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Bioengineering

Ein doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

Ganz Organkultur der Bandscheibe (IVD) bewahrt die native extrazelluläre Matrix, Zellphänotypen und zelluläre-Matrix-Wechselwirkungen. Hier beschreiben wir ein IVD-Kultursystem mit Maus Lenden- und Schwanz IVDs in ihren funktionalen Wirbelsäuleneinheiten und mehrere Anwendungen, die dieses System nutzen.

Abstract

Bandscheibe (IVD) Degeneration ist ein wichtiger Faktor für Schmerzen im unteren Rücken. Der IVD ist ein fibrocartilagineum Gelenk, das in der Wirbelsäule Lasten zu übertragen und dämpfen dient. Der IVD besteht aus einem Proteoglycan reichen Nukleus pulposus (NP) und einem kollagenreichen Anulus fibrosus (AF) von knorpeligen Endplatten sandwichartig angeordnet. Zusammen mit den benachbarten Wirbeln, bildet die Wirbel-IVD-Struktur mit einer funktionellen Wirbelsäuleneinheit (FSU). Diese Mikrostrukturen enthalten einzigartige Zelltypen sowie einzigartige extrazellulären Matrix. Ganz Organkultur der FSU bewahrt die native extrazellulären Matrix, Zelldifferenzierung Phänotypen und zelluläre-Matrix-Interaktionen. Somit sind Organkultur-Techniken besonders nützlich für die komplexen biologischen Mechanismen des IVD zu untersuchen. Hier beschreiben wir einen High-Throughput-Ansatz zur Kultivierung gesamte Lendenwirbel Maus FSU, die für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen und Therapien für die IVD eine ideale Plattform zur Verfügung stellt. Darüber hinaus beschreiben wir siele Anwendungen, die diese Organkulturverfahren nutzen weitere Studien einschließlich kontrastverstärkte microCT Bildgebung und dreidimensionale hochaufgelöste Finite-Elemente-Modellierung des IVD zu leiten.

Introduction

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Schmerzen im unteren Rücken (LBP) ist der führende Faktor für die globale Behinderung und verlorene Produktivität am Arbeitsplatz, und die Amerikaner allein verbringen mehr als 50 Milliarden Dollar für LBP Behandlung 1. Obwohl weit verbreitet, bleibt die Ätiologie von LBP komplex und multifaktoriell. Allerdings ist Bandscheibe (IVD) Degeneration zu den bedeutendsten Risikofaktoren für LBP 2.

Der IVD ist aus drei Mikrostrukturen: die äußere Anulus fibrosus (AF), der Innenraum Nucleus pulposus (NP) und zwei knorpeligen Endplatten, die die gesamte Struktur proximal und distal 3 - Sandwich. Mit dem Altern und Degeneration, ändern sich die Komponenten IVD Strukturell kompositionell und mechanisch 4. Diese Änderungen umfassen den Verlust von Proteoglykanen und Feuchtigkeit in der NP, verringerte Scheibenhöhe und verschlechterte mechanische Kompetenz 5. Diese Veränderungen sindoft durch Cytokine begleitet , die eine Entzündungsreaktion, sowie Neutrophilen und Spinalganglien Eindringen in den Gelenkraum kulminiert in einer Kaskade von Ereignissen zu fördern , die 6 bis LBP Symptomen führen.

Die Untersuchung der Mechanismen der IVD-Degeneration ist eine Herausforderung beim Menschen, weil es oft nicht möglich ist, die Ursache für die Degeneration vor dem Auftreten von Schmerzen im unteren Rücken zu isolieren. Somit wurde ein reduktionistischen Ansatz , um das experimentelle System zu vereinfachen , bis auf die IVD Organ ermöglicht mechanistische Feinabstimmung der kausalen Variablen und Prüfung ihre nachgelagerten Effekte 5. Das System wird nur die nativen Zellpopulation reduziert und extrazelluläre Matrix umgibt, wodurch die direkte Interpretation der Auswirkungen von äußeren Reizen auf IVD-Degeneration zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglichen die niedriger Kosten und die Skalierbarkeit von murinen Modellen, sowie die große Anzahl von gentechnisch veränderten Tieren 7, für ter rasch gezielte Screening von IVD degenerative Mechanismen und mögliche Therapien. Hier beschreiben wir ein Maus-Organkultursystem, in der IVD Zell- und Gewebestabilität über 21 Tage gehalten wird, mit besonderem Schwerpunkt auf den IVDs gegeben homeostatic, mechanische, strukturelle und entzündliche Muster. Mit dieser Methode überwachen wir die funktionellen Veränderungen IVDs in einem Stich induziertes Verletzungsmodell 8 , die Mechanismen hinter Scheibendegeneration zu verstehen. Weiterhin beschreiben wir mehrere Anwendungen dieser Organkulturverfahren weitere Studien einschließlich kontrastverstärkte microCT Bildgebung und dreidimensionale hochaufgelöste Modellierung des IVD zu leiten.

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Protocol

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Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Washington University in St. Louis Tierstudien Ausschuss durchgeführt.

1. Tiere

  1. Erhalten Sie zwei Stämme von Mäusen: 10 Wochen alte Balb / c (n = 6, Balb-M, BALB / cAnNTac) und 10 Wochen alte nuclear factor kappa-B-Luciferase-Reporter Tiere (NF-κβ-luc) gezüchtet auf einem BALB / c-Hintergrund (n = 6, BALB / c-Tg (Relà-luc) 31Xen).
  2. Vor der Dissektion euthanize Tiere mit CO 2 Überdosierung bei einer Flußrate von 2,5-3 l / min für 5 min , gefolgt von weiteren 2 min Zeit der Behausung.
  3. Desinfizieren des Außenbereiches des Tieres, indem sie in einem 70% Ethanol-Bad für 2 min vor der Dissektion Baden.

2. Dissection

  1. Führte einen Längsvertikalschnitt auf der dorsalen Oberfläche der Maus kleine Dissektion Schere mit der Körperhöhle zu exponieren.
  2. Machen Sie zwei vertikale Längsschnitte auf beiden Seiten der Wirbelsäule des Tieres abder erste Lendenwirbel (L1) an die Schwanzwirbel (C8).
  3. Unter Verwendung eines Skalpells, feinen Pinzette und Schere fein Dissektion vorsichtig entfernen die Wirbelsäule von L1-C8 aus der Körperhöhle des Tiers.
  4. vorsichtig entfernen überschüssige Weichgewebe die Wirbelsäule umgeben, während sichergestellt wird, um nicht abkratzen oder IVD auf der ventralen Seite verletzen.
  5. die Wirbelsäule in die Wirbelkörper-scheiben Wirbel funktionelle Wirbelsäuleneinheiten (FSU) in der L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6 und C7 / C8 Scheiben weiter sezieren.
  6. Spülen Sie die FSU in Hanks balancierter Salzlösung, ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin für 2 min.
  7. zuweisen zufalls die FSU in drei Gruppen: uncultured und unbehandeltem FSUs (frisch), gezüchteten aber unbehandelten FSUs (Kontrolle) kultiviert und behandelt FSUs stab (STAB).
  8. Schnellfrost die frischen FSU Proben mit flüssigem Stickstoff unmittelbar nach Dissektion und Speicher in einem -20 ° C-Gefrierschrank.

3. Organkulturbedingungen

  1. Bereiten 500 ml steriles Kulturmedium von 1: 1 Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM: F12), ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin.
  2. Unter Verwendung von 10 ml serologischen Pipetten, Pipetten 2 ml Kulturmediums in jede Vertiefung einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen.
  3. Folgende Dissektion und spülen, stellen jeweils FSU in eine einzelne Vertiefung in den Medien gefüllten 24-Well-Platte.
  4. Inkubieren der Proben in einem sterilen Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2, 20% O 2 und> 90% Luftfeuchtigkeit bewahrt.
  5. Nach einer anfänglichen Kulturdauer von 24 h, verletzen mechanisch STAB Gruppenproben über Nadeleinstich des Anulus fibrosus eine sterile 27-Gauge - Nadel , wie in 1A gezeigt.
  6. Ändern Medien alle 48 h durch eine neue Medien gefüllte Vorbereitung 24-Well-Kulturplatte und Transfer Proben von der alten Platte auf die neue mit einem sterilen Pinzette. Aspirieren die alten Medien und dispose der alten Kulturplatte in einem Biohazard Abfalleimer.
  7. Am letzten Tag der Kultur, Inkubieren alle Proben in Medium 0,75 mg / ml Nitroblau-Tetrazoliumchlorid für 24 h enthalten.
  8. Danach gefriert ganzen FSUs mit flüssigem Stickstoff und Speicher in einem -20 ° C - Gefrierschrank , bis sie bereit für die mechanische Prüfung oder Histologie (1B).

4. Längs Messungen NF-kappaB

  1. Bild die FSU von NF-κβ-Luciferase Tieren bei 1, 5, 13 und 19 Tagen NF-kappaB Ausdruck zu bewerten.
  2. Zugabe von 10 & mgr; l von 1 mg / ml Luciferin-Lösung in jeder Vertiefung und Inkubieren in einem sterilen Inkubator bei 37 ° C für 10 min.
  3. Bild, um die Proben für die Biolumineszenz unter Verwendung des Abbildungssystems mit einer 1 min Belichtungszeit und bin Einstellung von 2.
  4. Gleichzeitig verwendet die Maschine um ein Bild aufzunehmen und es mit dem Biolumineszenz-Bild überlagert die anatomische Lage der Lumineszenz in der IVD zu bestimmen.
  1. Bestimme das mechanische Verhalten der IVDs durch Verwendung Wegkontrolliert dynamische Kompression 9.
  2. Unter Verwendung einen Dissektionsmikroskop, Skalpell und Pinzette, entfernt die knöchernen Wirbelkörper der FSU von jeder Probe, während der knorpeligen Endplatten intakt zu halten und den IVD befestigt.
  3. Befestigen der isolierten IVDs auf eine 1 cm x 1 cm x 0,2 cm Aluminiumplatte unter Verwendung von Cyanacrylat-Klebstoff.
  4. Messen Sie die Scheibenhöhe und Breite um durchschnittlich drei Messungen auf der Längsachse jeder Scheibe unter einem Laser-Mikrometer verwendet wird. Berechnen Sie das Scheibenhöhenverhältnis, indem die durchschnittliche Scheibenhöhe durch die maximale Scheibenbreite dividiert wird.
  5. Verwenden der gemessenen Scheibenhöhe der Eingangsspannungswerte in mechanischen Tests verwendet zu berechnen. Beachten Sie, dass die durchschnittliche Scheibenhöhe um ± 39 um etwa 690 war.
  6. Platzieren Sie die Proben in einer phosphatgepufferten Salzbades unter der compressiauf Maschine und Vorspannung der Scheibe bis 0,02 N.
  7. Zyklisch komprimiert die Scheibe mit einer sinusförmigen Wellenform bei 1 Hz für 20 Zyklen bei der 1% Dehnung Ebene und 5% Dehnungsniveau für jede 3-Studien unter Verwendung von und die Last und die Verschiebungswerten der IVD aufzuzuzeichnen. Erlauben Sie 10 Minuten Zeit zwischen den Versuchen für die Scheibe ruht sich zu entspannen und um Verletzungen zu vermeiden.
  8. Berechne die mittlere Steifigkeit von der Ladephase des letzten Zyklus, und berechnet die Verlusttangente von dem Phasenwinkel zwischen Last- und Verschiebungsdaten.

6. Proteoglycan und Kollagen Quantifizierung

  1. Nach der mechanischen Tests messen die Scheibe Naßgewicht durch das isolierte IVD in einer vorher tariertes Zentrifugenröhrchen platziert und Messen des Gewichts einer Analysenwaage verwendet wird.
  2. Verdauen des isolierten IVDs in 250 & mgr; l Papain-Digestion-Lösung (0,1 M Natriumacetat, 0,01 M EDTA, 0,005 M Cystein-HCl, pH 6,4) über Nacht bei 65 ° C ein Heizblock verwendet wird.
  3. Zentrifuge Proben für 10 minbei 2000 × g und die überstehende Flüssigkeit sammeln.
  4. Messen Sie das Proteoglycan-Gehalt des IVD durch die Dimethylmethylen blaue Verwendung (DMMB) -Assay mit Chondroitinsulfat-Standards.
  5. Bereiten DMMB - Lösung (21 mg DMMB, 5 ml absolutes Ethanol, 2 g Natriumformiat in 1 l ddH 2 O).
  6. Pipette 30 ul Standards und Proben in dreifacher Ausführung in einer 96-Well-Platte, zusammen mit 250 ul DMMB-Lösung in jeder Vertiefung.
  7. Die Absorption der Platte bei 525 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers.
  8. Messen Sie den Kollagengehalt eines Hydroxyprolin-Assay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird.

7. Histologie

  1. Fix eine Teilmenge der Proben in 4% Paraformaldehyd für 24 h, de-verkalken für 48 h in 5% Ameisensäure, Entwässern mit Ethanol und in Paraffin eingebettet werden.
  2. Unter Verwendung eines Mikrotoms, Abschnitt werden die Proben sagittal bei 10 & mgr; m Dicke und gelten Schnitte an den Glasobjektträger. Beflecken die Abschnitte mit Safranin-O / Fast Green und DAPI.
  3. Unter Verwendung eines Lichtmikroskops, Bild gleitet bei 10facher Vergrößerung.

8. Contrast-enhanced microComputed Tomography (microCT)

  1. Scannen eine Teilmenge von Proben , die bei den 0, 2, 5 und 7-Tage - Zeitpunkt unter Verwendung von Ioversol Längskontrastverstärkung 10 und dem Anschluss Phosphomolybdänsäure (PMA) Kontrastverstärkung bei dem 7 - tägigen Zeitpunkt.
  2. 4 h vor dem microCT Abtastzeit, fügt 300 ul 350 mg / ml Jod Ioversol-Lösung zu den Kulturmedien für eine Endkonzentration von etwa 50 mg / mL iodhaltigen Ioversol-Lösung und Inkubieren in einem sterilen Inkubator bei 37 ° C für 4 h.
  3. Nach der Inkubation wickelt die Probe in steriler Gaze und in einem Mikrozentrifugenröhrchen 1 ml.
  4. Die Proben werden in dem System microCT und Scan bei 45 keVp, 177 & mgr; A, 10,5 um Voxel-Größe, und 300 ms Integration.
  5. Exportieren von Daten aus dem microCT als DICOM-Dateien und visualisieren Software (
  6. An dem 7-Tage-Zeitpunkt, zu beheben Proben mit einer 4% Paraformaldehydlösung für 24 Stunden unter Verwendung von, gefolgt von 5% PMA-Lösung für 3 Tage, und scannen Sie die gleichen Einstellungen wie in Schritt 8.4 verwendet werden.

9. Dreidimensional Finite-Elemente-Modellierung

  1. Segment der DICOM - Dateien des IVD unter Verwendung von Software mit manuellem Thresholding (zB OsiriX).
  2. Konvertieren Sie die NP und AF Volumina des IVD in Voxel-basierten Finite-Elemente-Netze mit Meshlab.
  3. Kombinieren Sie die Mikrostrukturen des NP und AF eine komplette IVD zu bilden und gilt experimentell bestimmte Randbedingungen in der Finite-Elemente-Software.

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Representative Results

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Figuren 2-3 zeigen repräsentative Ergebnisse von Proteoglycan Verteilung, NF & kgr; B Expression, Steifigkeit, Viskosität, Scheibenhöhe und Naßgewicht für kultivierte Maus IVDs. Wenn sie richtig kultiviert, werden die IVD Parameter der Kontrollgruppe nicht signifikant verschieden von der Frische-Gruppe. Wenn die Kultur infiziert ist oder auf andere Weise beeinträchtigt, wird die Kontrollgruppe aus der Frischen Gruppe unterschiedlich sein, vor allem in NF-kappaB-Expression und Proteoglykan Verteilung (Ergebnisse nicht gezeigt). Die Figuren 4-5 zeigen , Anwendungen der Organkultur zur kontrastverstärkten microCT unter Verwendung eines dreidimensionalen Modells des IVD zu erhalten; Ferner kann Finite-Elemente-Modellierung auf diese Strukturen angewandt werden, um Gewebe Spannungs- und Dehnungsverteilung aufgrund des globalen mechanischen Verhalten zu bestimmen.

Abbildung 1
Abbildung 1. ExperimentellerÜberblick. (A) funktionelle spinalen Bandscheibeneinheiten (FSU) wurden aus der Lenden- und Schwanzsegmente zergliedert; der FSUs enthielt zwei intakte Wirbel, die knorpeligen Endplatten, und die Bandscheibe. (B) Nach der Präparation wurden die Proben in Behandlungsgruppen aufgeteilt und in vitro kultiviert für 21 Tage. Danach wurde für die mechanische Prüfung und biochemische Assays, während eine andere Teilmenge der Proben verwendet wurde für die histologische Analyse eine Teilmenge der Proben verwendet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 1
Abbildung 2. Histologie und NF-kappaB Ausdruck. (A) Nach 21 Tagen in Kultur, Safranin - O - Färbung (rot) zeigt , dass die Proteoglykan - Gehalt beibehalten wirdsowohl in dem AF und NP in den Kontrollproben. (B) Die Stichproben (Einstichstelle durch einen Pfeil angedeutet) zeigten verringerte Proteoglykangehalt in sowohl dem AF und NP. (C) Tetrazolium - Blau - Färbung (blau) zeigt die Co-Lokalisierung. (D) DAPI - Färbung zeigt , dass die Zellen metabolisch aktive und tragfähige nach 21 Tagen in Organkultur. (E) NF & kgr; B - Expression in sowohl die Steuer und Stichproben zeigt auch an, dass der IVD lebensfähig ist und auf deren Umgebung. Die Stichproben werden NF & kgr; B-Expression auf den 1, 5, 13 und 19-Tage-Zeitpunkt erhöht wird. Lendenwirbel IVDs werden hier gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 1
Abbildung 3. Mechanik und Zusammensetzung. ( B) Mechanische Prüfung ergab , dass bei den 1% und 5% Dehnungsniveaus, stoß Probensteifigkeit und Verlusttangentenwerte geringere relative Proben zu steuern. (C - D) Biochemische Assays zeigten , dass kompositionell STAB Proben hatten niedrigere Proteoglycan und Kollagen - Gehalt (normalisierte Gewicht benetzen) relativ zu Kontrollproben. (E - F) Strukturell hatte Stab Proben eine verringerte Bandscheibenhöhe und Verhältnis Naßgewicht relativ zu Kontrollen. Mechanisch, kompositorisch und strukturell, Frische und Kontrollproben Werte unterschieden sich nicht signifikant voneinander. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 1
Abbildung 4. Contrast-enhanced microCT visualizatIon. Contrast-enhanced microCT kann verwendet werden, um die IVD in drei Dimensionen während der Kulturperiode zu visualisieren. Caudal IVDs werden hier gezeigt. Die differentielle Bindung von Ioversol an die AF (geringere Dämpfung) und NP (höhere Dämpfung) ermöglicht es, die AF aus dem NP zu unterscheiden. Umgekehrt bindet PMA vorzugsweise an die Kollagen-Reste in der AF (höhere Dämpfung), die Endplatten und die Chorda dorsalis. Die Bilder wurden unter Verwendung von Farbe, wie sichtbar gemacht, dass weiße hohe Dämpfung darstellt, gelb Medium Dämpfung darstellt und Rot darstellt geringe Dämpfung. (A - E) Sagittal Ansichten des IVD an den Tagen 0, 2, 5 und 7 mit Ioversol Kontrast und mit PMA Kontrast. (F - J) Queransichten des IVD an den Tagen 0, 2, 5 und 6 mit Loversol Kontrast und mit PMA Kontrast. Caudal IVDs werden hier gezeigt. Bitte klicken Sie hier a la anzuzeigenrger Version dieser Figur.

Abbildung 1
Abbildung 5. Finite - Elemente - Modellierung (FEM) der IVD - Struktur. FEM-Analyse ist ein leistungsfähiges mathematisches Werkzeug, das die Berechnung der lokalen Material Reaktion auf größere Randbedingungen ermöglicht. Zum Beispiel kann (A) kann der NP getrennt von wiedergegeben werden (B) , um den AF, und jedes Fach einzigartige konstitutive Eigenschaften zugeordnet werden kann. (C) Eine kombinierte IVD Struktur sowohl mit dem AF und NP wird in 3D gezeigt. Wenn axiale Lasten auf die Platte auf der oberen Stirnplatte mit der unteren Endplatte angewandt werden, ist eine feste Kante, können wir die lokalen Konzentrationen von Spannungen und Dehnungen bestimmen. Gelbe Punkte und schwarze Pfeile stellen ein Knotenlast aufgebracht wird. Bitte klicken Sie hier anzuschauenGrößere Version der Figur.

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Discussion

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Dieses Protokoll beschreibt eine Organkultur des murinen FSU mit dem Schwerpunkt auf die biologischen Veränderungen in der IVD-Überwachung. Die erfolgreiche Aufrechterhaltung dieser Kulturen erfordert eine sorgfältige sterile Techniken. Insbesondere werden die Schritte der Präparation 2,1-2,6 und die Kultur Schritte 3,1-3,6 besondere Sorgfalt erfordern sterilen Bedingungen, um sicherzustellen, werden beibehalten, und diese Schritte sollten vorzugsweise in einem isolierten Behandlungsraum mit einem HEPA-Luftstrom zu minimieren Verunreinigungen durchgeführt werden. Da die Dissektion Prozess Trauma auf die Gewebe verursacht, die 24-h-Zeitraum Vorkonditionierung in 3,5 ist für alle Behandlungsgruppen, einschließlich der Kontrollen erforderlich. Die Lebensfähigkeitstests können verwendet werden, um Proben am Leben und unberührten sind, um sicherzustellen, und auch als Bestätigung dienen, dass die zelluläre Homöostase aufrechterhalten wird. Die NF & kgr; B Lumineszenz Ablesungen kann auch in Längsrichtung zu überwachen, um die Entzündungsreaktion des gezüchteten FSUs verwendet werden; eine Erhöhung der NF & kgr; B-ExpressIon während der Kultur könnte die FSU verunreinigt ist oder auf andere Weise unter Stress vor einer Infektion 11, und wir es so sind hier als möglicher Problembehandlungsschritt anzuzeigen. Schließlich Vergleiche zu den Frische-Gruppen dienen als zusätzlichen Kontrollpunkt für die Kontrolle kultivierten Proben in der Histologie und mechanische Leistung. Diese Kulturtechnik ist zugänglich für mehrere Proben pro Platte, und in unserer Erfahrung, bis zu 24 Proben auf einer 24-Well-Platte leicht erreicht werden können. Jedoch breitet sich das Multiplexen von Proben auch das Risiko einer Kreuzkontamination und daher wird empfohlen, dass FSUs auf separaten Platten bei der Fehlersuche kultiviert werden. Zusätzlich kann, während dieses Protokoll Anweisungen für eine Kulturdauer von 21 Tagen bietet, kann das gleiche Verfahren für Kulturperioden verwendet werden, die länger oder kürzer. FSU wurde von unserem Labor für Kulturzeiten im Bereich von 1 Woche bis 5 Wochen erfolgreich kultiviert.

Like alle Modelle, Organkulturmodelle in murine haben ihre Grenzen, vor allem in ihrer Fähigkeit, die Belastungsbedingungen der Menschen zu erfassen. Darüber hinaus gibt es feine Unterschiede in der Geometrie zwischen den murinen und humanen IVDs 12, und Menschen sind auf zwei Beinen mit vorwiegend axialer Belastung auf die Wirbelsäule während Ratten und Mäuse Vierfüßler sind. Da jedoch der gezüchtete Zustand relativ in seiner jetzigen Form entladen wird, ist der Lademodus wahrscheinlich nicht die IVDs beeinflusst haben. Andere Systeme , wie beispielsweise bovine IVD Organkulturmodell 13, 14 können besser geeignet sein für die mechanischen und Laden - Wechselwirkungen. Zukünftige Arbeiten werden Belastungsbedingungen übernehmen die Untersuchung von mechanisch-Wechselwirkungen zwischen mechanischen und Umweltfaktoren zu ermöglichen. Die Kraft dieses Ansatzes liegt in seiner Konsistenz, Vielseitigkeit und Leistungsfähigkeit für die hochauflösende Bildgebung. Unser Ansatz zeigt hier, dass es um Kultur b möglich istoth Lenden- und Schwanz IVDs, aber es ist wichtig zu beachten , dass diese Scheiben anatomisch unterschiedlich sind über Alterung und Entwicklung 15. Als solche experimentellen Designs randomisiert die Lenden- und Schwanz Ebene getrennt.

Contrast-enhanced microCT erlaubt den hochauflösende, nicht zerstörende, dreidimensionale Abbildung des IVD. Verschiedene Kontrastmittel können verwendet werden, um verschiedene kompositorische Aspekte des IVD hervorzuheben. Wir zeigen hier die Verwendung von Ioversol, einem iodhaltigen nicht zytotoxisch hydrophilem Mittel 10 und Phosphomolybdänsäure (PMA), ein Schwermetall - Molekül , das an Kollagen Reste Amino chelatisiert. Mit diesen Kontrastmitteln können die mikrostrukturellen Eigenschaften im IVD hervorgehoben und identifiziert werden. Ioversol unterscheidet die relative Hydratisierung der IVD Gewebe, wodurch der Kontrast zwischen der wasserreichen Nucleus pulposus Bereitstellung und dem weniger hydratisierten Anulus fibrosus.Die PMA stellt Differenzierung der relativen Kollagenzusammensetzung in Gewebe und wird die Endplatten, Annulus fibrosus und die Chorda markieren. Ioversol kann während der Kultur verwendet werden, um die Längenänderungen der Hydratation zu bestimmen, während PMA können an der Klemmstelle der Kultur der IVD angewandt werden Kollagen Veränderungen zu überwachen.

Zukünftige Anwendungen dieser Technologie sind unter Verwendung anderer Stämme von transgenen und Knockout-Mäusen verschiedene Aspekte der IVD-Degeneration bei anderen Krankheiten zu verstehen. Ferner ist es eine potentielle Plattform für die Co-Kultur mit anderen Organsystemen und Zellen wie Dorsalwurzelganglien Wechselwirkungen zu identifizieren, die IVD-Degeneration beitragen kann.

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Disclosures

Die Autoren dieses Manuskript zu erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Washington University Musculoskeletal Research Center (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), Mechanobiology Ausbildung Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 und NIH K01AR069116 unterstützt. Die Autoren möchten sich Patrick Wong für seine Beiträge in der Datenerhebung danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben
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Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

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