Summary
椎間板（IVD）の全体の器官培養は、天然の細胞外マトリックス、細胞表現型、および細胞 - マトリックス相互作用を保存します。ここでは、マウスの腰椎とその機能脊髄単位で尾したIVDと、このシステムを利用する複数のアプリケーションを使用してIVD培養系を説明します。
Abstract
椎間板（IVD）変性が腰痛に多大な貢献です。 IVDは、脊椎の荷重を伝達し、減衰させる働きを線維軟骨関節です。 IVDは、プロテオグリカンが豊富な髄核（NP）と軟骨終板に挟まれたコラーゲンが豊富な線維輪（AF）から成ります。一緒に隣接する椎骨と椎骨-IVDの構造は、機能的脊椎ユニット（FSU）を形成します。これらの微細構造はユニークな細胞型だけでなく、ユニークな細胞外基質が含まれています。 FSUの全体の器官培養は、天然の細胞外マトリックス、細胞分化表現型、および細胞 - マトリックス相互作用を保存します。これにより、器官培養技術は、IVDの複雑な生物学的メカニズムを調査するために特に有用です。ここでは、IVDのための病気のメカニズムや治療法を研究するための理想的なプラットフォームを提供し、全体腰椎マウスFSUsを培養するためのハイスループットアプローチを説明します。さらに、我々はSを記述する造影マイクロCTイメージングおよびIVDの三次元高解像度の有限要素モデリングを含む、さらなる研究を行うために、この器官培養法を利用everalアプリケーション。
Introduction
腰痛（LBP）は、職場での世界的な障害や生産性の損失のための主要な因子であり、そして一人のアメリカ人は、LBP処理1に500億ドルを超えると過ごします。流行が、LBPの病因は複雑かつ多因子のまま。しかし、椎間板（IVD）の変性は、LBP 2のための最も重要な危険因子の一つです。
外側線維輪（AF）、内部の髄核（NP）、及び近位および遠位3全体構造を挟む2つの軟骨終板：IVDは、三の微細構造で形成されています。加齢および変性に、IVD成分は、組成、構造的変化、および機械4。これらの変化は、NPにおけるプロテオグリカン及び水和の損失を含む、椎間板の高さを減少し、機械能力5を悪化。これらの変化はあります多くの場合、炎症反応だけでなく、LBP症状6につながる事象のカスケードで最高潮に達する関節腔への好中球および後根神経節の侵入を促進するサイトカインを伴います。
腰痛の発生前に、変性の原因を特定できないことが多いので、IVD変性のメカニズムを研究することは、ヒトでの挑戦です。このように、IVDの臓器まで実験システムを簡素化するの還元主義的アプローチは因果変数のメカニズムの微調整を可能にし、その下流効果5を調べます。システムは、このようにIVDの変性に対する外部刺激の影響の直接的な解釈を可能にする、唯一のネイティブ細胞集団と細胞外マトリックスを周囲に縮小されます。また、低コスト及びマウスモデルのスケーラビリティ、ならびに遺伝子改変動物7の多数は、Tを可能にします彼IVD変性のメカニズムと潜在的な治療法の迅速な目標スクリーニング。ここでは、IVD細胞および組織安定性たIVD、恒常的、機械的、構造的、および炎症性パターンに与えられる特定の焦点で、21日間にわたって維持されたマウス器官培養系を記載しています。この方法を使用して、我々は、椎間板変性の背後にあるメカニズムを理解するために刺し誘発性損傷モデル8でしたIVD機能の変更を監視します。さらに、我々は造影マイクロCTイメージングおよびIVDの三次元高解像度モデリングを含むさらなる研究を行うために、この器官培養法のいくつかのアプリケーションを記載しています。
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Protocol
全ての動物実験は、セントルイス動物実験委員会のワシントン大学を遵守して行われました。
1.動物
- 2系統のマウスを得る：10週齢のBALB / c（N = 6、BALB-M、BALB / cAnNTac）及び10週齢の核因子カッパBルシフェラーゼレポーター動物（NF-κβ-LUC）の上に飼育BALB / cバックグラウンド（N = 6、BALB / C-TG（RELA-LUC）31Xen）。
- 解剖前に、時間を住居の追加の2分間、続いて5分間2.5-3リットル/分の流量でCO 2過剰投与して動物を安楽死させます。
- 解剖前に2分間70％エタノール浴中に浸すことによって、動物の外側の領域を消毒します。
2.解剖
- 体腔を露出させるために小さな切開鋏を用いてマウスの背側表面に縦方向の垂直カットを行います。
- から始まる動物の背骨の両側に二つの長手方向の垂直カットを作ります尾椎骨（C8）への最初の腰椎（L1）。
- メス、細かい鉗子、細かい解剖ハサミを使用して、慎重に動物の体腔からL1-C8から背骨を取り除きます。
- こすり又は腹側のIVDを傷つけないように確保しながら慎重に、脊柱を取り囲む過剰軟組織を除去します。
- さらに、L1 / L2、L3 / L4、L5 / L6、C3 / C4、C5 / C6、およびC7 / C8ディスクにおける椎骨ディスク、脊椎の機能的脊椎ユニット（FSUs）に脊柱を解剖。
- 1％2分間ペニシリン - ストレプトマイシンを補充したハンクス平衡塩溶液中FSUsをすすぎます。
- 無培養および未処理FSUs（フレッシュ）、培養されたが、未処理FSUs（コントロール）、および培養し、スタブ処理しFSUs（スタブ）：ランダムに三つのグループにFSUsを割り当てます。
- スナップは、直ちに-20℃の冷凍庫に解剖して格納した後、液体窒素で新鮮FSUサンプルを凍結します。
3.器官培養条件
- 無菌の培養培地の500ミリリットルを調製1：1ダルベッコ改変イーグル培地：栄養混合F12：20％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充した（DMEM F12）。
- 24ウェル培養プレートの各ウェルに、10mLの血清学的ピペット、ピペット培地の2ミリリットルを使用。
- 解剖以下と媒体が充填された24ウェルプレートの個々のウェルに各FSUを配置し、すすぎます。
- 37°C、5％CO 2、20％O 2及び> 90％の湿度を維持する滅菌インキュベーター中でサンプルをインキュベートします。
- 図1Aに示すように、24時間の初期培養期間後、機械的に無菌の27ゲージ針を使用して、線維輪の針穿刺を介してスタブ群サンプルを傷つけます。
- 新しい使用滅菌ピンセットに古いプレートから新しい媒体が充填された24ウェル培養プレートを調製することにより、メディアごとに48時間を変更し、転送サンプル。古いメディアとdisposを吸引バイオハザード廃棄物ビンの古い培養プレートの電子。
- 培養の最後の日に、24時間0.75 mg / mlとニトロブルーテトラゾリウムクロリドを含む培地中ですべてのサンプルをインキュベートします。
- その後、機械的試験または組織学的検査（ 図1B）の準備ができるまで-20℃のフリーザー中の液体窒素とストアとすべてFSUs凍結。
4.縦測定NF-κB
- NF-κBの発現を評価するための1、5、13、および19日目NF-κβルシフェラーゼ動物からの画像FSUs。
- 各ウェルに1mg / mlのルシフェリン溶液10μLを添加し、37℃で10分間滅菌したインキュベーター中でインキュベートします。
- 画像1分間の露光時間と2のビンの設定と画像化システムを使用して生物発光用のサンプル。
- 同時に、写真を撮るとIVDに発光の解剖学的位置を決定するために、生物発光画像とをオーバーレイする機械を使用します。
- 変位制御動的圧縮9を用いてたIVDの機械的挙動を決定します。
- 解剖顕微鏡、メス、ピンセットを使用して、無傷の軟骨終板を維持しながら、各試料からFSUの骨の椎体を除去し、IVDに取り付けられました。
- シアノアクリレート接着剤を使用して1センチメートルX 1センチメートルX 0.2cmのアルミニウム板に単離されたIVDを取り付けます。
- レーザーマイクロメータを使用して、各ディスクの縦軸に3回の測定の平均を取ることによって、椎間板の高さと幅を測定します。最大ディスク幅で平均椎間板の高さを分割することにより椎間板の高さの比を計算します。
- 機械的試験に使用される入力歪み値を計算するために測定された椎間板の高さを使用してください。平均的な椎間板の高さは約690ミクロン±39μmであったことに留意されたいです。
- compressiの下でリン酸緩衝生理食塩浴にサンプルを置き、マシン上と0.02 Nにディスクをプリロード
- 周期的に3つの試験それぞれ20 1％の歪みレベルでのサイクルおよび5％の歪みレベルに対して1 Hzでの正弦波形を使用してディスクを圧縮し、IVDの荷重と変位値を記録します。リラックスして、けがを防止するために、ディスクの臨床試験の間の時間を休憩の10分を許可します。
- 最後のサイクルのローディング相から平均剛性を計算し、荷重と変位データとの間の位相角の正接を計算します。
6.プロテオグリカンとコラーゲンの定量化
- 機械的試験に続いて、プレ風袋遠心管に、単離されたIVDを配置し、化学天秤を用いて重量を測定することにより、ディスク湿重量を測定します。
- ブロックヒーターを用いて65℃で一晩250μLで単離されたIVDパパイン消化溶液（0.1 M酢酸ナトリウム、0.01 M EDTA、0.005 MシステインHClを、pHが6.4）を消化します。
- 10分間の遠心分離サンプル2,000×gで、上澄み液を集めます。
- コンドロイチン硫酸標準とジメチルメチレンブルー（DMMB）アッセイを使用して、IVDのプロテオグリカン含有量を測定します。
- DMMB溶液（21 mgのDMMB、5mLの無水エタノールを、1 LのddH 2 O中に2gのギ酸ナトリウム）を準備。
- 各ウェル中のDMMB溶液の250μLと一緒に96ウェルプレートに三重で標準および試料のピペット30μL、。
- 分光光度計を用いて525 nmでプレートの吸光度を読みます。
- 製造者の指示に従ってヒドロキシプロリンアッセイキットを使用してコラーゲン含有量を測定します。
7.組織学
- 24時間、4％パラホルムアルデヒド中でサンプルのサブセットを修正し、48時間、5％ギ酸中で脱石灰化、エタノールで脱水し、パラフィンに埋め込みます。
- 矢状10μmの厚さでセクション、サンプルをミクロトームを用いて、ガラススライドに切片を適用します。サフラニンO /ファストGrとを使用してセクションを染色EENおよびDAPI。
- 光学顕微鏡を使用して、画像は10倍の倍率でスライドします。
8.造影microComputed断層撮影（マイクロCT）
- 7日の時点で縦イオベルソールコントラスト増強10、及び末端リンモリブデン酸（PMA）、コントラスト強調を用いて0、2、5、及び7日の時点でサンプルのサブセットをスキャンします。
- 前マイクロCTスキャン時間〜4時間、約50ミリグラム/ mLのヨウ素含有イオベルソール溶液の最終濃度のために培地に350 mg / mlとヨウ素イオベルソール溶液の300μLを添加し、4 37℃で滅菌インキュベーター中でインキュベート時間。
- インキュベーション後、1 mlのマイクロ遠心チューブに滅菌ガーゼと場所でサンプルを包みます。
- マイクロCTシステム内の場所のサンプルと45 keVp、177μA、10.5μmのボクセルサイズ、および300ミリ秒の積分でスキャンします。
- エクスポートDICOMファイルなどのマイクロCTからのデータやソフトウェアを使用して可視化します（
- 7日の時点で、3日間、5％のPMA溶液、続いて24時間、4％パラホルムアルデヒド溶液を用いて試料を固定し、そして工程8.4で使用したものと同じ設定を使用してスキャンします。
9.三次元有限要素モデリング
- セグメントマニュアルしきい値（ 例えば 、OsiriXの）でソフトウェアを使用したIVDのDICOMファイル。
- IVDのNPとAFボリュームはMeshlabを使用して、ボクセルベースの有限要素メッシュに変換します。
- 完全なIVDを形成し、有限要素ソフトウェアで実験的に決定された境界条件を適用するためにNPとAFの微細構造を組み合わせます。
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Representative Results
図2-3は、培養マウスたIVD用プロテオグリカン分布、NF-κBの発現、剛性、粘性、椎間板の高さ、及び湿重量の代表的な結果を示します。適切に培養した場合は、コントロール群のIVDパラメータは、新鮮なグループと有意差があってはなりません。培養物が感染または他の方法で侵害された場合、対照群には、（結果は示さず）、特にNF-κBの発現およびプロテオグリカン分布は、新鮮な基とは異なるであろう。 IVDの三次元モデルを得るために、造影マイクロCTを使用して器官培養の4-5表示アプリケーションを図 。さらに、有限要素モデリングは、グローバルな機械的挙動に起因する組織の応力とひずみ分布を決定するために、これらの構造にも適用することができます。
図1.実験概要。 （A）椎間板機能脊椎ユニット（FSUs）腰椎及び尾側セグメントから切除しました。 FSUsは、2個の無傷椎骨、軟骨終板や椎間板が含まれていました。解剖後（B）、サンプルを21日間インビトロでの処置群に分け、培養しました。試料の別のサブセットは、組織学的分析のために使用したが、その後、サンプルのサブセットは、機械的試験および生化学的アッセイに使用しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.組織学およびNF-κBの発現を示します。 （A）培養21日後、サフラニンO染色（赤色）プロテオグリカン含量が維持されることを示しています対照試料におけるAFおよびNPの両方です。 （B）刺しサンプル（矢印穿刺部位）は、AF及びNPの両方においてプロテオグリカン含量の減少を示しました。 （C）テトラゾリウムブルー染色（青色）は、共局在を示します。 （D）DAPI染色は、細胞が代謝活性および器官培養21日後に生存可能であることを示しています。両方の制御と刺し試料中の（E）NF-κBの発現もIVDが生存し、その環境に応答することを示しています。スタブサンプルは1、5、13でNF-κBの発現を増加させ、そして19日の時点ました。腰椎したIVDは、ここに表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
3.力学及び組成を図。 （
図4.造影マイクロCT visualizatイオン。造影マイクロCTは、培養期間中に3次元でIVDを視覚化するために使用することができます。尾したIVDは、ここに表示されます。 AFにイオベルソール（低い減衰）およびNP（高い減衰）の結合差動つNPからAFを区別することを可能にします。逆に、PMAが優先AF（高い減衰）、終板、および脊索中のコラーゲン残基に結合します。画像は白黄色媒体減衰を表し、高い減衰を表すように色を用いて可視化し、そして赤色は低減衰を表します。 （A - E）サジタル0日におけるIVDの景色、2、5、及び7イオベルソールのコントラスト、およびPMAコントラストを有します。 （F - J）横日0、2、5でIVDのビュー、及びイオベルソールコントラスト6、およびPMAコントラストを有します。尾したIVDは、ここに表示されます。 ラを表示するには、こちらをクリックしてください。この図のrgerバージョン。
IVDの構造の図5有限要素モデリング（FEM）。 FEM解析では、より大きな境界条件に地元の材料応答の計算を可能にする強力な数学的なツールです。例えば、（A）NPは、（B）AFとは別個にレンダリングすることができ、各区画は、固有の構成プロパティを割り当てることができます。 AFおよびNPの両方と（C）を合わせIVDの構造が3Dに示されています。アキシアル荷重は下位終板と優れた終板上のディスクに適用されるとき、固定端であり、我々は、応力とひずみの局所濃度を決定することができます。イエロードットと黒の矢印が適用されるノードの負荷を表します。 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。
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Discussion
このプロトコルは、IVDにおける生物学的変化を監視することに重点を置いて、マウスFSUの器官培養の概要を説明します。これらの培養の成功メンテナンスは慎重な無菌技術を必要とします。具体的には、切開は、2.1から2.6ステップと培養物を3.1から3.6の無菌状態が維持されることを保証するために特別な注意を必要とするステップ、及びこれらの手順は、汚染物質を最小限に抑えるためにHEPA空気流を有する単離された手術室で、好ましくは行われるべきです。解剖プロセスが組織に外傷を引き起こすため、3.5で24時間プレコンディショニング期間は、コントロールを含む全処置群に必要とされます。生存性アッセイは、サンプルは生きて汚染されていないことを確認し、また、細胞の恒常性が維持されていることを確認としての役割を果たすために使用することができます。 NF-κBの発光の読みは、長手方向培養FSUsの炎症応答をモニターするためにも使用することができます。 NF-κB急行の増加FSUsを示す可能性が培養中のイオンは、汚染あるいは感染11からのストレス下で、私たちは、このように可能なトラブルシューティングの手順として、ここではそれが含まれています。最後に、新鮮なグループとの比較は、組織学的および機械的性能がコントロール培養したサンプルのための追加のチェックポイントとして機能します。この培養技術は、プレートごとに複数のサンプルに適しており、我々の経験では、24ウェルプレート上の最大24個のサンプルが容易に達成することができます。しかしながら、試料の多重化はまた、交差汚染のリスクを伝播し、したがって、FSUsトラブルシューティング中に別々のプレート上で培養することが推奨されます。このプロトコルは、21日の培養期間の指示を提供しながら、また、同じ方法は、より長いまたは短い培養期間のために使用することができます。 FSUsが正常に1週間から5週間までの培養期間のために私たちの研究室で培養されています。
LIKEすべてのモデル、マウスにおける器官培養モデルは、特にヒトの負荷条件を捕獲する能力が、制限があります。そこマウスおよびヒトしたIVD 12との間に幾何学の微妙な違いもあり、ラットとマウスは四足ありながら、人間は脊椎上、主に軸方向荷重との二足歩行しています。培養条件は比較的に現在の形にアンロードされるので、積載モードがしたIVDに影響を与えていない可能性があります。ウシIVD器官培養モデル13のような他のシステム 14は、機械的なローディングの相互作用に適してもよいです。今後の課題は、機械的および環境的要因の間mechanobiologicalの相互作用の調査を可能にするために、荷重条件を組み込む予定。このアプローチのパワーは、高解像度イメージング用の整合性、汎用性、および能力にあります。ここでの我々のアプローチは、それが文化bに可能であることを示していますOTH腰椎及び尾したIVDが、これらのディスクは、高齢化と開発15間で解剖学的に異なっていることに注意することが重要です。そのように、私たちの実験デザインは腰椎と個別に尾側レベルをランダム化します。
造影マイクロCT IVDの高解像度、非破壊、三次元撮像を可能にします。別の造影剤は、IVDの異なる組成の側面を強調するために使用することができます。ここではイオベルソール、ヨウ素含有非細胞毒性親水性物質10、及びリンモリブデン酸（PMA）、コラーゲンのアミノ酸残基にキレート重金属分子の使用を実証します。これらのコントラストの薬剤を使用して、IVDにおける微細構造の特徴を強調表示し、識別することができます。イオベルソール、それによって水が豊富な髄核少ない水和線維輪の間のコントラストを提供する、IVD組織の相対的水和を区別する。PMAは、組織中の相対的コラーゲン組成物の差別化を提供し、エンドプレート、線維輪、および脊索を強調表示します。 PMAは、コラーゲンの変化を監視するために、培養の終点でIVDに適用することができるがイオベルソールは、水和の縦の変化を決定するために、培養中に使用することができます。
この技術の将来のアプリケーションは、他の疾患におけるIVD変性のさまざまな側面を理解するためにトランスジェニックやノックアウトマウスの他の系統を利用しています。さらに、そのようなIVDの変性に寄与することができる相互作用を同定するために後根神経節のような他の器官系と細胞との共培養のための潜在的なプラットフォームです。
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Disclosures
この原稿の著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、ワシントン大学の筋骨格系研究センター（NIHのP30のAR057235）、分子イメージングセンター（NIHのP50のCA094056）、メカノトレーニンググラント（NIH 5T32EB018266）、NIH R21AR069804、およびNIH K01AR069116によってサポートされていました。著者は、データ収集の彼の貢献のためのパトリック・ウォン感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 mL pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 mL pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 mL pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 mL bottle top filters, 22 µm | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 µL pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 µL pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1,000 µL pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM/F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab - ISTI - CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors - Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors - Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades - #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins, size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27 G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
References
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