми из положительного контроля (100%), в то время как V195A, S198A, L200A, R202A, и L200M замены показали более высокие или аналогичные интенсивности, что и положительного контроля. Стоит отметить, что влияющий прочность замещения N196A неоднозначно, с уменьшением положительного контроля на 37,4%. Эти результаты указывают на то, что V197, V199 и C201 являются существенными остатками для связывания RG-М56 мАт.
Результаты сканирования аланина мутагенеза показывают, что аа остатки V195, N196 и R202 можетзаменить на аланин, что означает, что область, эпитоп может быть дополнительно сужен на обоих концах. Таким образом, шаг за шагом отделан пептидного картирования с помощью 7-меров, 6-меров и 5-мерным стадии синтеза пептидов был разработан, чтобы минимизировать антигенный область. Положительный сигнал присутствовал на 6-членного синтетического пептида 196 NVSVLC 201, но не на 7-членных и 5-членных синтетических пептидов (рис 4). Эти данные указывают на то, что минимальный эпитоп NNV белка оболочки , признанного RG-М56 мАт является 6-мерный пептид, 196 NVSVLC 201.
Рисунок 1: Уменьшение области эпитопа с использованием серийно усеченные рекомбинантных белков и моноклональных антител. (A) Карта последовательно укороченных рекомбинантных NNVCPs. NNVCP 1-338 аа является белок оболочки полной длины. (Б) Dot-Блот анализ рекомбинантных NNVCPs. Слева: Карта серийно усеченных YGNNV рекомбинантного белков оболочки на PVDF мембрану. Средний: Анализ дот-блот проводили с использованием анти-6xHis антитела. Справа: Анализ дот-блот проводили с использованием RG-M56 мАт. NNVCP: вирус нервным некроз белка оболочки; AA: аминокислоты; PVDF: поливинилиденфторид; N: N-конец; С: С-концевая; МАт: моноклональное антитело. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Точная отображение области эпитопа с использованием синтетических пептидов. (A) Слева: Аминокислотные последовательности из 20-мерных синтетических пептидов были приведены в соответствие с NNVCP 195-338 аа; каждый предшествующий пептид имел 10-аа остатки НЕПРЕРЫВНОМУ перекрытия со следующим пептида. Справа: Карта сynthetic пептидов на PVDF мембрану. Рекомбинантный NNVCP 195-338 аа был использован в качестве положительного контроля. Анализ дот-блот проводили с использованием RG-M56 мАт. (B) Слева: аминокислотные последовательности из 8-мерных синтетических пептидов, 195-202, 197-204 аа аа и аа 199-206; каждый предшествующий пептид имел 6-аа остатки НЕПРЕРЫВНОМУ перекрытия со следующим пептида. Синтетический пептид 195-214 AA был использован в качестве положительного контроля. Справа: Анализ дот-блот проводили с использованием RG-M56 мАт. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Аланин сканирование и замещение мутагенез 195 VNVSVLCR 202 эпитоп. Последовательности (A) Аминокислотные замены мутагенеза и анализа дот-блоттинга. Каждый аа гesidue области эпитопов, 195-202 аа, был заменен индивидуально с аланин. замещение L200M представляет собой последовательность генотип SJNNV на эпитоп белка оболочки области Betanodavirus. Синтетический пептид 195-202 AA был использован в качестве положительного контроля. Замещенные остатки аа подчеркнуты. (В) Количественное связывания дот - блот сигнала сродства. Интенсивность сигнала положительного контроля (195-202 а.о.) была определена как 100%. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Минимальное определение эпитоп. 7-мерный (А), 6-мерный (В), и 5-мерный (С) синтетические пептиды из 195-202 а.о. были использованы для определения минимального эпитоп , распознаваемый RG-М56 мАт. Синтетические peptiде 195-202 аа был использован в качестве положительного контроля. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол предлагает быстрый и простой метод для идентификации МАБ признан линейный эпитоп. Принимая во внимание стоимость пептидного синтеза и эффективности производства синтеза пептидов, антигенный участок белка вируса оболочки был уменьшен путем экспрессии последовательно укороченные рекомбинантные белки перед проведением анализа пептидного сканирования. Таким образом , надежная и эффективная система экспрессии кишечной палочки ПЭТФ используется для производства этих серийно усеченные рекомбинантных белков, как и рекомбинантные белки с молекулярной массой от 10 до 50 кДа , может быть легко выражены через эту систему. Таким образом, эпитоп может быть легко сузить до более управляемого 100 до 200 аа области. Питомец-20b (+) вектор был специально выбран, так как он содержит последовательность, которая кодирует экспрессию 6xHis-тегов, позволяя произведенный слитых 6xHis-таг белков быть иммунодетектировали с использованием антитела анти-6xHis, чтобы подтвердить экспрессию рекомбинантный рroteins. Полученные рекомбинантные белки оболочки затем были проанализированы с помощью RG-M56 мАт с помощью гибридизации дот-блот. Альтернативный способ рекомбинантного белка определения эпитоп для очистки экспрессированных рекомбинантных белков через иммобилизованным ионом металла аффинной хроматографии 10, отделяют рекомбинантные белки электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле, а также выполнять Вестерн - блот - анализ 3.
Для дальнейшего и более точно отобразить расположение эпитоп определяется по результатам анализа гибридизацией дот-блот с использованием серийно укороченные рекомбинантные белки, синтетические пептиды, пересекающиеся с различными размерами, были разработаны. Среди различных возможных длин синтетического пептида синтезируют, 20-звенного с 10 пальчиковых остатков НЕПРЕРЫВНОМУ были выбраны перекрывающие пептиды сначала в пептидной сканирования, как для их высокой чистоты синтеза (около 90%), а также за их пептидной длины, достаточно для поиска непрерывной еpitope признана B-клеток антитела 11. Обратите внимание, что точность и чистота синтезированных пептидов ухудшаются как синтезирован пептид длиннее. Таким образом, область эпитоп быстро снижалось до приблизительно 10 аминокислотных остатков в длину. После того, как были опрошены последовательные 8-членные, перекрывающие пептиды, линейный участок эпитоп был определен к пептиду 195-202 аа. Впоследствии, аланин сканирование этого 8-мерного эпитопа пептида показывает критическую прочность связывания сродства каждого остатка аа, что позволяет поиск минимального эпитопа. Основные роли в V197, V199 и C201 аминокислотных остатков означает, что линейный участок эпитоп охватывает по меньшей мере, 5 аминокислотных остатков, от 197 до 201. Кроме того, остатки аа V195, N196 и R202 может быть заменен на аланин без полной потери связывания сродство, что указывает, что область эпитоп может быть снижена до 7, 6, или даже 5 остатков ак в длину. Небольшие пептидные последовательности могут быть легко и экономично синтезирован для поиска линейных (соntinuous) эпитопы. Тем не менее, этот синтетический метод пептидного сканирования не подходит для определения прерывистого эпитопа антитела, если она не совмещена с эпитоп иссечением и масс - спектрометрический анализы 12.
В этом протоколе, метод гибридизации дот-блот используется для поиска линейный эпитоп мАт. Дот-блот гибридизация является простой, но эффективный метод. В начале поиска, когда область эпитоп сужен от крупномасштабного пейзажа, главной заботой является наблюдение либо положительный или отрицательный сигнал после гибридизации антитела к мишени связанного с мембраной белка, так как большинство мАт только связываются со специфическим эпитопом антигенного белка (фиг.1 и 2). Тем не менее, при использовании дот-блот-гибридизацию, чтобы исследовать связывания доступности каждого остатка аа в пределах области эпитоп, против антитела, например, путем аланин замещения мутагенеза,интенсивность сигнала каждого замещенного остатка аа определяется дот-блоттинга следует учитывать общее значение связывания. Эта интенсивность сигнала может быть определена количественно легко с помощью программного обеспечения для анализа изображений (Рисунок 3B) или денситометр. В качестве альтернативы, иммуноферментный анализ связанный с ферментом (ELISA) , могут быть выполнены , чтобы количественно определить степень аффинности связывания и результирующую силу сигнала 3.
В предыдущем исследовании, единственным белок оболочки не-оболочки вируса нервного некроза был иммуноферментные признан 10 мАт с высокой нейтрализацией значением индекса от 6,5 до 4,5 (log 10 NI) 2. Высокоспецифичным способность признания мАт дальнейшем использованы для разработки одностадийного, быстрый иммунохроматографической диагностический набор для обнаружения NNV-инфицированной рыбы 13. Антигенный эпитоп нервного белка вируса некроза пальто был признан RG-M18МАт как 8-мерного пептида, 195 VNVSVLCR 202 3, с помощью которого новый NNV рецептор был идентифицирован (неопубликованные данные). В настоящем исследовании, эпитоп нервной некроза белка оболочки вируса дополнительно сужен до 6-мерного пептида, 196 NVSVLC 201, по другим биосфера, RG-M56.
Это является неожиданным , что два 7-мерные пептиды (196 NVSVLCR 202 и 195 VNVSVLC 201) , содержащие 6-мерного пептида 196 NVSVLC 201 не распознаются RG-М56 мАт (рис 4A). Разумной интерпретации является то, что, несмотря на то окружающие остатки V195 и R202 не могут непосредственно способствовать связывающим взаимодействия между эпитопом и антителом, фланкирующие остатки влияют на формирование правильного пептида конформацию для распознавания антител. Появление V195 или R202 на их фланговых конце само по себе может искажать синтетический пептидконформацию для распознавания антител и связывание. Эпитоп конформация управляется силой на обоих концах, V195 и R202, которые сбалансированы друг против друга в 8-членного синтетического пептида, 195 VNVSVLCR 202, и противодействуют в 6-членного синтетического пептида, 196 NVSVLC 201. Аа остатки, V195, N196 и R202, может быть индивидуально заменен аланина без полной потери связывающей способности, и, таким образом, результаты сканирования аланина мутагенеза показывают, что эти три аминокислотных остатков не может играть существенную роль в распознавании и связывании RG -M56 мАт. Тем не менее, после обрезки еще один остаток от 6-членного синтетического пептида, 196 NVSVLC 201, 5-мерный пептид, 197 VSVLC 201, без N196 в N-концевой фланкирующей области, теряет способность быть признанным и обязательность RG -M56 моноклональное антитело (рис 4C). Этот результат позволяет предположить, что остаток N196 может также рзаложить важную роль в фланкирующей области эпитопа для стабилизации правильного эпитопа конформацию для того, чтобы облегчить признание и связывание RG-М56 мАт. Важность фланкирующих остатков, окружающих область эпитоп были также исследованы другие антиген-антитело исследований связывания. Значение фланкирующих аминокислотных остатков, окружающих эпитоп область α-бунгаротоксина для связывания антител исследовали с использованием различных замен аа в пределах того же холинергической дочернем. Затем они были оценены как либо существенным, влиятельный, или не влиятельная 14. Было также установлено, что специфичность антитела узнаваемым эпитопу карциномы ассоциированного эпителиальных муцинов может быть далее под влиянием фланкирующих остатков Аа. Эти эффекты могут представлять конформационные барьеры , которые могут препятствовать связывание антитела с эпитопом 15.
6-мерный эпитоп, 196 NVSVLC 201 </ Суб>, имеет чрезвычайно гидрофобные черты, с четырьмя гидрофобных остатков, в том числе два valines (197 и 199), один лейцин (200), и один цистеин (201) (восстановленная форма). Остаточные V197, V199 и C201 имеют решающее значение для распознавания RG-M56 МАБ и связывание, как определено аланин сканирующий мутагенез. Область эпитоп был расположен в одном из восьми антипараллельных бета-нитей домена оболочки (S-домен) белка оболочки NNV 16. Интересно, что эпитоп не отображается на внешнем домене протрузии, но скрывает в желе рулон структуры S-домена под другими антипараллельными бета-нитей. Эпитоп, с высокой гидрофобностью, может получить более стабильную микросреду в этой депрессии. Кроме того, было обнаружено 195 202 VNVSVLCR 3 пептида этого эпитопа препятствовать распространению гигантского вируса морской окунь нервной некроза в клетках головного мозга морской окунь. Таким образом, этот эпитоп пептида было предложено, чтобы быть совместноmpetitor участвует в домене связывания рецептора , необходимого для проникновения вируса 3. Было высказано предположение , что ингибиторы входа пептид , содержащий гидрофобные и / или амфипатические остатки могут изменять физическую конформацию и химию клеточных мембран и интерфейсов может препятствовать слиянию клеточных и вирусных мембран 17. Кроме того, многие ингибиторы входа синтетический пептид продемонстрировали сильные препятствующей свойства против различных вирусных инфекций , 17, 18. Таким образом, идентифицированный эпитоп пептида с гидрофобными остатками и сильным входа ингибирования против NNV инфекции может способствовать развитию терапевтических пептидных препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E. coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E. coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L.
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al.
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. The Aquaculture of Groupers. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
