Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

en doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

Hel organkultur af diskusprolaps (IVD) bevarer det native ekstracellulære matrix, cellefænotyper, og cellulær-matrix-interaktioner. Her beskriver vi et IVD kultur-system ved hjælp af musen lumbal og caudale IVDs i deres funktionelle spinal enheder og flere programmer udnytter dette system.

Abstract

Diskusprolaps (IVD) degeneration er en væsentlig bidragyder til lændesmerter. IVD er en fibrocartilaginous fælles, der tjener til at transmittere og dæmpe belastninger i rygsøjlen. IVD består af en proteoglycan-rig nucleus pulposus (NP) og en kollagenrigt annulus fibrose (AF) klemt af bruskagtige endeplader. Sammen med de tilstødende ryghvirvler, ryghvirvler-IVD struktur danner en funktionel rygsøjle enhed (FSU). Disse mikrostrukturer indeholder unikke celletyper samt unikke ekstracellulære matrixer. Hel organkultur af FSU bevarer den native ekstracellulære matrix, celledifferentieringsfaktorer fænotyper, og cellulær-matrix-interaktioner. Således orgel dyrkningsteknikker er særligt nyttige til at undersøge de komplekse biologiske mekanismer IVD. Her beskriver vi en high-throughput tilgang til dyrkning hele lumbal mus FSU'er der giver en ideel platform til at studere sygdomsmekanismer og terapier til IVD. Desuden beskriver vi several programmer, der udnytter dette organ dyrkningsmetode at foretage yderligere undersøgelser, herunder kontrastforøget microCT billeddannelse og tredimensionale høj opløsning finite element modellering af IVD.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lændesmerter (LBP) er den vigtigste faktor for global handicap og tabt produktivitet på arbejdspladsen, og amerikanerne alene tilbringer på over 50 milliarder dollars på LBP behandling 1. Selvom udbredt, ætiologi LBP forbliver kompleks og multifaktoriel. Imidlertid diskusprolaps (IVD) degeneration er blandt de mest betydningsfulde risikofaktorer for LBP 2.

IVD er lavet af tre mikrostrukturer: den ydre annulus fibrose (AF), den indre nucleus pulposus (NP), og to bruskendeplader der omslutter hele strukturen proksimalt og distalt 3. Med aldring og degeneration, de IVD komponenter ændres strukturelt, sammensætningsmæssigt og mekanisk 4. Disse ændringer omfatter tab af proteoglycaner og hydratisering i NP, nedsat skive højde, og forværredes mekanisk kompetence 5. Disse ændringer erofte ledsaget af cytokiner, der fremmer et inflammatorisk respons, såvel som neutrofil og dorsalrodsganglion indtrængen i ledspalten kulminerede i en kaskade af begivenheder, der fører til LBP symptomer 6.

At studere mekanismerne i IVD degeneration er udfordrende i mennesker, fordi det ofte ikke er muligt at isolere årsagen til degeneration før forekomsten af ​​lændesmerter. , Reduktionist villet forenkle eksperimentelle system ned til IVD organ muliggør således mekanistisk finjustering af årsagsvariablerne og undersøge deres downstream virkninger 5. Systemet reduceres til kun den native cellepopulation og omgivende ekstracellulære matrix, hvilket muliggør direkte fortolkning af virkningerne af eksterne stimuli på IVD degeneration. Desuden lavere omkostninger og skalerbarhed af murine modeller, samt det store antal genetisk modificerede dyr 7, tillader than hurtig målrettet screening af IVD degenerative mekanismer og potentielle behandlinger. Her beskriver vi et murint organkultursystem hvori IVD cellulære og vævsstabilitet opretholdes i 21 dage, med særlig fokus gives til IVDs' homeostatiske, mekaniske, strukturelle og inflammatoriske mønstre. Ved hjælp af denne metode, overvåger vi de IVDs funktionelle ændringer i et stik-induceret skade model 8 til at forstå mekanismerne bag disc degeneration. Desuden beskriver vi flere anvendelser af denne organkultur metode til at foretage yderligere undersøgelser, herunder kontrastforøget microCT billeddannelse og tredimensionale høj opløsning modellering af IVD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med Washington University i St. Louis Animal Studies udvalget.

1. Dyr

  1. Opnå to stammer af mus: 10-uger gamle BALB / c (n = 6, BALB-M, BALB / cAnNTac) og 10 uger gamle nuklear faktor kappa-B-luciferase reporter dyr (NF-κβ-luc) opdrættes på en BALB / c baggrund (n = 6, BALB / c-Tg (Relà-luc) 31Xen).
  2. Før dissektion, aflive dyr med CO 2 overdosis ved en strømningshastighed på 2,5-3 l / min i 5 minutter efterfulgt af yderligere 2 min på opholdstid.
  3. Desinficere yderområde af dyret ved at bade den i en 70% ethanol-bad i 2 minutter før dissektion.

2. Dissektion

  1. Gør et langsgående lodret snit på den dorsale overflade af mus ved hjælp af små dissektion saks for at blotlægge legemshulen.
  2. Lav to lodrette snit på hver side af dyrets ryg startende fraden første lændehvirvel (L1) til halehvirvlerne (C8).
  3. Under anvendelse af en skalpel, fin pincet og fine dissektion saks, forsigtigt fjerne rygsøjlen fra L1-C8 fra dyrets krop hulrum.
  4. Fjern forsigtigt overskydende blødt væv, der omgiver rygsøjlen og samtidig sikre at ikke skrabe eller skade IVD på den ventrale side.
  5. Yderligere dissekere rygsøjlen i ryghvirvler-skive-ryghvirvler funktionelle spinal enheder (FSU) på L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6, og C7 / C8 diske.
  6. Skyl FSU'er i Hanks balancerede saltopløsning suppleret med 1% penicillin-streptomycin i 2 min.
  7. Tilfældigt tildele FSU'er i tre grupper: ukultiverede og ubehandlet FSU'er (Fresh), dyrket men ubehandlet FSU'er (kontrol), og dyrket og stikke behandlet FSU'er (Stab).
  8. Snap fryse Fresh FSU prøver med flydende nitrogen umiddelbart efter dissektion og opbevares i en -20 ° C fryser.

3. Organ Culture Betingelser

  1. Forbered 500 ml sterilt dyrkningsmedier på 1: 1 Dulbeccos modificerede Eagles medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM: F12) suppleret med 20% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin.
  2. Anvendelse af 10 ml serologiske pipetter, pipette 2 ml dyrkningsmedium i hver brønd i en 24-brønds kulturplade.
  3. Efter dissektion og skyl, sted hvert FSU i en individuel brønd i pladen medier fyldt 24-godt.
  4. Inkuber prøverne i en steril inkubator, der opretholder 37 ° C, 5% CO2, 20% O2 og> 90% fugtighed.
  5. Efter en indledende periode på 24 timer kultur, mekanisk kvæste Stab tilknyttede prøver via nålepunktur af annulus fibrosus under anvendelse af en steril 27-gauge kanyle, som vist i figur 1A.
  6. Skift medier hver 48. time ved at forberede en ny medie-fyldte 24-brønds kulturplade, og overføre prøver fra den gamle plade til de nye bruger sterile pincetter. Suge de gamle medier og Dispose af den gamle kultur plade i en biologisk farligt affald bin.
  7. På den sidste dag i kultur, inkuberes alle prøver i medier indeholdende 0,75 mg / ml nitro tetrazoliumchlorid i 24 timer.
  8. Bagefter fryse hele FSU'er med flydende nitrogen og opbevares i en -20 ° C fryser indtil klar til mekanisk test eller histologi (figur 1B).

4. Langsgående Målinger NF-KB

  1. Afbilde FSU'er fra NF-κβ-luciferase dyr ved 1, 5, 13 og 19 dage til at vurdere NF-KB-ekspression.
  2. Der tilsættes 10 pi 1 mg / ml luciferinopløsning til hver brønd og inkuber i en steril inkubator ved 37 ° C i 10 min.
  3. Billede prøverne for bioluminescens under anvendelse det billeddannende system med en 1 min eksponeringstid og bin indstilling af 2.
  4. Samtidig bruger maskinen til at tage et fotografi og overlejre det med bioluminescens billedet for at bestemme den anatomiske placering af luminescens i IVD.
  1. Bestemme den mekaniske opførsel af de IVDs ved anvendelse forskydning styret dynamisk kompression 9.
  2. Ved hjælp af en dissektion mikroskop, skalpel og pincetter, fjerne benet hvirvellegemer i FSU fra hver prøve og samtidig holde bruskendepladerne intakt og fastgjort til IVD.
  3. Vedhæfte de isolerede IVDs til en 1 cm x 1 cm x 0,2 cm aluminiumplade ved hjælp cyanoacrylatlim.
  4. Måle disken højde og bredde ved at tage et gennemsnit af tre målinger på den langsgående akse af hver skive under anvendelse af en laser mikrometer. Beregn disken højdeforholdet ved at dividere den gennemsnitlige disc højde med den maksimale disc bredde.
  5. Bruge den målte disc højde for at beregne input belastningsværdier anvendes i mekanisk afprøvning. Bemærk, at den gennemsnitlige disk højde var ca. 690 um ± 39 um.
  6. Placere prøverne i en phosphatpufret saltopløsning bad under compressipå maskinen og forbelaste disk til 0,02 N.
  7. Cyklisk komprimere disken med en sinusformet bølgeform ved 1 Hz i 20 cyklusser ved stammen niveau 1% og 5% stamme i 3 forsøg hver og registrere belastningen og forskydning værdier af IVD. Tillad 10 min af hviletid mellem forsøg til disken for at slappe af og at forhindre skade.
  8. Beregn den gennemsnitlige stivhed fra lastning fase af den sidste cyklus, og beregne tabstangenten fra fasevinklen mellem belastning og forskydningsdata.

6. Proteoglycan og Collagen Kvantificering

  1. Efter mekanisk test, måle disken vådvægt ved at placere den isolerede IVD i en præ-tareret centrifugerør og finde vægten under anvendelse af en analytisk vægt.
  2. Fordøje isolerede IVDs i 250 pi papain-fordøjelse (0,1 M natriumacetat, 0,01 M EDTA, 0,005 M cystein HCI, pH 6,4) natten over ved 65 ° C under anvendelse af en blok varmelegeme.
  3. Centrifugér prøver til 10 minved 2.000 xg og indsamle supernatanten.
  4. Måle proteoglycanindhold af IVD ved hjælp af dimethylmethylen blå (DMMB) assay med chondroitinsulfat standarder.
  5. Forberede DMMB opløsning (21 mg DMMB, 5 ml absolut ethanol, 2 g natriumformiat i 1 liter ddH2O).
  6. Pipetter 30 pi af standarder og prøver i tre eksemplarer i en 96-brønds plade, sammen med 250 pi DMMB opløsning i hver brønd.
  7. Læse absorbansen af ​​pladen ved 525 nm under anvendelse af et spektrofotometer.
  8. Måle collagenindholdet under anvendelse af et hydroxyprolin assaykit overensstemmelse med producentens anvisninger.

7. Histologi

  1. Fastsætte en delmængde af prøver i 4% paraformaldehyd i 24 timer, de-calcify i 5% myresyre i 48 timer, dehydrere med ethanol, og integrere i paraffin.
  2. Under anvendelse af en mikrotom, sektion prøverne sagittalt på 10 um tykkelse og anvende sektioner til objektglas. Plette sektioner ved hjælp af Safranin-O / Fast Green og DAPI.
  3. Ved hjælp af et lysmikroskop, billede glider på 10X forstørrelse.

8. kontrast-forstærket MikroCT Tomography (microCT)

  1. Scan en delmængde af prøver på 0, 2, 5, og 7-dages tidspunkter ved anvendelse langsgående Ioversol kontrast-forstærkning 10, og terminal phosphomolybdensyre (PMA) kontrast-forøgelse ved 7 dages tidspunktet.
  2. 4 timer før microCT scanningstid, tilsættes 300 pi 350 mg / ml iod Ioversol løsning på dyrkningsmedier til en slutkoncentration på ca. 50 mg / ml iodholdig Ioversol opløsning og inkuber i en steril inkubator ved 37 ° C i 4 h.
  3. Efter inkubering wrap prøven i steril gaze og anbringes i en 1 ml mikrocentrifugerør.
  4. Anbring prøverne i microCT systemet og scanning ved 45 keVp, 177 uA, 10,5 um voxelstørrelse, og 300 ms integration.
  5. Eksport af data fra microCT som DICOM-filer og visualisere ved hjælp af software (
  6. Ved 7-dages tidspunktet, fix prøver under anvendelse af en 4% paraformaldehydopløsning i 24 timer, efterfulgt af 5% PMA opløsning i 3 dage, og scanne med de samme indstillinger som dem der anvendes i trin 8.4.

9. Tre Dimensional Finite Element Modeling

  1. Segment DICOM-filer af de IVDs hjælp software med manuel tærskling (fx OsiriX).
  2. Konverter NP og AF mængder af IVD ind voxel-baserede finite element masker ved hjælp Meshlab.
  3. Kombiner de mikrostrukturer af NP og AF til at danne en komplet IVD og anvende eksperimentelt bestemte randbetingelser i finite element software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tallene 2-3 viser repræsentative resultater af proteoglycan distribution, NF-KB-ekspression, stivhed, viskositet, disc højde, og vådvægt for dyrkede muse- IVDs. Hvis dyrkes korrekt, bør IVD parametre i kontrolgruppen ikke være signifikant forskellig fra den friske gruppe. Hvis dyrkningen er inficeret eller anden måde beskadiges, vil kontrolgruppen være forskellig fra Fresh gruppe, især i NF-KB-ekspression og proteoglycan distribution (resultater ikke vist). Figurerne 4-5 viser anvendelser af organkultur at bruge kontrastforøget microCT til opnåelse af en tredimensional model af IVD; Endvidere kan finite element modeller på enten disse strukturer for at bestemme væv stress og stamme distributioner grund af den globale mekaniske opførsel.

figur 1
Figur 1. Eksperimenteloversigt. (A) diskusprolaps funktionelle spinal enheder (FSU'er) blev dissekeret fra lænde- og Halesegmenter; den FSU'er indeholdt to intakt ryghvirvler, bruskendepladerne, og den intervertebrale skive. (B) Efter dissektion blev prøver inddelt i behandlingsgrupper og dyrket in vitro i 21 dage. Bagefter blev en delmængde af prøver, der anvendes til mekanisk afprøvning og biokemiske assays, mens en anden delmængde af prøver blev anvendt til histologisk analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 1
Figur 2. Histologi og NF-KB-ekspression. (A) Efter 21 dage i kultur, Safranin O-farvning (rød) viser, at proteoglycanindhold opretholdesi både AF og NP i kontrolprøverne. (B) De Stab prøver (punkturstedet angivet med pil) udviste faldende proteoglycanindhold i både AF og NP. (C) tetrazolium blåfarvning (blå) viser co-lokalisering. (D) DAPI-farvning viser, at cellerne er metabolisk aktive og levedygtige efter 21 dage i organkultur. (E) NF-KB-ekspression i både kontrol- og Stab prøver viser også, at IVD er levedygtig og reagerer på sine omgivelser. De Stab prøver er steget NF-KB-ekspression ved 1, 5, 13 og 19 dages tidspunkter. Columna IVDs Her vises. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 1
Figur 3. mekanik og sammensætning. ( B) Mekanisk afprøvning viste, at de 1% og 5% deformationsniveauer, Stab prøve stivhed og tabstangens værdier er lavere i forhold til kontrolprøver. (C - D) Biokemiske assays viste, at sammensætningsmæssigt, Stab prøver havde lavere proteoglycan og kollagen-indhold (normaliseret til våd vægt) i forhold til kontrolprøver. (E - F) Strukturelt Stab prøver havde en nedsat disk højdeforhold og våd vægt i forhold til Controls. Mekanisk, sammensætningsmæssigt og strukturelt, Fresh og kontrolprøver værdier var ikke signifikant forskellige fra hinanden. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 1
Figur 4. kontrast-forstærket microCT visualization. Kontrastforøget microCT kan anvendes til at visualisere IVD i tre dimensioner under dyrkningsperioden. Caudale IVDs Her vises. Den differentielle binding af Ioversol til AF (lavere dæmpning) og NP (højere dæmpning) gør det muligt at skelne AF fra NP. Omvendt PMA fortrinsvis binder til collagen rester i AF (højere dæmpning), endepladerne, og rygstrengen. Billederne blev visualiseret ved hjælp af farve, så hvid repræsenterer høj dæmpning, gul repræsenterer middel dæmpning, og rød repræsenterer lav dæmpning. (A - E) Sagittale visninger af IVD på dag 0, 2, 5 og 7 med Ioversol kontrast og med PMA kontrast. (F - J) Tværgående visninger af IVD på dag 0, 2, 5 og 6 med Ioversol kontrast og med PMA kontrast. Caudale IVDs Her vises. Klik her for at se et larger version af denne figur.

figur 1
Figur 5. Finite element modellering (FEM) af IVD struktur. FEM analyse er et kraftfuldt matematisk værktøj, der giver beregningen af ​​lokale materiale reaktion på større randbetingelser. For eksempel (A) NP kan gøres separat fra (B) AF, og hvert rum kunne tildeles unikke konstitutive egenskaber. (C) En kombineret IVD struktur med både AF og NP er vist i 3D. Når aksiale belastninger påføres på disken på den overlegne endeplade med den ringere endeplade er en fast kant, kan vi bestemme de lokale koncentrationer af spændinger og belastninger. Gule prikker og sorte pile repræsenterer et knudepunkt belastning påføres. Klik her for at se enstørre udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokol beskriver en organkultur af den murine FSU med vægt på overvågning af de biologiske ændringer i IVD. Den vellykkede vedligeholdelse af disse kulturer kræver nøje sterile teknikker. Navnlig dissektion trin 2,1-2,6 og kulturen trin 3,1-3,6 kræver særlig omhu for at sikre sterile forhold opretholdes, og bør udføres disse trin fortrinsvis i en isoleret procedure værelse med et HEPA luftstrøm for at minimere kontaminanter. Fordi dissektion proces medfører traumer til vævet, er den 24-h konditionering periode i 3,5 kræves for alle behandlingsgrupper inklusive kontrolgruppen. Levedygtighedsværdierne assays kan anvendes til at sikre prøver er i live og uden ujævnheder og også tjene som en bekræftelse på, at cellulær homeostase opretholdes. NF-KB luminescens aflæsninger kan også anvendes til på langs at overvåge inflammatoriske respons af den dyrkede FSU'er; en stigning i NF-KB expression under dyrkning kunne indikere FSU'er er forurenet eller på anden måde under stress fra infektion 11, og vi inkluderer det således her som et muligt trin fejlfinding. Endelig sammenligninger til de friske grupper tjene som en ekstra kontrol punkt for kontrol dyrkede prøver i histologi og mekanisk ydelse. Denne kultur teknik er modtagelig for flere prøver per plade, og i vores erfaring, kan op til 24 prøver på en 24-brønds plade nemt ske. Imidlertid multipleksingen af ​​prøver udbreder også risikoen for krydsforurening og dermed det anbefales, at FSU'er dyrkes på separate plader under fejlfinding. Og mens denne protokol giver instruktioner til en dyrkningsperiode på 21 dage, den samme metode kan anvendes til dyrkningsperioder, der er længere eller kortere. FSU'er succes er blevet dyrket af vores laboratorium for kultur perioder fra 1 uge til 5 uger.

Like alle modeller, orgel kultur modeller i murine har begrænsninger, især i deres evne til at indfange de belastningsforhold for mennesker. Der er også små forskelle i geometri mellem de murine og humane IVDs 12, og mennesker er tofods- med primært aksiale belastninger på rygsøjlen mens rotter og mus er firbenede. Eftersom den dyrkede tilstand relativt aflæsses i sin nuværende form, lastning tilstand er imidlertid sandsynligvis ikke have påvirket IVDs. Andre systemer, såsom bovin IVD organkultur modeller 13, 14 kan være bedre egnet til mekaniske og lastning interaktioner. Fremtidige arbejde vil inkorporere belastningstilstande at muliggøre undersøgelsen af ​​mechanobiological interaktioner mellem mekaniske og miljømæssige faktorer. Effekten af ​​denne fremgangsmåde ligger i dens konsistens, alsidighed og evne til høj opløsning billeddannelse. Vores tilgang her viser, at det er muligt at kultur both lumbal og caudale IVDs, men det er vigtigt at bemærke, at disse diske er anatomisk anderledes tværs aldring og udvikling 15. Som sådan, vores eksperimentelle design tilfældig rækkefølge lænden og caudale niveauer separat.

Kontrastforøget microCT tillader høj opløsning, destruktiv, tredimensional billeddannelse af IVD. Forskellige kontrastmidler kan bruges til at fremhæve forskellige kompositoriske aspekter af IVD. Vi viser her anvendelsen af Ioversol, en iodholdig ikke-cytotoksisk hydrofilt middel 10, og phosphomolybdensyre (PMA), en heavy-metal-molekyle, der chelaterer til collagen aminorester. Ved anvendelse af disse kontrastmidler-midler kan mikrostrukturelle træk i IVD fremhæves og identificeres. Ioversol adskiller den relative hydratisering af IVD væv, hvorved der tilvejebringes kontrast mellem vandrige nucleus pulposus og mindre hydratiserede annulus fibrosus.PMA giver differentiering af relativ collagenpræparat i væv og vil fremhæve endepladerne, fibrøse ring og rygstrengen. Ioversol kan anvendes under dyrkning for at bestemme de langsgående ændringer i hydratisering, mens PMA kan påføres IVD ved terminalen punkt i kultur for at overvåge collagen ændringer.

Fremtidige anvendelser af denne teknologi indbefatter anvende andre stammer af transgene og knockout-mus til at forstå forskellige aspekter af IVD degeneration i andre sygdomme. Endvidere er det en potentiel platform for co-kultur med andre organsystemer og celler, såsom dorsalrodganglier at identificere interaktioner der kan bidrage til IVD degeneration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne af dette manuskript erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Washington University Muskuloskeletal Forskningscenter (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), Mechanobiology Training Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, og NIH K01AR069116. Forfatterne vil gerne takke Patrick Wong for hans bidrag i dataindsamlingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8, (1), 8-20 (2008).
  2. Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5, (6), 1-48 (2003).
  3. Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13, (3), 131-142 (1995).
  4. Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20, (24), 2690-2701 (1995).
  5. Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34, (8), 1431-1438 (2016).
  6. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15, (6), 1347-1355 (2015).
  7. Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9, (12), (2014).
  8. Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15, (4), 404-413 (2011).
  9. Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48, (10), 2189-2194 (2015).
  10. Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
  11. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9, (11), 778-788 (2009).
  12. O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32, (3), 328-333 (2007).
  13. Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
  14. Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
  15. Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116, (12), (2014).
en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter