Abstract
Detta manuskript beskriver ett protokoll för att detektera transkriptionstermineringsdefekt in vivo. Den strängspecifik TRO-protokollet med hjälp BrUTP beskrivs här är en kraftfull experimentell metod för att analysera transkriptionstermine defekten under fysiologiska betingelser. Liksom traditionella TRO analysen förlitar sig på närvaron av en transkriptionellt aktivt polymeras bortom 3'-änden av genen som en indikator på en transkriptionstermineringsdefekt en. Det övervinner två större problem som uppstått med den traditionella TRO analysen. För det första kan man upptäcka om polymeraset läsa igenom avslutningssignalen är den som initierade transkription från promotor proximala området, eller om det helt enkelt representerar en pervasively transkribera polymeras som initierade ospecifikt från någonstans i kroppen eller 3 ' änden av genen. För det andra kan det skilja om transkription aktiva polymeras signal bortomterminatorregion är verkligen den genomläsning avkänning mRNA transkribera polymeras eller en terminator initierad icke-kodande antisens-RNA-signalen. I korthet involverar protokollet permeabilisering de exponentiellt växande jästceller, vilket gör att transkripten som initierade in vivo för att långsträckt i närvaro av BrUTP nukleotid, rening BrUTP-märkt RNA genom affinitetstillvägagångssättet, omvänd transkribering av renade nascent RNA och amplifiering av cDNA med användning av strängspecifika primrar som flankerar promotorn och terminatorn regioner av genen 2.
Introduction
Den eukaryota transkriptions cykel består av tre stora steg; initiering, förlängning och uppsägning. Terminering av transkription av RNA-polymeras II består av två skilda, ömsesidigt beroende steg 3. Det första steget innebär klyvning, polyadenylering och frisättning av mRNA från templatet, och följs omedelbart av det andra steget, präglad av urkoppling av polymeras från mallen. Rätt terminering är avgörande för återvinning av polymeraset under inledande / förnyad initiering av transkription, för att förhindra störningar med transkriptionen av nedströms gener, och för att hålla avvikande transkription i schack genom att begränsa transkription av genomgripande icke-kodande RNA 4, 5. Trots den senaste tidens framsteg, är uppsägning i särklass minst förstådda steget i RNA-polymeras II transkription cykel. En tillförlitlig termine analys är nödvändig för att studera mekanismen underlying terminering av transkription av RNA-polymeras II in vivo.
Ett antal experimentella metoder används för att detektera avslutningen defekt i en aktivt transkribera genen under fysiologiska förhållanden. Dessa inkluderar Northern blot, termineringsfaktor chip (Kromatin Immunoprecipitation) och den traditionella TRO analysen. Var och en av dessa tekniker har vissa fördelar och nackdelar. Den traditionella TRO-analysen används för att vara den mest tillförlitliga och känsliga tillvägagångssätt för detektion av en transkriptionstermineringsdefekt in vivo 1. Denna analys lokaliserar de transkriptionellt aktiva polymerasmolekyler på olika regioner av en gen inuti cellen. Under normala förhållanden, visar analysen transkriptionellt engagerade polymerasmolekyler strikt fördelade mellan promotorn och terminatorregionen av genen (Figur 1A). Vid defekt uppsägning är dock inte läsa avslutningssignalen polymerasoch detekteras i regionen nedströms om 3'-änden av genen (Figur 1B).
En transkriptionstermineringsdefekt manifesteras i närvaro av en känsla-transkribera polymeras som initieras från promotorn-proximala området, och att inte kunna läsa termineringssignal, fortsätter transkribera regionen nedströms om 3'-änden av en gen som visas i figur 2A. Med insikten om att den eukaryota genomet uppvisar överväldigande genomträngande transkription i bemärkelse samt anti-sense riktningar i och runt en gen 6, 7, 8, 9, 10, blev det snart klart att den traditionella TRO analysen inte kan upptäcka om polymerassignalen nedströms av en gen betecknar en promotor initierad transkriptet (figur 2A) eller en avvikande RNA som initierade asewhere i mitten av genen eller nedströms om terminatorelementet (figur 2B), eller polymeraset transkribera i anti-sense-riktning från 3'-änden av genen (figur 2C). Den strängspecifik TRO analys med användning BrUTP beskrivs här kan särskilja om den observerade genomläsning polymeras signalen representerar promotor initierad förlängningen mRNA eller en antisenstranskript som initieras nedströms om genen som undersöks. Vi har framgångsrikt använt denna metod för att påvisa betydelsen av Kin28 kinas i terminering av transkription i knoppande jäst 2. Med användning av tillvägagångssättet här visar vi att Rna14 krävs för terminering av transkription av ASC1 i knoppande jäst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Denna metod användes i forskningen artikeln redovisas i Medler, S och Ansari, A. 2.
1. Odling och skörd av cellerna
- Starta en ml kultur av celler i YPD-medium (10 g / L jästextrakt, 20 g / L pepton, 2% dextros) 5 från en nyligen strimmig Saccharomyces cerevisiae platta.
- Odla cellerna över natten i en orbital skakanordning vid 30 ° C och 250 rpm.
- Späd över natten tillväxta kulturen 100 gånger till en slutlig volym av 100 ml i YPD-medium i en 250-ml bafflad kolv.
OBS: Det behövs en totalt 100 ml kultur per TRO reaktion; om flera reaktioner behövs måste en större volym odlings användas. - Odla cellerna till en optisk densitet av 0,8-1,0 vid 600 nm (A 600 ~ 0,8-1,0).
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 820 xg under 5 min vid 4 ° C i en steril 50 ml koniska rör.
- Resuspendera cellerna i 10 ml iskall TMN buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl) och inkubera på is i 5 min.
- Centrifugera vid 820 xg under 5 min vid 4 ° C för att pelletera cellerna. Ta försiktigt bort supernatanten genom aspiration.
2. permeabilisering och förbereda celler för Run-på analys
- Resuspendera cellerna i 1 ml 0,6% sarkosyl lösning genom att pipettera upp och ner försiktigt med hjälp av en stympad P 1000 spets. Överför cellsuspensionen till en kyld 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Skaka cellerna försiktigt vid 4 ° C under 25 min på en plattform shaker.
OBS: Mikrocentrifugrör ska packas in i en 50 ml koniska rör med is för att hålla en låg temperatur, att undvika risken för eventuella nya initiering händelser på promotorn i detta skede. - Centrifugera cellerna vid 1200 xg under 6 min vid 4 ° C med användning av en bordsskiva kyld centrifug.
- aspirera försiktigt supernatanten för att avlägsna eventuellt överskott av vätska från permeabilized cellpelleten.
3. Transkription Run-on Reaktion
- Lägga 150 mikroliter av transkriptions run-on-buffert (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT (ditiotreitol), 0,75 mM vardera av ATP, CTP, GTP och BrUTP, 200 U RNas hämmare) till permeabiliserad cellpelleten.
- Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned med hjälp av en stympad P 200 spets.
OBS: Om bearbetning av flera prover, hålla allt på is tills alla prover är redo och sedan gå vidare till nästa steg. - Inkubera under 5 min vid 30 ° C i ett vattenbad.
OBS: Ställ in tiden för inkubation mellan 1 till 5 minuter för att säkerställa optimal inkorporering av BrUTP i den framväxande RNA. - Stoppa reaktionen genom tillsats av 500 mikroliter av kall redo att använda RNA-isoleringsreagens. Inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
4. RNA-extraktion
- Tillsätt 200 | il av syratvättade glaspärlor till cell suspensi(steg 3,4), och skaka kraftigt i 20 minuter vid 4 ° C i en virvelblandare.
- Punktering botten av mikrocentrifugrör med hjälp av en varm 22 G-nål och placera den på toppen av en 15-ml sterila koniska rör.
- Centrifugera vid 300 xg under 1 min vid 4 ° C för uppsamling av cellysatet. Överföra cellysatet till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 500 | il kall RNA isoleringsreagens och 200 pl kloroform till cellysatet. Blanda innehållet på en virvelblandare och centrifugera vid 16.168 xg under 20 min vid 4 ° C.
- Överför den övre vattenhaltiga fasen till ett nytt mikrocentrifugrör.
- Tillsätt en lika volym kallt fenol / kloroform / isoamylalkohol (125: 24: 1) pH 4-5. Skaka kraftigt i en virvelblandare och centrifugera vid 16.168 xg under 15 min vid 4 ° C.
- Överför den övre vattenhaltiga fasen innehållande RNA i ett annat mikrocentrifugrör. Upprepa steg 4,6 ytterligare två gånger.
- Till den slutliga RNA-innehållande vattenfasen, tillsätt 5 M NaCl stock för att få en slutlig koncentration av 0,3 M. Tillsätt 3 gånger volymen av kall etanol för att fälla ut RNA.
- Inkubera under 1 h eller över natten vid -20 ° C.
OBS: Utför steg 4,9 - 4.11 medan anti-BrdU pärlor inkuberas för blockering (se steg 5,3).
- Inkubera under 1 h eller över natten vid -20 ° C.
- Centrifugera vid 16.168 xg under 20 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och resuspendera RNA pelleten i 100 mikroliter av DEPC (dietylpyrokarbonat) vatten.
- Använd en RNA isolering mini kit för att separera RNA från icke införlivade BrUTP nukleotider. Eluera RNA från kolonnen med 100 pl av RNas-fritt vatten.
- Inkubera RNA i ett 65 ° C vattenbad under 5 min och sedan överföra till is i minst 2 min.
5. Affinitetsrening av BrUTP-märkt RNA
- Till 25 mikroliter av anti-BrdU fast pärlor, tillsätt 500 mikroliter av 0,25 x SSPE (Sodium Saline fosfat EDTA) bindningsbuffert (20x SSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH 2 PO 4
- Upprepa steg 5,1 tre gånger.
- Tillsätt 500 mikroliter av blockeringsbuffert (1x bindningsbuffert, 0,1% polyvinylpyrrolidon, 1 mg ultrarent bovint serumalbumin (BSA)) till pärlorna och skaka försiktigt under 1 - 2 h vid 4 ° C på en plattformskakare.
- Tvätta pärlorna ytterligare två gånger med 500 mikroliter av bindande buffert, såsom beskrivs i steg 5,1.
- Tillsätt 400 pl bindningsbuffert till pärlorna.
- Överföra 100 mikroliter av RNA (från steg 4,11) direkt till pärlorna. Inkubera med försiktig skakning under 1 - 2 timmar vid 4 ° C på en plattformskakare.
- Tvätta pärlor tur och ordning med 500 mikroliter av bindande buffert, 500 | il av buffert med låg salthalt (0,2 X SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween), 500 mikroliter av buffert med hög salthalt (0,25 x SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 100 mM NaCl), och två gånger med 500 mikroliter av tet-buffert (1 x TE, 0,05% Tween), spinning vid200 xg under 30 s vid 4 ° C i mellan varje tvätt.
- Eluera BrUTP-märkt RNA från pärlorna sekventiellt, två gånger med 150 | j, l och en gång med 200 pl elueringsbuffert (20 mM DTT, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS), genom inkubering under 4 min vid 42 ° C i ett vattenbad, följt av en kort centrifugering för att separera pärlor från supernatanten.
6. Utfällning av BrUTP märkt RNA
- Tillsätt 500 | il kall fenol / kloroform / isoamylalkohol (125: 24: 1) pH 4-5 till affinitetsrenade BrUTP märkt RNA. Blanda i en virvelblandare och centrifugera vid 16.168 xg under 15 min vid 4 ° C.
- Överför den övre vattenhaltiga fasen till ett nytt mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 5 M NaCl lager för att få en slutlig koncentration av 0,3 M och 3 gånger volymen av kall etanol för att fälla ut RNA.
- Inkubera vid -20 ° C över natten.
- Samla den utfällda RNA genom centrifugering vid 16.168 xg under 30 min vid 4 ° C. </ Li>
- Avlägsna supernatanten och låt pelleten lufttorka i 10 min.
- Resuspendera RNA-pelleten i 26 | il DEPC vatten.
- Bestämma den slutliga RNA-koncentration genom mätning av absorbansen vid 260 nm med användning av en spektrofotometer. Också, fastställa vilken 260/280 förhållandet. Ett förhållande ~ 2 är indikativt för ett rent RNA-prov.
- Lagra de RNA-prover i alikvoter vid -80 ° C tills det behövs för cDNA-syntes.
7. Omvänd transkription av BrUTP-märkt RNA
- Justera RNA-koncentrationen till 100 ng / l med hjälp av DEPC vatten. Använd 0,5 mikrogram av RNA för varje cDNA syntesreaktionen.
OBS: Koncentrationen av RNA-mallen kan variera från 0,5 till 1,0 | j, g för att uppnå optimal cDNA-syntes. - Omvänt transkribera RNA med användning av multipla omvända primrar utformade nedströms om poly (A) -ställe (termineringsställe) såsom visas i figur 3A.
- Till varje omvänd transkriptionsreaktion, tillsätt 5 l RNA Template (0,5 ^ g), 1 mikroliter dNTP-blandning (10 mM vardera), 2 | il av omvänd primer C, D, E, F eller G (50 ^ M av varje) (se figur 3A) och sterilt vatten. Den slutliga reaktionsvolymen i varje rör är 13 mikroliter.
OBS: Antalet omvända transkriptionsreaktioner kommer att bero på antalet omvända primers som användes för cDNA-syntes. Till exempel, för ASC1 fem omvända primrar användes och därför fem omvända transkriptionsreaktioner sattes upp. Märk rören som C, D, E, F och G på grundval av den omvända primern som användes för cDNA-syntes. - Inkubera rören som innehåller RNA-mallen, dNTP-blandning och primrar i en termocykler vid 65 ° C under 5 minuter för att avlägsna eventuella sekundära strukturella konformationen, och kyl sedan till 4 ° C under åtminstone 2 min.
- Tillsätt 1 mikroliter omvänt transkriptas (200 U / l), 4 mikroliter buffert och 2 mikroliter av 0,1 M DTT till varje rör innehållande RNA-mallen och primer (steg 7,4). Blanda genom att pipettera försiktigt upp och ned.
- Utföra omvänd transkription genom att inkubera reaktionsblandningen i en termocykler vid 42 ° C under 60 min.
- Inaktivera det omvända transkriptaset vid 65 ° C under 20 min.
- Förvara cDNA vid -20 ° C eller gå vidare till nästa steg.
8. Amplifiering av cDNA
- Utföra PCR-reaktionen för amplifiering av varje cDNA-framställning (märkt C, D, E, F och G för ASC1) från steg 7,8 enligt följande: 3,0 | il cDNA-mall från steg 7,8, 1,0 mikroliter framåtriktad primer B (10 pM), 1,0 | il omvänd primer C eller D eller E eller F eller G (10 M), 2,5 mikroliter 10x polymeras PCR-buffert, 0,5 pl dNTP-blandning (10 mM vardera), 1,0 mikroliter MgCl2 (2,5 mM), 15,5 mikroliter PCR-kvalitet vatten, och 0,5 pl termostabilt polymerasenzym.
OBS: Olika spädningar av cDNA-templat som sträcker sig från 1: 5 till 1: 100 bör testas för att optimera PCR-produktutbytet. En enda promotor-proximala framåt primer kommer att användas för att förstärka cDNAerhölls med användning av olika omvända primersekvenser. Till exempel, var en enda framåtriktad primer B som ligger nära promotorn används i kombination med fem omvända primrar från C till G för ASC1. BC, BD, BE, BF och BG användes i rör märkta som C, D, E, F och G respektive såsom visas i fig 3A. - Kör PCR med användning av följande termocykelparametrar: 1 cykel 95 ° C under 2 min (varmstart för aktivering av polymeras), 30 - 40 cykler 95 ° C under 30 s (denaturering), 54 ° C under 15 s (glödgning) , 68 ° C under 1 min (förlängning), och en cykel 68 ° C under 5 min (slutlig förlängning).
OBS: glödgningstemperaturen kommer att variera beroende på de specifika primrar som används och förlängningstiden kommer att variera beroende på den förväntade produktstorleken. - Separera PCR-produkten genom elektrofores på 0,8%, 1,5% eller 2% agarosgeler, beroende på den förväntade storleken av produkten.
- Kvantifiera PCR-produkten som beskrivs i El Kaderi et al. , 2012 11.
OBS: Du kan även använda realtid RT-qPCR strategi för att kvantifiera mängden begynnande transkript.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera tillämpbarheten av BrUTP strängspecifik TRO förfarande vid detektion av en transkriptionstermineringsdefekt, använde vi en avgång defekt temperaturkänslig mutant av RNA14 kallas rna14-1. Rollen för Rna14 i terminering av transkription genom RNA-polymeras II demonstrerades med användning av den traditionella TRO assay som detekterades RNA i terminator-proximala området av utvalda gener 1. Detektion av RNA-signalen bortom terminatorregionen i rna14-1 mutanten vid den icke tillåtna temperaturen var tolkas som den termine defekten. Den observerade signalen, skulle emellertid kunna tillskrivas det pervasively transkribera polymeras som initierade transkription från någonstans nära 3'-änden av genen, såsom visas i figur 2B. För att slutgiltigt demonstrera roll Rna14 i uppsägning, utförde vi BrUTP strängspecifik TRO i rna14-1mutanten och den isogena vildtypstammen vid 37 ° C. Vi förväntade oss att i det vilda stammen, kommer TRO signalen begränsas mellan promotorn och terminator-områdena som visas i figur 1A. I rna14-1 mutanten kommer emellertid polymeraset läsa igenom avslutningssignalen och TRO signal kommer att detekteras bortom 3'-änden av genen, såsom visas i figur 1B och 2A.
I korthet växte vi rna14-1 mutanten och dess isogena vildtyp celler vid 25 ° C till mitten av log-fasen och sedan skiftas cellerna till 37 ° C under tre timmar. Transkriptions run-on analys utfördes för att införliva BrUTP i nascent RNA syntetiseras genom en aktivt transkriberar RNA-polymeras såsom beskrivits ovan. Den BrUTP märkta RNA renades och transkriberades omvänt med användning av primrar C, D, E, F, och G som visas i figur 3A. Motsvarande cDNA PCR-amplifierades using primerpar BC, BD, BE, BF och BG och fraktionerades på agarosgeler (fig 3B). Kvantifiering av geler visas i figur 3C. Närvaron av PCR-amplifierade produkter från primerparen BE, BF och BG i rna14-1 mutanten återspeglar en termine läsa igenom fenotypen (figur 3B, spår 11-13 och fig 3C, regioner E, F och G). I vildtypsceller var dock den TRO signalen begränsas till terminatorn elementet (figur 3B, spår 2 och 3, och fig 3C, regionerna C och D). Det fanns ingen detekterbar TRO signal bortom terminatorregionen (figur 3B, spår 4-6, och fig 3C, regioner E, F och G). Således kan vi upptäcka promotorinitierad begynnande transkript som läser igenom avslutningssignalen i mutanten men inte i vildtypceller, vilket bekräftar att Rna14 är en termineringsfaktor.
Figur 1: Transkription Run-on (TRO) analys detekterar närvaron av transkriptionellt aktiv RNA-polymeras i olika regioner av en gen. (A) När termine är normalt, det finns ingen polymerassignal bortom terminatorregionen. (B) Vid defekt terminering, är polymeraset inte kan läsa avslutningssignalen och kan detekteras bortom 3'-änden av genen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Strand specifik TRO analys. Strängen specifika TRO analys kan upptäcka om närvaron av en transkriptionellt aktivt polymeras bortom 3'-änden av than-genen är en sann terminedefekt på grund av en promotor initierad polymeras läsa igenom avslutningssignalen (A), eller det är helt enkelt en pervasively transkribera polymeras transkribera i sensriktning (B), eller så är antisens ncRNA transkribera polymeras initiera från 3'-änden (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Rna14 är en termineringsfaktor som polymeras Läser genom termineringssignalen i rna14-1 Mutant. (A) Schematisk återgivning av ASC1 genen som visar läget för den framåtriktade primern B och fem omvända primrar, C, D, E, F och G användes för cDNA-syntes av renat BrUTP-märkt RNA. (B) -cDNA tillverkad av omvända primers C, D, E, F och G var PCR-amplifierades med användning av primrarna paren BC, BD, BE, BF och BG respektive. (C) Den kvantitativa analysen av TRO data som visas i (b) ovan i vildtyp och rna14-1 celler vid 37 ° C. 5 S-RNA användes som normaliseringskontroll. Felgränserna representerar en hel enhet av standardavvikelsen baserad på ett minimum av tre försök. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Strängen specifika TRO protokoll som används här anpassades från protokollet som används för GRO-Seq (Global Run On-sekvensering) analys i däggdjursceller 12. Vi ändrade framgångsrikt protokoll för att studera begynnande transkription i knoppande jäst. För att specifikt analysera transkriptionstermineringsdefekt, justerat vi protokollet ytterligare genom att bli av RNA hydrolyssteget. Detta tillät oss att specifikt detektera fullängds begynnande transkript som initieras från transkriptionsstartstället i närheten av promotorregionen.
Det finns flera viktiga steg i det protokoll som ska utföras med största försiktighet för att få ett meningsfullt resultat. För det första måste protokollet utföras med exponentiellt växande jästceller. Cellerna i logfas (A 600 ~ 0,8-1,0) ger de bästa resultaten som majoriteten av celler i detta skede är aktivt växande och uppvisar robusta transkription. För det andra, RNA-isolering step ska utföras så snart som möjligt vid en temperatur mellan 2-4 ° C. För det tredje, före affinitetsrening av Br-UMP märkt RNA, unincorporated BrUTP bör tas bort från den RNA-preparation. Vi använde ett RNA-kit för att bli av BrUTP från det renade RNA-preparation. För det fjärde är avgörande för ett framgångsrikt genomförande av protokollet användningen av en robust omvänt transkriptas.
Den strängspecifik TRO protokoll som används här har fördelar jämfört med Northern blot-tekniken för att detektera avslutningen defekten som det är känsligare, snabbare och uppvisar högre upplösning. Detta protokoll är också bättre än den traditionella TRO protokollet eftersom det kan särskilja sinnestranskript från antisense-transkript och om den observerade resultat beror på att promotor initierad transkription eller avvikande transkription utgående från en nedströms region promotor. Strängen specifika TRO protokoll har vissa begränsningar. Det är mer arbetskrävande och tidskrävande än stadig ståt mRNA detekteringsteknik. Den kräver stort antal celler. Därför kan analysen av transkription av låga transkribera gener vara ett problem.
Vi har framgångsrikt använt denna teknik för att studera avslutande defekt i RNA-polymeras II transkription cykel i knoppande jäst 2. kan utökas det tillvägagångssätt att studera terminering av transkription av RNA-polymeras I och RNA-polymeras III i jäst samt. Med lämpliga modifieringar, kan också tillämpas den metod för att studera transkriptionstermine defekt i högre eukaryoter. Totalt sett är den teknik relativt billigt, mycket reproducerbar och kräver standardutrustning som används i ett molekylärbiologiskt laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
References
- Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
- Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription. Sci Rep. 5, 12586 (2015).
- Richard, P., Manley, J. L. Transcription termination by nuclear RNA polymerases. Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).
- Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).
- Porrua, O., Libri, D. Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).
- Jacquier, A. The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs. Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).
- Xu, Z., et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).
- Neil, H., et al. Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).
- Clark, M. B., et al.
- Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast. Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).
- El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C). Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
