Abstract
Identifikationen af en antigen epitop af immunsystemet giver mulighed for at forstå den beskyttende mekanisme af neutraliserende antistoffer, som kan fremme udviklingen af vacciner og peptidlægemidler. Peptid scanning er en enkel og effektiv metode, ligefremt kortlægger den lineære epitop genkendes af et monoklonalt antistof (mAb). Her, forfatterne præsenterer en epitop bestemmelse metode involverer serielt trunkerede rekombinante proteiner, syntetisk peptid design og dot-blot hybridisering for den antigene anerkendelse af nervøs nekrose viruscoat-protein under anvendelse af et neutraliserende mAb. Denne teknik bygger på dot-blot-hybridisering af syntetiske peptider og mAb'er på en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran. Den mindste antigene region af et viralt kappeprotein genkendes af RG-M56 mAb kan indsnævres ved trin-for-trin trimmet peptidkortlægning på en 6-mer peptid epitop. Desuden alaninscanningsmutagenese og restprodukt substitution kan udføres for at karakterisere bindingen betydning af hver aminosyrerest, der udgør epitopen. Resterne flankerer epitop stedet viste sig at spille kritiske roller i peptid kropsbygning regulering. Den identificerede epitop peptid kan anvendes til at danne krystaller af epitop peptid-antistof komplekser til en x-ray diffraktion undersøgelse og funktionel konkurrence eller til terapeutiske midler.
Introduction
I immunsystemet, rekombination af V, D og J-segmenter giver mulighed for antistoffer mod skabe enorme variationer af komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) for binding til forskellige antigener til at beskytte værten mod patogen infektion. Den neutraliserende forsvar af antistoffer mod antigener afhænger af den rumlige komplementaritet mellem CDR'erne af antistofferne og epitoperne af antigenerne. Derfor vil en forståelse af denne molekylære interaktion bistå profylaktisk vaccine design og terapeutisk peptid lægemiddeludvikling. Dette kan dog neutralisering interaktion påvirkes både af flere antigene domæner fra et enkelt antigen og ved multiple CDR'er af antistoffer, som derfor gør epitop bestemmelsesproces mere kompleks. Heldigvis udviklingen af hybridomteknologi, som sammensmelter individuelle antistofproducerende celler med myelomaceller, giver mulighed for en konstant dividere batch af celler til secrete én specifikt antistof, er kendt som et monoklonalt antistof (mAb) 1. Hybridomaceller producerer disse rene, høj affinitet mAb'er til at binde til et enkelt antigent domæne af et specifikt antigen. Med forholdet af antigen-antistof etableret, flere tilgange, herunder peptid scanning, kan anvendes til at bestemme epitopen af et antigen ved hjælp af dens tilsvarende mAb. Den seneste udvikling i syntetisk peptid-teknologi har gjort peptidet skanningsteknik mere tilgængelig og mere bekvemt at udføre. Kort fortalt et sæt af overlappende syntetiske peptider fremstillet ifølge et målantigen sekvens og er knyttet til en fast-understøttet membran til mAb hybridisering. Peptidscanning ikke kun tilbyder en enkel måde at kortlægge antistofbindende region, men også letter aminosyre (aa) mutagenese gennem rest scanning eller substitution at evaluere bindingsinteraktionen mellem hver aa rest af epitopen peptidet og CDR'erne i antistoffet.
2, 3, 4. Protokollen indeholder mAb forberedelse, konstruktion og udtryk for serielt trunkerede rekombinante proteiner, syntetisk overlappende peptid design, dot-blot hybridisering, alaninscanning og substitution mutagenese. I betragtning af den høje pris for peptidsyntese, blev trinet med serielt trunkering af rekombinante proteiner med en ønsket målprotein modificeret, og den antigene region blev indsnævret til omkring 100 til 200 aa rester før det syntetiske peptid-array dot-blot-analyse blev udført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af monoklonalt antistof
- Kultur de RG-M56 muse monoklonale hybridomaceller 2 i serum-frit medium i 175T kolber ved 37 ºC med 5% CO2 supplement. Opsaml supernatanten når farven af mediet bliver gult efter fem dages inkubering.
BEMÆRK: Hybridomceller blev dyrket i serumfrit medium for at undgå antistof forurening fra føtalt bovint serum. - Centrifugeres supernatanten ved 4.500 xg i 30 min ved 4 * C og kassér celledebris pellet.
- Der tilsættes 2 ml protein G agarose (leveret som en 50% opslæmning) til en 5 ml søjle og ligevægt med 10 harpiksvolumener (10 ml) iskold PBS.
- Belastning 200 ml af antistoffet supernatant (trin 1.2) på søjlen og kassér gennemslaget.
- Tilsæt 10 ml iskold PBS til kolonnen for at vaske det. Gentag to gange.
- Tilsæt 10 ml 50 mM glycin, pH 2,7 til søjlen til eluering af protein G-associerede antistof. Collect 900 gl fraktioner i et mikrocentrifugerør indeholdende 100 pi 10x neutralisation puffer (1 M Tris, 1,5 M NaCl og 1 mM EDTA, pH 8,0).
- Opbevar oprensede antistof i 50% glycerol med 0,03% NaN3 ved -20 * C.
2. Konstruktion og ekspression af serielt trunkerede rekombinante proteiner
- Forbered en PCR-reaktionsblanding: 5 pi 10x Pfu puffer, 0,2 mM af hver dNTP, 0,2 uM fremadrettet primer 3, 0,2 uM revers primer 3, 2 mM MgSO4, 1 ng pET20b-1A59 3-plasmid-DNA, og 2,5 U ( enhed) Pfu DNA-polymerase; tilføje Hedeselskabet 2 O til et endeligt volumen på 50 pi.
- Køre prøver i en automatisk termisk cyklusapparat anvendelse af følgende parametre: Cyklus 1 (94 ºC i 5 min); cyklusser 2-36 (94 ºC i 30 s, 63 ºC i 30 s og 72 ºC i 60 s); og cykle 37 (72 ºC i 7 min).
- Uddrag polymerasekædereaktion (PCR) produkter ved anvendelse af et PCR-oprensningskit 5 for at lette den følgende restriktionsenzymfordøjelse.
- Fordøje PCR-amplificerede DNA-fragmenter med Nde I og Xho I-restriktionsenzymer og ligere hver af disse DNA-fragmenter i Ndel og Xhol-enzym-spaltet pET-20b (+) vektor. Omdan konstruktionerne i Escherichia coli DH-5a-kompetente celler 6.
- Forbered fordøjelsen blandingen i digestionspuffer (20 mM Tris-acetat, 10 mM Mg (CH3COO) 2, 50 mM KCH 3 COO, og 1 mM DTT, pH 7,9) med 1 ug af PCR-amplificeret DNA eller pET-20b (+) vektor-DNA, og 2 U af Ndel og Xhol restriktionsenzymer i et endeligt volumen på 20 pi.
- Bland fordøjelsen blandingen forsigtigt og hurtigt vågeblus. Der inkuberes ved 37 * C i 2 timer i en tør bad for at sikre den fuldstændige afskæring af begrænsningen siddees.
- Uddrag restriktionsenzymet-fordøjede DNA-fragmenter under anvendelse af et PCR-oprensningskit 5 for at lette den følgende plasmidkonstruktion.
- Forbered ligeringsblandingen i ligeringsbuffer (66 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP og 5 mM DTT, pH 7,5) med 100 ng fordøjet, PCR-amplificeret DNA, 10 ng predigested pET-20b (+) vektor-DNA, og 5 U af T4 DNA-ligase i et slutvolumen på 10 pi.
- Bland ligeringsblandingen forsigtigt og hurtigt vågeblus. Inkuber ved 16 ºC i 18 timer i et vandbad.
- Sætte 10 pi af ligeringen prøver i 100 pi af DH-5α-kompetente celler og blandes forsigtigt før placere mikrocentrifugerør på is i 30 minutter. Sæt mikrocentrifugerør på et tørt bad ved 42 ºC i 90 s at fremkalde varme chok 7. Umiddelbart overføre røret på is i 2 min.
- Tilføj 900 pi af Luria-Bertani (LB) bouillon (1% Bacto trypton, 0,5% Bacto gær ekstrakt, og 0,5% NaCl, pH 7,0) til røret. Der inkuberes ved 37 * C med 150 rpm rystning i 45 minutter. Pelletere cellerne ved centrifugering ved 4.000 x g i 10 minutter og kassér supernatanten.
- Pelleten resuspenderes med 50 pi LB-bouillon og sprede hver transformation på forvarmet LB-plader indeholdende 100 ug / ml ampicillin. Pladerne inkuberes ved 37 * C i 16 timer.
- Afhente en enkelt koloni ved anvendelse af en 200 pi spids og læg det i 3 ml LB-bouillon indeholdende 100 ug / ml ampicillin i en løst på glassene 15 ml rør. Der inkuberes ved 37 * C med 150 rpm rystning i 12 timer.
- Ekstrahere plasmid-DNA 8 fra hver kultur og sekventere det ved hjælp af T7-promotoren og T7-terminator-primere for at bekræfte sekvensen 9.
- Efter bekræftelse sekvens, transformere 10 ng DNA fra disse pET-20b (+) plasmider med varierende længder af YGNNV kappeproteingenet i BL-21 (DE3) stamme af E. coli ved osing varme-chok metode 7. Følg trin 2.3.6-2.3.8 at udføre transformation.
- Overfør en enkelt koloni fra hver transformeret E. coli BL-21 celle, i 3 ml LB-bouillon indeholdende 100 ug / ml ampicillin i en løst på glassene 15 ml rør. Inkuber kulturen ved 37 ºC med 150 rpm rystning.
- Afkøl kulturen til 25 ° C, når OD600 af kulturen er ca. 0,6 og tilføje IPTG til en slutkoncentration på 0,4 mM for at inducere ekspressionen af det rekombinante protein. Inkuber kulturen til en ekstra 4 timer ved 25 ºC med 200 rpm rystning.
- Overfør 1 ml af kulturen i et mikrocentrifugerør. Pelletere cellerne ved centrifugering ved 12.000 x g i 1 min og kassér supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 100 pi denaturering buffer (8 M urinstof, 20 mM natriumphosphat og 0,5 M NaCl, pH 7,4) ved pipettering op og ned med en mikropipette. Bland ved kraftig vortexing.
BEMÆRK: Prøven solutions skulle nu være semitransparente, lidt klæbrig, og klar til dot-blot-hybridiseringsassay.
3. Design og syntese af overlappende peptider
- Design og syntese af 3 serielle 20-mere peptider, der hver overlapper dens efterfølger med 10 aa rester fra 195 til 338 aa region af YGNNV kappeproteinet at indsnævre epitopområdet af RG-M56 mAb ved dot-blotting.
- Design og sammenfatte 3 tre 8-mer peptider (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204, og 199 VLCRWSVR 206) med et overlap på 6 aa rester på næste syntetisk peptid at indsnævre epitop region 195-206 aa ved dot blotting.
- Design og syntese af 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 og 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, og 197 VSVLCR 202), og 5-mer peptider (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, og 198 SVLCR 202) med et overlap på 6, 5, og 4 aa-rester, henholdsvis på deres nabolande peptider til at minimere epitopområdet ved dot-blotting.
4. Dot-blot-hybridisering
- Opløs hver syntetiserede peptid i dimethylsulfoxid (DMSO) til en slutkoncentration på 10 mg / ml.
BEMÆRK: For at overvinde den varierede opløselighed af syntetiske peptider, bør alle syntetiske peptider opløses i DMSO. DMSO er et godt opløsningsmiddel til fuldstændigt at opløse hydrofobe eller hydrofile peptider. - Soak polyvinylidenfluorid (PVDF) membran med methanol i 2 min.
BEMÆRK: PVDF-membran er op til 100% resistent overfor DMSO; andre kan ikke være det. - Ækvilibrering af PVDF membranen med modificeret Towbin-buffer (25 mM Tris, 192 mM glycin og 0,1% SDS, pH 8,3) til2 min.
BEMÆRK: 10-20% (v / v) methanol tilsættes til modificeret Towbin-buffer for at forbedre resultaterne overførsel. - Skyl et stykke kromatografi papir med den modificerede Towbin-buffer. Placer PVDF-membran på kromatografi papir. Vent, indtil den modificerede Towbin-buffer er forsvundet fra PVDF-membran overflade før der fortsættes til næste trin.
- Tilsæt 2 pi af hvert peptid prøve til membranen med en 10 pi spids. Lufttør PVDF-membran på kromatografi papir i 10 minutter. Tilføj hvert peptid prøve langsomt og gradvist på membranen for at undgå for meget diffusion.
- Blokere membranen i TBST-buffer (0,05% (v / v) Tween-20, 20 mM Tris og 150 mM NaCl, pH 7,4) med 5% fedtfri mælk i 30 minutter ved stuetemperatur under forsigtig omrystning.
- Tilføj RG-M56 mAb ved en endelig fortynding på 1: 1.000 i TBST-puffer med 5% fedtfri mælk til membranen. Inkuber membranen ved 37 * C i 1 time med forsigtig rystning.
- Fjern antistoffet sålution. Vask membranen i TBST-buffer i 5 minutter under forsigtig omrystning. Gentag to gange.
- Tilføj det sekundære antistof (gede anti-mus IgG, Fc, konjugeret alkalisk phosphatase) ved en slutfortynding på 1: 5000 i TBST-buffer med 5% fedtfri mælk til membranen. Inkuber membranen ved 37 * C i 1 time med forsigtig rystning.
- Kassér antistofopløsningen. Vask membranen i TBST-buffer i 5 minutter under forsigtig omrystning. Gentag vasketrinet to gange.
- Udvikle membranen med BCIP / NBT-substrat-opløsning ved stuetemperatur i 15 minutter i mørke. Stop udviklingslandene ved at vaske membranen med Hedeselskabet 2 O, når signalet vises.
- Air-tørre membranen og fange dot-blot billede ved hjælp af et billede system.
- Måle intensiteten af hvert dot-blot ved anvendelse af billedanalysesoftware 3.
5. Alanin Scanning og Udskiftning
- Design og syntetisere 3 alanin og methionine substitution peptider. Udskift hver aa rest med alanin for 8-mer peptid 195 VNVSVLCR 202 og syntetisere peptider 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202, og 195 VNVSVLCA 202 . Udskift aa rest leucin 200 til methionin at skabe SJNNV genotype epitop peptid 195 VNVSVMCR 202.
- Følg Afsnit 4 til at udføre alaninscanning og substitution mutagenese dot blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med dette forsøg var at identificere en epitop gennem dot blotting under anvendelse af mAb. Hurtigt og effektivt at indsnævre den antigene region genkendes af mAb blev fuldlængde og serielt trunkerede YGNNV rekombinante kappeproteiner med en 6xHis fusion tag ved C-terminus udtrykt fra en E. coli-PET ekspressionssystem 10 (figur 1A). De resulterende rekombinante proteiner blev spottet på PVDF-membran under anvendelse af RG-M56 mAb og anti-6xHis-antistof til dot-blot hybridisering. Prikken blotting afslørede positive signaler mod 1-338 aa (fuld længde), 51-338 aa, og 195-338 aa, men ikke 1-100 aa eller 1-200 aa rekombinante proteiner (figur 1B). Punktarrayet hybridiseret mod anti-6xHis antistof og bekræftede ekspression af alle rekombinante proteiner. Disse data indikerer, at epitopen af RG-M56 mAb anerkendelse er beliggende i en 144-aa rekombinant protein near C-terminalen af YGNNV kappeprotein (195-338 aa).
Efterfølgende serielle 20-mer peptider med 10 aa-rester lange overlapninger på deres nabo blev udformet og syntetiseret fra sekvensen af 144-aa rekombinante protein for peptid scanning at indsnævre epitopområdet. Disse syntetiske peptider blev spottet på en PVDF-membran og underkastet dot-blot-hybridisering under anvendelse af RG-M56 mAb. Resultatet viste positive signaler kun peptidet 195-214 aa og den positive kontrol, 195-338 aa rekombinant protein (figur 2A). Som epitopen er placeret inden peptidet 195-214 aa region, men ikke peptidet 205-224 aa region, tre serielle 8-mer peptider med 6-aa-rester overlapper fra aa rest 195-206 (peptiderne 195-202 aa, 197- 204 aa, og 199-206 aa) blev udformet og syntetiseret. Dot-blot hybridisering Resultaterne viste positive signaler på peptid 195-202 aa og den positive kontrol peptid 195-214 aa hjælpRG-M56 mAb (figur 2B).
Alanin scanning og substitution mutagenese blev udført for at vurdere specificiteten af hver aa rest af den 8-mer-epitop, 195 VNVSVLCR 202. Hver aa rest af 8-mer peptid var individuelt erstattet med alanin. Alanin mutation peptid matrix blev derefter anbragt på en PVDF-membran under anvendelse af peptid 195-202 aa som en positiv kontrol. Dot-blot-analyse viste, at de tre erstatter mutationer, V197A, V199A, og C201A, afskaffede bindingsaffiniteten af RG-M56 mAb (figur 3A). Selvom aa rest 200 i SJNNV genotypen epitop er methionin, i modsætning til en leucin i de andre fire Betanodavirus genotype epitoper, den SJNNV genotype sekvensen, 195 VNVSVMCR 202, udviste positiv bindingsaffinitet mod RG-M56 mAb, ligesom den positive kontrol (figur 3A). Dette resultat indikerer, at epitoperne of alle Betanodavirus genotyper kan genkendes af RG-M56 mAb. Bindingsaffiniteten af hvert aa rest deltager til epitopen site blev yderligere kvantificeret ved måling af signalet intensiteten af dot-blot af hver alaninsubstitution anvendelse af billedanalyse-software (figur 3B). Intensiteten af V197A, V199A og C201A udskiftninger blev reduceret til 10,2%, 18,6% og 8,5%, når det blev sammenlignet med dem af den positive kontrol (100%), mens V195A, S198A, L200A, R202A, og L200M udskiftninger viste højere eller lignende intensiteter som den positive kontrol. Det er værd at bemærke, at påvirke styrken af N196A substitutionen er tvetydig, med en reduktion i den positive kontrol 37,4%. Disse resultater indikerer, at V197, V199, og C201 er vigtige rester for bindingen af RG-M56 mAb.
De alaninscanningsmutagenese resultater viser, at aa resterne V195, N196, og R202 kanerstattes med alanin, hvilket indebærer, at epitopområdet kunne yderligere indsnævret ved begge termini. Derfor er trin-for-trin trimmet peptidkortlægning til 7-mer, 6-mer, og 5-mer syntetisk peptider trin blev designet til at minimere den antigene region. Det positive signal var til stede på 6-mer syntetisk peptid 196 NVSVLC 201, men ikke på de 7-mer og 5-mer syntetiske peptider (figur 4). Disse data indikerer, at den minimale epitop af NNV kappeprotein genkendes af RG-M56 mAb er den 6-mer peptid, 196 NVSVLC 201.
Figur 1: Reduktion af epitopområdet hjælp serielt trunkerede rekombinante proteiner og monoklonalt antistof. (A) Kort over serielt trunkerede rekombinante NNVCPs. NNVCP 1-338 aa er fuldlængde kappeprotein. (B) Dot-blot analyse af rekombinante NNVCPs. Venstre: Kort over de serielt trunkerede YGNNV rekombinant coat proteiner på PVDF membranen. Midten: dot-blot-analyse blev udført under anvendelse af anti-6xHis-antistof. Til højre: dot-blot-analyse blev udført ved anvendelse RG-M56 mAb. NNVCP: nervøs nekrose viruscoat-protein; aa: aminosyre; PVDF: polyvinylidenfluorid; N: N-terminal; C: C-terminus; mAb: monoklonalt antistof. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fin kortlægning af epitopen region under anvendelse af syntetiske peptider. (A) Venstre: Aminosyresekvenser af 20-mer-syntetiske peptider blev justeret til NNVCP 195-338 aa; hver foregående peptid havde en 10 aa-rester-lang overlapning med følgende peptid. Højre: Map of the synthetic peptider på PVDF-membran. Rekombinant NNVCP 195-338 aa blev anvendt som en positiv kontrol. Dot-blot-analyse blev udført under anvendelse af RG-M56 mAb. (B) Venstre: aminosyresekvenser af de 8-mer syntetiske peptider, 195-202 aa, 197-204 aa, og 199-206 aa; hver foregående peptid havde en 6 aa-rester-lang overlapning med følgende peptid. Syntetisk peptid 195-214 aa blev anvendt som en positiv kontrol. Til højre: dot-blot-analyse blev udført ved anvendelse RG-M56 mAb. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: alaninscanning og substitution mutagenese af 195 VNVSVLCR 202 epitop. (A) Aminosyresekvenser af substitution mutagenese og dot-blot-analyse. Hver aa residue af epitopområdet, 195-202 aa, blev erstattet individuelt med alanin. L200M substitution er SJNNV genotypen sekvens på Betanodavirus kappeproteinet epitop region. Syntetisk peptid 195-202 aa blev anvendt som en positiv kontrol. De udskiftede aa rester er understreget. (B) Kvantificering af dot-blot-signalet bindingsaffinitet. Signalintensiteten af den positive kontrol (195-202 aa) blev bestemt som 100%. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Minimum epitop beslutsomhed. 7-mer (A), 6-mer (B), og 5-mer (C) syntetiske peptider fra 195-202 aa blev anvendt til at identificere den minimale epitop genkendes af RG-M56 mAb. Syntetisk peptide 195-202 aa blev anvendt som en positiv kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en enkel og hurtig teknik til at identificere et mAb-anerkendt lineær epitop. Under hensyntagen til omkostningerne ved peptidsyntese og produktionseffektiviteten til syntetisering peptider, blev den antigene region af viruscoat-proteinet reduceres ved at udtrykke serielt trunkerede rekombinante proteiner før peptidscanning analyse. Som sådan blev pålidelig og effektiv E. coli pET udtryk, der anvendes til at producere disse serielt trunkerede rekombinante proteiner, som rekombinante proteiner med molekylvægte mellem 10 til 50 kan kDa let udtryk gennem dette system. På denne måde kan epitopen let indsnævret til en mere håndterbar 100 til 200 aa region. PET-20b (+) vektor blev specifikt valgt, da den indeholder en sekvens, som koder for ekspressionen af 6xHis-tags, så de producerede 6xHis-tag fusionsproteiner der skal immunodetekteret anvendelse af et anti-6xHis-antistof for at bekræfte ekspressionen af rekombinant proteins. De fremstillede rekombinante kappeproteiner blev derefter analyseret under anvendelse RG-M56 mAb via en dot-blot-hybridiseringsassay. En alternativ fremgangsmåde til rekombinant protein epitop bestemmelse er at oprense det udtrykte rekombinante proteiner via immobiliseret metalion affinitetskromatografi 10, adskille de rekombinante proteiner med SDS-polyacrylamidgelelektroforese, og udfør Western blot-analyse 3.
Til længere og mere fint kortlægge epitopen placering bestemmes af resultaterne af dot-blot hybridisering analyse under anvendelse serielt trunkerede rekombinante proteiner, blev overlappende syntetiske peptider med forskellige størrelser konstrueret. Blandt de forskellige mulige længder af syntetisk peptid til at syntetisere, 20-mer med 10 aa-rester lange overlappende peptider blev valgt først i peptidet scanning, både for deres høje syntese renhed (på omkring 90%) og for deres peptidlængde, nok for søgningen til kontinuerlig epitope genkendes af B-celle antistof 11. Bemærk, at nøjagtigheden og renheden af syntetiserede peptider forringes som den syntetiserede peptid er længere. På denne måde blev epitopområdet hurtigt reduceret til omkring 10 aa rester i længden. Efter serielle 8-mer overlappende peptider blev undersøgt, blev den lineære epitop region defineret til peptid 195-202 aa. Efterfølgende alaninscanning af denne 8-mer epitop-peptid afslører den kritiske bindingsaffinitet styrken af hvert aa rest, så søgningen efter den minimale epitop. De væsentlige roller V197, V199, og C201 aa rester indebærer, at den lineære epitop-regionen dækker mindst 5 aa rester, fra 197 til 201. Desuden kan aa rester V195, N196, og R202 blive erstattet med alanin uden helt at miste binding affinitet, hvilket viser, at epitopen regionen kan nedsættes til 7, 6 eller endda 5 aa-rester i længden. Små peptidsekvenser kan let og økonomisk syntetiseret til søgningen af lineære (continuous) epitoper. Men dette syntetiske peptid scanning teknik er ikke egnet til bestemmelse af en diskontinuerlig epitop af et antistof, medmindre den er kombineret med epitop udskæring og massespektrometrisk analyse 12.
I denne protokol blev en dot-blot-hybridisering teknik bruges til at søge den lineære epitop af et mAb. Dot-blot-hybridisering er en enkel, men effektiv metode. I begyndelsen af søgningen, når epitopområdet indsnævres fra en storstilet landskab, den største bekymring er at observere enten en positiv eller negativ signal efter hybridisering af antistoffet til et mål membranbundet protein, som de fleste mAb'er kun binde til en specifik epitop af et antigent protein (figur 1 og 2). Men når der anvendes dot-blot-hybridisering til at udforske den bindende tilgængeligheden af hver aa rest inden epitopområdet mod antistoffet, såsom ved alaninsubstitution mutagenese,signalet intensiteten af hver substitueret aa resten bestemmes ved dot blotting bør indgå i den samlede bindende betydning. At signalintensiteten kan kvantificeres let ved hjælp af billedanalysesoftware (figur 3B) eller et densitometer. Alternativt kan udføres et enzymbundet immuno-sorbent assay (ELISA) for at kvantificere graden af bindingsaffinitet, og den resulterende signalstyrke 3.
I den tidligere undersøgelse, det eneste kappeprotein af ikke-kuvert nervøs nekrose virus var immuno-genkendt af 10 mAb'er med et højt neutralisering indeksværdi mellem 6,5 til 4.5 (log 10 NI) 2. Den meget specifikke genkendelse evne mAb'erne blev yderligere anvendt til udvikling af den et-trins, hurtig immunokromatografisk diagnostisk kit til påvisning af NNV-inficerede fisk 13. Den antigene epitop af nervøs nekrose virus coat protein blev anerkendt af RG-M18mAb som en 8-mer peptid, 195 VNVSVLCR 202 3, hvorigennem en hidtil ukendt NNV receptor blev identificeret (upublicerede data). I den foreliggende undersøgelse blev epitopen af nervøs nekrose virus kappeprotein yderligere indsnævret til en 6-mer peptid, 196 NVSVLC 201, af den anden mAb, RG-M56.
Det er uventet, at to 7-mer peptider (196 NVSVLCR 202 og 195 VNVSVLC 201) indeholdende 6-mer peptid 196 NVSVLC 201 ikke genkendes af RG-M56 mAb (figur 4A). En rimelig fortolkning er, at selv de omgivende rester V195 og R202 kan ikke bidrage direkte til bindingsinteraktionen mellem epitopen og antistoffet, de flankerende rester indflydelse på dannelsen af den korrekte peptid konformation for antistofgenkendelsen. Fremkomsten af V195 eller R202 på deres flankerende endestation alene kan vride det syntetiske peptidkropsbygning for antistof genkendelse og binding. Den epitop kropsbygning er drevet af styrken af begge ender, V195 og R202, som er balanceret mod hinanden i 8-mer syntetisk peptid, 195 VNVSVLCR 202, og modvirkes i 6-mer syntetisk peptid, 196 NVSVLC 201. AA-rester, V195, N196, og R202, kan individuelt erstattet med alanin uden helt at miste bindende evne, og dermed de alaninscanningsmutagenese resultater indikerer, at disse tre aa rester ikke kan spille en betydelig rolle i genkendelse og binding af RG -M56 mAb. Men efter trimning endnu en rest fra 6-mer syntetisk peptid, 196 NVSVLC 201, 5-mer peptid, 197 VSVLC 201, uden N196 i den N-terminale flankerende region, mister evnen til at blive genkendt og bundet af RG -M56 mAb (figur 4C). Dette resultat antyder, at N196 rest kan også slægge en vigtig rolle i den flankerende region af epitopen for at stabilisere den korrekte epitopkonformation for at lette genkendelsen og bindingen af RG-M56 mAb. Betydningen af flankerende rester omgiver epitopområdet var også blevet udforsket af andre antigen-antistof bindingsundersøgelser. Betydningen af flankerende aa rester omgiver α-bungarotoxin epitop region for binding af antistoffer blev undersøgt ved anvendelse af forskellige aa substitutioner inden for samme cholinerge underordnede websted. De blev derefter bedømt som enten afgørende, indflydelsesrige, eller ikke indflydelsesrige 14. Det blev også konstateret, at specificiteten af antistoffet-genkendte epitop af carcinoma-associerede epitel muciner kan yderligere påvirkes af de flankerende aa rester. Disse virkninger kan præsentere konformationelle barrierer, der kan hæmme bindingen af et antistof til en epitop 15.
Den 6-mer-epitop, 196 NVSVLC 201 </ Sub>, har ekstremt hydrofobe egenskaber, med fire hydrofobe rester, herunder to valiner (197 og 199), en leucin (200), og en cystein (201) (reduceret form). Rester V197, V199, og C201 er afgørende for RG-M56 mAb genkendelse og binding, som bestemt af alaninscanningsmutagenese. Epitopområdet var beliggende på en af otte anti-parallelle p-strenge ved skallen domæne (S-domæne) af NNV kappeprotein 16. Interessant nok epitopen ikke på ydersiden fremspring domæne, men skjuler i jelly-roll struktur af S-domænet under de andre anti-parallelle p-strenge. Epitopen, med sit høje hydrofobicitet, kan opnå en mere stabil mikromiljø i denne fordybning. Desuden blev 195 VNVSVLCR 202 3 peptid af denne epitop fundet at hindre udbredelsen af den gigantiske havaborre nervøs nekrose virus i havaborre hjerneceller. Derfor blev denne epitop peptid foreslået at være en competitor involveret i receptor-bindende domæne kræves for viral indgang 3. Det blev hypotese, at peptid entry inhibitorer omfattende hydrofobe og / eller amfipatiske rester kan ændre den fysiske kropsbygning og kemi af cellulære membran grænseflader og kan hindre fusion af cellulære og virale membraner 17. Endvidere har mange syntetisk peptid entry inhibitorer demonstreret stærke inhiberende egenskaber mod forskellige virusinfektioner 17, 18. Således kan det identificerede epitop peptidet med hydrofobe rester og stærk entry inhibering mod NNV infektion lette udviklingen af terapeutiske peptidbaserede lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E. coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E. coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. The Aquaculture of Groupers. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
