Abstract
免疫系による抗原エピトープの同定は、ワクチン及びペプチド薬物の開発を容易にすることができる中和抗体の防御機構の理解が可能になります。ペプチドスキャンは直接的モノクローナル抗体（mAb）によって認識される線状エピトープをマッピングする簡単かつ効率的な方法です。ここで、著者らは、中和モノクローナル抗体を使用して神経壊死症ウイルスコートタンパク質の抗原認識のために直列に切り捨て組換えタンパク質、合成ペプチドの設計、およびドットブロットハイブリダイゼーションを含むエピトープ決意方法を提示します。この技術は、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜上に合成ペプチドとモノクローナル抗体のドットブロットハイブリダイゼーションに依存します。 RG-M56モノクローナル抗体により認識されるウイルスコートタンパク質の最小の抗原性領域は、6量体ペプチドエピトープにペプチドマッピングをトリミングステップ・バイ・ステップによって絞り込むことができます。また、アラニンスキャニング変異誘発、残渣サブstitutionエピトープを構成する各アミノ酸残基の結合重要性を特徴付けるために実施することができます。エピトープ部位に隣接する残基は、ペプチドのコンホメーションの調節において重要な役割を果たすことが見出されました。同定されたエピトープペプチドは、X線回折研究および機能競合のために、または治療のためのエピトープペプチド - 抗体複合体の結晶を形成するために使用することができます。
Introduction
免疫系では、V、D、およびJセグメントの再結合は、抗体が、病原性感染からホストを保護するために、種々の抗原に結合するための相補性決定領域（CDR）の多大な変化を作成することを可能にします。抗原に対する抗体の中和防衛は、抗体のCDRと抗原のエピトープとの間の空間的な相補性に依存します。したがって、この分子間相互作用の理解は、予防ワクチンの設計および治療用ペプチド薬剤の開発を支援します。しかしながら、この中和相互作用は、単一の抗原からの複数の抗原性ドメインにより、その結果エピトープ決意プロセスをより複雑にする抗体の複数のCDR、の両方によって影響され得ます。幸いなことに、骨髄腫細胞と個々の抗体産生細胞を融合ハイブリドーマ技術の開発は、秒細胞の恒常分割バッチを可能にしますモノクローナル抗体（mAb）として知られている網一つの特定の抗体、1。ハイブリドーマ細胞は、特定抗原の単一の抗原性ドメインに結合するために、これらの純粋な、高親和性モノクローナル抗体を産生します。確立された抗原 - 抗体、ペプチドスキャンを含むいくつかの方法の関係で、その対応するモノクローナル抗体を用いて抗原のエピトープを決定するために用いることができます。合成ペプチド技術における最近の開発は、ペプチドスキャン技術をよりアクセスし、実行することがより便利になりました。簡単に述べると、重複する合成ペプチドのセットは、標的抗原の配列に従って製造されたmAbのハイブリダイゼーションのための固体支持膜に関連しています。ペプチドスキャンは、抗体結合領域をマッピングするための簡単な方法を提供していますが、また、エピトープペプチドと抗体のCDRの各アミノ酸残基との間の結合相互作用を評価するために、残留物をスキャンまたは置換によりアミノ酸（AA）突然変異誘発を促進するだけでなく。
2、3、4を使用して、黄色のハタ神経壊死症ウイルス（YGNNV）コートタンパク質の線状エピトープの効率的な同定のためのプロトコルについて説明します。プロトコルは、mAb製剤、連続切断型組換えタンパク質の構築および発現、合成重複ペプチドの設計、ドットブロットハイブリダイゼーション、アラニンスキャニング、および置換突然変異を含みます。ペプチド合成の高いコストを考えると、直列に所望の標的タンパク質の組換えタンパク質を切り捨てるステップは、変更された、および合成ペプチドアレイドット - ブロット分析を行った前の抗原性領域は、約100〜200アミノ酸残基に絞りました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
モノクローナル抗体の作製
- 培養物を5％CO 2補充37ºCで175Tフラスコ中の無血清培地中のRG-M56マウスモノクローナルハイブリドーマ細胞2。媒体の色は、インキュベーションの5日後に黄色になるときに、上清を収集します。
注：ハイブリドーマ細胞は、ウシ胎児血清からの抗体の混入を避けるために、無血清培地で培養しました。 - 4ºCで30分間、4500×gで上清を遠心し、細胞破片ペレットを捨てます。
- 5 mLのカラム（50％スラリーとして供給される）プロテインGアガロースの2 mLを加え、氷冷PBSの10樹脂体積（10mL）で平衡化。
- 抗体上清の負荷200 mLをカラムに（ステップ1.2）とパススルーを捨てます。
- それを洗浄するために列に氷冷PBSの10 mLを加え。二回繰り返します。
- プロテインG-関連抗体を溶出するカラムに50 mMグリシン、pHが2.7の10ミリリットルを追加します。コル10倍の中和緩衝液（1Mトリス、1.5 MのNaCl、および1mM EDTA、pH8.0）を100μLを含むマイクロチューブに900μLの分画をLECT。
- -20ºCで0.03％のNaN 3で50％グリセロール中で精製された抗体を保管してください。
2.構築およびシリアル切り捨てられた組換えタンパク質の発現
- （10倍のPfu緩衝液の5μL、各dNTP 0.2mMの、0.2μMのフォワードプライマー3、0.2μMリバースプライマー3、2 mMのMgSO 4を、のpET20b-1A59 3プラスミドDNA 1ngの、および2.5 U：PCR反応混合物を準備しますPfu DNAポリメラーゼの単位）。 50μLの最終容量までのddH 2 Oを追加します。
- 自動サーマルサイクラー中で実行したサンプル次のパラメータを使用して：サイクル1（5分94ºC）。サイクル2-36（30秒94ºC、30秒間63ºC、60秒72ºC）。サイクル37（7分72ºC）。
- 以下の制限酵素消化を容易にするために、PCR精製キット5を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物を抽出します。
- んで IおよびXho I制限酵素でPCR増幅DNA断片を消化し、NdeIおよびのXhoI酵素切断PET-20B（+）ベクターにこれらのDNA断片の各々を連結。 6 大腸菌 DH-5α-コンピテント細胞にコンストラクトを変換します。
- PCR増幅DNAまたはPET-20bの1μgの消化緩衝液（20 mMトリス酢酸、10mMのMgの（CH 3 COO）2、50mMのKCH 3 COO、および1mM DTT、pHは7.9）での消化混合物を準備しますNdeIおよびXhoI制限の（+）ベクターDNA、および2 Uは、20μLの最終容量で酵素。
- 優しく消化混合物を混合し、すぐにスピンダウン。制限SITの完全な切断を確実にするために、乾燥槽中で2時間、37ºCでインキュベートしますエス。
- 以下のプラスミドの構築を容易にするために、PCR精製キット5を用いて、制限酵素消化DNA断片を抽出します。
- 予め消化、PCR増幅DNAの100 ngの、予め消化のpET-20bの10 ngの（+）とライゲーションバッファー（66 mMトリス、5mMのMgCl 2、1mMのATP、および5mM DTT、pH7.5）を内ライゲーション混合物を準備しますベクターDNA、および10μLの最終容量で5 UのT4 DNAリガーゼ。
- 優しく連結混合物を混合し、すぐにスピンダウン。水浴中で18時間、16ºCでインキュベートします。
- DH-5α-コンピテント細胞の100μLにライゲーションサンプルの10μLを入れ、30分間氷上でマイクロ遠心チューブを配置する前に、穏やかに混合します。ヒートショック7を誘導するために90秒間42ºCで乾燥浴中にマイクロチューブを入れてください。すぐに2分間氷上にチューブを移します。
- ルリア - ベルターニ（LB）ブロス（1％バクトトリプトン、0.5％バクト酵母extracの900μLを追加管にT、および0.5％のNaCl、pH7.0）に。 150 rpmで45分間振盪しながら37ºCでインキュベートします。 10分間4000×gでの遠心分離により細胞をペレット化し、上清を捨てます。
- LBブロスの50μLでペレットを再懸濁し、100μg/ mLのアンピシリンを含む予め温めたLBプレート上に各変換を広げます。 16時間37ºCでプレートをインキュベートします。
- 200μLチップを用いて、単一のコロニーをピックアップし、ゆるくキャップした15 mLチューブに100μg/ mLのアンピシリンを含むLBブロス3mLの中にそれを配置します。 150rpmで12時間振盪しながら37ºCでインキュベートします。
- 各培養物からプラスミドDNA 8を抽出し、シーケンス9を確認するために、T7プロモーターとT7ターミネータープライマーを用いて配列決定します。
- 配列確認後、当社による大腸菌のBL-21（DE3）株にYGNNVコートタンパク質遺伝子の長さを変化させて、これらのpET-20bは（+）プラスミドからDNA 10ngの変換ヒートショック法7る。手順に従ってください2.3.6-2.3.8変換を実行します。
- ゆるくキャップした15 mLチューブに100μg/ mLのアンピシリンを含む3mLのLBブロスに各形質転換した大腸菌 BL-21細胞からの単一コロニーを転送します。 150 rpmで振盪しながら37ºCで培養物をインキュベートします。
- 文化のOD 600が約0.6のとき25ºCに文化を冷却し、組換えタンパク質の発現を誘導するために最終濃度0.4mMになるようにIPTGを追加します。 200 rpmで振盪しながら25ºCで余分4時間培養をインキュベートします。
- マイクロ遠心チューブに培養液を1mLを転送します。 1分間12,000×gの遠心分離により細胞をペレット化し、上清を捨てます。
- マイクロピペットでピペッティングすることによって、およびダウン変性緩衝液100μL（8M尿素、20mMリン酸ナトリウム、及び0.5MのNaCl、pH7.4）中で細胞ペレットを再懸濁します。活発ボルテックスで混和します。
注：サンプルゾルutionsは今、半透明の少し粘着性、およびドットブロットハイブリダイゼーションアッセイのために準備する必要があります。
重複ペプチドの3設計と合成
- 設計と各ドットブロット法によりRG-M56 mAbのエピトープ領域を絞り込むためにYGNNVコートタンパク質の195から338のaa領域からの10アミノ酸残基によって、その後継と重なる3シリアル20量体ペプチドを合成します。
- ドットブロット法により195から206アミノ酸のエピトープ領域を絞り込むために、次の合成ペプチドに6アミノ酸残基のオーバーラップで3 3 8マーペプチド（195 VNVSVLCR 202、197 VSVLCRWS 204、および199 VLCRWSVR 206）を設計し、合成します。
- 設計と3 7マーを合成（196 NVSVLCR 202と195 VNVSVLC 201）、6量体（195 VNVSVL 200、196 NVSVLC 201、および1その隣接するペプチド上に97 VSVLCR 202）、および5量体ペプチド（195 VNVSV 199、196 NVSVL 200、それぞれ197 VSVLC 201、及び198 SVLCR 202）6のオーバーラップを有する、5、4アミノ酸残基は、最小限にしますドットブロットによるエピトープ領域。
4.ドットブロットハイブリダイゼーション
- 10mg / mLの最終濃度になるようにジメチルスルホキシド（DMSO）中の各合成ペプチドを溶解させます。
注：合成ペプチドの多様な溶解性を克服するために、すべての合成ペプチドは、DMSO中に溶解されるべきです。 DMSOは完全に疎水性又は親水性ペプチドを溶解する良溶媒です。 - 2分間メタノールでポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜を浸します。
注：PVDF膜は、DMSOに耐性の100％までです。他の人はそうではないかもしれません。 - ために修飾Towbin緩衝液（25 mMトリス、192 mMグリシン、0.1％SDS、pHが8.3）でPVDFメンブレンを平衡化2分。
注：10〜20％（v / v）のメタノールの転送結果を改善するように改変Towbin緩衝液に添加することができます。 - 修正されたTowbin緩衝液でクロマトグラフィー紙を洗浄します。クロマトグラフィーペーパー上にPVDF膜を配置します。修正されたTowbinバッファが次のステップに進む前に、PVDF膜表面から消失するまで待ちます。
- 10μLチップでメンブレンに各ペプチドサンプルの2μLを追加します。 10分間クロマトグラフィーの紙にPVDF膜に空気が乾燥します。あまりにも多くの拡散を避けるために、膜上にゆっくりと徐々に各ペプチドサンプルを追加します。
- 穏やかに振盪しながら室温で30分間、5％脱脂乳でTBST緩衝液（0.05％（v / v）のTween-20を、20mMのトリス、および150mMのNaCl、pH7.4）中で膜をブロックします。
- 膜への5％脱脂乳でTBST緩衝液1,000：1の最終希釈でRG-M56モノクローナル抗体を追加します。穏やかに振盪しながら1時間、37ºCで膜をインキュベートします。
- そう抗体を除去リューション。穏やかに振盪しながら5分間、TBST緩衝液中で膜を洗浄します。二回繰り返します。
- 膜を5％脱脂乳を有するTBST緩衝液で5,000：1の最終希釈で二次抗体（ヤギ抗マウスIgG、Fcを、アルカリホスファターゼ結合）を加えます。穏やかに振盪しながら1時間、37ºCで膜をインキュベートします。
- 抗体溶液を廃棄してください。穏やかに振盪しながら5分間、TBST緩衝液中で膜を洗浄します。二回洗浄ステップを繰り返します。
- 暗所で15分間、室温でBCIP / NBT基質溶液を有する膜を開発。信号が表示されたときのddH 2 Oで膜を洗浄することにより現像を停止します。
- 膜を空気乾燥し、画像システムを用いたドットブロットの画像を取り込みます。
- 画像解析ソフト3を使用して、各ドットブロットの強度を測定します。
5.アラニンスキャニングと交代
- 3アラニンおよびメティを設計・合成onine置換ペプチド。 VAVSVLCR 202、195 VNASVLCR 202、195 VNVAVLCR 202、195 VNVSALCR 202、195 VNVSVACR 202、195 VNVSVLAR 202 8-merペプチド195 VNVSVLCR 202のために、アラニンで各アミノ酸残基を交換し、合成ペプチド195 ANVSVLCR 202、195、および195 VNVSVLCA 202 。 VNVSVMCR 202 SJNNV遺伝子型エピトープペプチド195を作成するために、メチオニンへのaa残基のロイシン200を交換してください。
- アラニンスキャニングおよび置換変異誘発は、ドットブロッティング実行するために第4節に従ってください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
この実験の目的は、mAbを用いて、ドットブロッティングを通じてエピトープを同定することでした。迅速かつ効率的にモノクローナル抗体によって認識される抗原性領域を絞り込むために、C末端での6×His融合タグを有する完全長およびシリアル切り捨てYGNNV組換えコートタンパク質は、 大腸菌 pET発現システム10（ 図1A）から発現させました。得られた組換えタンパク質は、ドットブロットハイブリダイゼーションのためにRG-M56 mAbおよび抗た6×His抗体を用いてPVDF膜上にスポットしました。ドットブロット法は、1から338のaa（全長）、51から338アミノ酸、および195から338 aaのではなく、1-100 AAまたは1-200 aaの組換えタンパク質（ 図1B）に対する陽性シグナルを明らかにしました。ドットアレイは、抗の6xHis抗体に対してハイブリダイズし、すべての組換えタンパク質の発現を確認しました。これらのデータは、RG-M56モノクローナル抗体の認識エピトープは、144-AA組換えタンパク質NEAに位置していることを示しますR C末端YGNNVのコートタンパク質（195から338アミノ酸）。
彼らの隣人がエピトープ領域を絞り込むために、ペプチドスキャン用144-AA組換えタンパク質の配列から設計し、合成した上に続いて、10アミノ酸残基長でシリアル20-merのペプチドが重なっています。これらの合成ペプチドは、PVDF膜上にスポットし、RG-M56モノクローナル抗体を用いたドットブロットハイブリダイゼーションを行いました。結果は、ペプチドのみ195から214アミノ酸およびポジティブコントロール、195から338 aaの組換えタンパク質（ 図2A）に陽性シグナルを示しました。エピトープは、アミノ酸の領域ではなく、ペプチド205から224アミノ酸の領域ペプチド195から214内に配置されているように、6アミノ酸残基と3シリアル8マーペプチドは、アミノ酸残基195から206（ペプチド195-202 AA、197-から重なります204アミノ酸、および199-206アミノ酸）を設計し、合成しました。ドットブロットハイブリダイゼーションの結果は、使用して、ペプチド195-202 AAおよびポジティブコントロールペプチド195から214のaaに正のシグナルを示しましたRG-M56モノクローナル抗体（ 図2B）。
アラニンスキャニングおよび置換突然変異誘発は、8量体エピトープの各アミノ酸残基、195 VNVSVLCR 202の特異性を評価するために行きました。 8-merペプチドの各アミノ酸残基は、個々にアラニンで置換しました。アラニン変異ペプチド配列を、陽性対照として、ペプチド195-202アミノ酸を用いてPVDFメンブレン上に置きました。ドットブロット分析は、三置換突然変異は、V197Aは、V199A、及びC201A、RG-M56モノクローナル抗体（ 図3A）の結合親和性を消失することを示しました。 SJNNV遺伝子型エピトープ中のアミノ酸残基200はメチオニンであるが、他の4 Betanodavirus遺伝子型エピトープにロイシンとは対照的に、SJNNV遺伝子型シーケンス、195 VNVSVMCR 202は 、陽性対照のそれのように、RG-M56モノクローナル抗体に対して陽性結合親和性を示しました（ 図3A）。この結果は、エピトープは、Oことを示しすべてBetanodavirus遺伝子型は、RG-M56モノクローナル抗体によって認識され得るfは。エピトープサイトに参加している各アミノ酸残基の結合親和性は、さらに、画像解析ソフト（ 図3B）を使用して、それぞれのアラニン置換のドットブロットのシグナル強度を測定することによって定量しました。 V197A、V199A、およびC201A置換の強度が10.2％、18.6％、8.5％に減少した、それぞれ、陽性対照（100％）のものと比較した場合、V195Aのに対し、S198A、L200A、R202A、およびL200M置換は、陽性対照のそれのようなより高いまたは同様の強度を示しました。 N196A置換の影響力は、ポジティブコントロールで37.4パーセントの減少と、あいまいであることは注目に値します。これらの結果は、V197、V199、およびC201はRG-M56モノクローナル抗体の結合のために不可欠な残基であることを示しています。
アラニンスキャニング変異誘発の結果は、アミノ酸残基V195、N196、およびR202缶ことを明らかにしていますエピトープ領域は、さらに、両方の末端に絞り込むことができたことを意味アラニンで置換すること。したがって、ステップ・バイ・ステップ7量体、6量体、5量体の合成ペプチドの工程を経てペプチドマッピングをトリミングは、抗原性領域を最小限に抑えるように設計されました。陽性シグナルはなく、7マーおよび5-merの合成ペプチドに、（ 図4）6-merの合成ペプチド196 NVSVLC 201上に存在しました。これらのデータは、RG-M56モノクローナル抗体により認識さNNVコートタンパク質の最小エピトープは、6-merペプチド、196 NVSVLC 201であることを示しています。
図1：シリアル切り捨て組換えタンパク質およびモノクローナル抗体を用いたエピトープ領域の削減。シリアルに切り捨てられた組換えNNVCPsの（A）の地図。 NNVCP 1-338 aaが完全長のコートタンパク質です。 （B）ドット-BLO組換えNNVCPsのトン分析。左：PVDF膜上のシリアル切り捨てYGNNV組換えコートタンパク質の地図。中央：ドットブロット分析は、抗た6×His抗体を用いて行きました。右：ドットブロット分析は、RG-M56モノクローナル抗体を用いて行きました。 NNVCP：神経壊死症ウイルスコートタンパク質。 AA：アミノ酸; PVDF：ポリフッ化ビニリデン; N：N末端; C：C末端;モノクローナル抗体：モノクローナル抗体。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：合成ペプチドを用いて、エピトープ領域のファインマッピング。 （A）左：20-merの合成ペプチドのアミノ酸配列はNNVCP 195から338のaaに整列させました。各先行するペプチドは、以下のペプチドと10アミノ酸残基の長さのオーバーラップを持っていました。右：Sの地図PVDF膜上yntheticペプチド。組換えNNVCP 195から338アミノ酸を陽性対照として使用しました。ドットブロット分析は、RG-M56モノクローナル抗体を用いて行きました。 （B）左：8マー合成ペプチド、195-202 AA、AA 197-204、および199-206アミノ酸のアミノ酸配列。各先行するペプチドは、以下のペプチドで6アミノ酸残基の長さのオーバーラップを持っていました。合成ペプチド195から214アミノ酸を陽性対照として使用しました。右：ドットブロット分析は、RG-M56モノクローナル抗体を用いて行きました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：195 VNVSVLCR 202エピトープのアラニンスキャニングおよび置換変異誘発。置換突然変異誘発およびドットブロット分析（A）アミノ酸配列。各AA rをエピトープ領域、195-202 AAのesidueは、アラニンで個別に交換しました。 L200M置換はBetanodavirusコートタンパク質エピトープ領域でSJNNV遺伝子型配列です。合成ペプチド195-202アミノ酸を陽性対照として使用しました。置き換えアミノ酸残基には下線が引かれています。 （B）結合親和性をドットブロットシグナルの定量。陽性対照（195-202アミノ酸）の信号強度を100％としました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：最小エピトープ決意。 195-202 AA 7マー（A）、6マー（B）、および5量体（C）の合成ペプチドは、RG-M56モノクローナル抗体により認識される最小エピトープを同定するために使用しました。合成peptiデ195-202アミノ酸を陽性対照として使用しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルは、mAb-認識線形エピトープを同定するための迅速かつ簡単な手法を提供しています。考慮ペプチド合成およびペプチド合成の生産効率のコストを考えると、ウイルスコートタンパク質の抗原性領域は、ペプチドスキャン分析の前に直列に切り捨て組換えタンパク質を発現させることによって減少しました。 10 kDaの50の間の分子量を有する組換えタンパク質は、容易にこのシステムを介して発現させることができるようにこのように、信頼性の高い効率的な大腸菌 pET発現系は、これらの連続切断型組換えタンパク質を産生するために使用しました。この方法では、エピトープは、簡単より扱い100〜200アミノ酸領域に絞り込むことができます。それの6xHisタグを発現させるためのコードは、製造の6xHisタグ融合タンパク質の発現を確認するために、抗た6×His抗体を用いて免疫検出することを可能にすること配列を含有するようにPET-20B（+）ベクターは、特に、選択されました組換えProteins。産生された組換えコートタンパク質は、次いで、ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイを介してRG-M56モノクローナル抗体を用いて分析しました。組換えタンパク質エピトープ決意の別の方法は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー10を介して発現された組換えタンパク質を精製し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で組換えタンパク質を分離し、ウェスタンブロット分析3を実行することです。
さらにより細かく直列トランケート組換えタンパク質を用いたドットブロットハイブリダイゼーション分析の結果によって決定されるエピトープの位置をマッピングするために、異なるサイズの重複合成ペプチドを設計しました。合成ペプチドの異なる可能な長さの中で合成するために、20-merの10アミノ酸残基の長さの重複ペプチドが十分に、（90％前後で）それらの高い合成純度のために、それらのペプチドの長さの両方、ペプチドスキャンで最初に選択されたと連続電子のための検索のためのpitopeは、B細胞の抗体11により認識されます。合成されたペプチドが長くなるように合成したペプチドの正確性および純度が悪化することに注意してください。このようにして、エピトープ領域は急速に、長さが約10アミノ酸残基まで減少しました。シリアル8-merの重複ペプチドを調査した後、線形エピトープ領域は、195から202のaaをペプチドに定義されました。続いて、この8マーエピトープペプチドのアラニンスキャニングは、最小エピトープの検索を可能にする、各アミノ酸残基の重要な結合親和性の強さを明らかにする。 V197、V199、およびC201のアミノ酸残基の重要な役割は、線状エピトープ領域が完全に結合失うことなく、197からさらに、アミノ酸残基V195、N196、及びR202がアラニンで置換することができる201に、少なくとも5アミノ酸残基をカバーすることを意味します親和性、エピトープ領域は、長さが7,6、または5アミノ酸残基に還元することができることを示します。小さなペプチド配列は、容易にかつ経済的に線形の検索のために合成することができる（COntinuous）エピトープ。それは、エピトープ切除と組み合わせて、質量分析は、12の分析されていない限りしかし、この合成ペプチド走査技術は、抗体の不連続エピトープの決意には適していません。
このプロトコルでは、ドットブロットハイブリダイゼーション技術は、mAbの線形エピトープを探索するために使用しました。ドットブロットハイブリダイゼーションはシンプルだが効果的な方法です。エピトープ領域は、大規模な風景から絞られた検索の開始時に、主な関心事は、ほとんどのmAbとして、標的膜結合タンパク質に対する抗体のハイブリダイゼーション後に正または負の信号のいずれかを観察することです抗原性タンパク質（ 図1及び2）の特定のエピトープにのみ結合します。しかし、このようなアラニン置換変異誘発によるような、抗体に対するエピトープ領域内の各アミノ酸残基の結合有効性を探るために、ドットブロットハイブリダイゼーションを使用して、ドットブロット法により決定された各置換アミノ酸残基のシグナル強度は、全体的な結合意義に織り込まれるべきです。その信号強度を画像解析ソフト（ 図3B）または濃度を用いて容易に定量することができます。あるいは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、結合親和性および得られた信号強度3の程度を定量化するために行うことができます。
以前の研究では、非エンベロープ神経壊死症ウイルスの唯一のコートタンパク質は、免疫認識さ6.5〜4.5の間に高い中和指数値の10のmAbによる（10 NIをログ）2でした 。 mAbの高度に特異的な認識能力がさらにNNVに感染した魚13の検出のためのワンステップ、急速なイムノクロマトグラフィー診断キットの開発のために使用しました。神経壊死症ウイルスコートタンパク質の抗原エピトープは、RG-M18によって認識されました8-merペプチド、小説NNV受容体は（未発表データ）同定されたを通じて195 VNVSVLCR 202 3、などのモノクローナル抗体。本研究では、神経壊死症ウイルスコートタンパク質のエピトープをさらに6-merペプチドに絞られた、196 NVSVLC 201、 他のmAb、RG-M56によります。
6-merペプチド196 NVSVLC 201を含む2つの7量体ペプチド（196 NVSVLCR 202と195 VNVSVLC 201）は RG-M56モノクローナル抗体（ 図4A）によって認識されないことをそれは予想外のことです。合理的な解釈は、周囲の残基V195およびR202を直接エピトープと抗体との間の結合相互作用に寄与しないかもしれないが、隣接残基は、抗体認識のための正しいペプチドコンフォメーションの形成に影響を与える、ということです。そのフランキング末端にV195またはR202の外観だけでは合成ペプチドをねじることができます抗体認識および結合のためのコンフォメーション。エピトープの立体配座は、8マー合成ペプチドで互いにバランスしている末端、V195及びR202の両方の強さ、195 VNVSVLCR 202によって駆動されます そして、NVSVLC 201 196、6-merの合成ペプチドで対抗。アミノ酸残基、V195、N196、およびR202は、個別に完全に結合する能力を失わずに、アラニンで置換することができ、したがって、アラニンスキャニング変異誘発の結果は、これら3つのアミノ酸残基が認識において重要な役割を演じないことを示し、RGの結合-M56モノクローナル抗体。しかし、6-merの合成ペプチドから1以上の残基をトリミングした後、196 NVSVLC 201は 、N末端隣接領域におけるN196のない5-merペプチド、197 VSVLC 201は 、RGによって認識され、結合する能力を失います-M56モノクローナル抗体（ 図4C）。この結果は、N196残基がpもあることを示唆しています認識およびRG-M56モノクローナル抗体の結合を容易にするために正確なエピトープコンフォメーションを安定化するために、エピトープのフランキング領域において重要な役割を置きます。エピトープ領域を囲む隣接する残基の重要性は、他の抗原 - 抗体結合研究によって調査されていました。抗体の結合のためにαブンガロトキシンのエピトープ領域を囲むアミノ酸残基に隣接するの意義は、同一のコリン作動性サブサイト内の別のアミノ酸置換を用いて調べました。そして、彼らは、本質的な影響力のある、または14有力ではないのいずれかとして評価しました。それはまた、癌関連上皮ムチンの抗体に認識されるエピトープの特異性は、さらに、隣接するアミノ酸残基によって影響され得ることが見出されました。これらの効果はエピトープ15に対する抗体の結合を妨げることができるコンフォメーションの障壁を提示することができます。
6マーエピトープ、196 NVSVLC 201 </サブ>、2バリン（197および199）、1ロイシン（200）、および1システイン（201）（還元型）を含む4つの疎水性残基、と、非常に疎水性の機能を備えています。アラニンスキャニング突然変異誘発によって決定されるような残基V197、V199、およびC201は、RG-M56モノクローナル抗体の認識および結合に重要です。エピトープ領域は、NNVコートタンパク質16のシェルドメイン（Sドメイン）の8逆平行βストランドの1に位置していました。興味深いことに、エピトープは、外部突起ドメインに表示されますが、他の逆平行βストランドの下でS-ドメインのゼリーロール構造に隠れていません。エピトープは、その高い疎水性で、この不況で、より安定した微小環境を得ることができます。また、このエピトープの195 VNVSVLCR 202 3ペプチドは、ハタ脳細胞における巨大ハタ神経壊死症ウイルスの増殖を妨げることが見出されました。従って、このエピトープペプチドは、同時であることが示唆されましたウイルスの侵入3に必要な受容体結合ドメインに関与mpetitor。これは、ペプチドの侵入阻害剤は、細胞膜の界面の物理的コンホメーションおよび化学的性質を変化させることができる疎水性および/または両親媒性の残基を含み、細胞とウイルス膜17の融合を阻害することができるという仮説を立てました。さらに、多くの合成ペプチド侵入阻害剤は、様々なウイルス感染17、18に対して強い抑制性特性を実証しています。したがって、疎水性残基およびNNV感染に対する強力なエントリー阻害と同定されたエピトープペプチドが治療用ペプチド薬剤の開発を容易にすることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E. coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E. coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L.
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al.
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. The Aquaculture of Groupers. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
