Summary
В настоящей статье представлен технологический процесс высококонцентрированной микроскопии для одновременной количественной оценки внутриклеточных уровней ROS, а также потенциала и морфологии митохондриальной мембраны - совместно называемой морфофункциональной функцией митохондрий - в живых адгезивных клетках с использованием флуоресцентных репортерных молекул клеток 5- (и / 6) -хлорметил-2 ', 7'-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат, сложный ацетил (CM-H 2 DCFDA) и метиловый эфир тетраметилродамина (TMRM).
Abstract
Реактивные виды кислорода (ROS) регулируют основные клеточные процессы, включая экспрессию генов, миграцию, дифференцировку и пролиферацию. Однако чрезмерные уровни ROS вызывают состояние окислительного стресса, что сопровождается необратимым окислительным повреждением ДНК, липидов и белков. Таким образом, количественное определение ROS обеспечивает прямой прокси для состояния клеточного здоровья. Поскольку митохондрии входят в число основных клеточных источников и мишеней АФК, совместный анализ митохондриальной функции и продукции АФК в одних и тех же клетках имеет решающее значение для лучшего понимания взаимосвязи в патофизиологических условиях. Поэтому была разработана стратегия с высоким содержанием микроскопа для одновременной количественной оценки внутриклеточных уровней ROS, потенциала митохондриальной мембраны (ΔΨ m ) и морфологии митохондрий. Он основан на автоматизированной флуоресцентной флуоресцентной микроскопии и анализе изображений живых клеток, выращенных в многолуночных планшетах, и стеанеD с клеточно-проницаемыми флуоресцентными репортерными молекулами CM-H 2 DCFDA (ROS) и TMRM (ΔΨ m и митохондриальной морфологией). В отличие от флуориметрии или проточной цитометрии эта стратегия позволяет количественно определять субклеточные параметры на уровне отдельной клетки с высоким пространственно-временным разрешением, как до, так и после экспериментальной стимуляции. Важно отметить, что основанный на изображении характер метода позволяет экстрагировать морфологические параметры в дополнение к интенсивностям сигналов. Комбинированный набор функций используется для исследовательского и статистического многомерного анализа данных для выявления различий между субпопуляциями, типами клеток и / или обработками. Здесь приводится подробное описание анализа, а также примерный эксперимент, который доказывает его потенциал для однозначного различения между клеточными состояниями после химического возмущения.
Introduction
Концентрация внутриклеточных ROS тщательно регулируется посредством динамического взаимодействия между ROS-продуцированием и системами разжижения ROS. Дисбаланс между ними провоцирует состояние окислительного стресса. Среди основных источников ROS - митохондрии 1 . Учитывая их роль в клеточном дыхании, они отвечают за объем внутриклеточных молекул супероксида (O 2 • - ) 2 . Это в основном связано с утечкой электрона в O 2 в комплексе 1 цепи переноса электронов в условиях сильного отрицательного внутреннего мембранного потенциала митохондрий (Δψ m ), т.е. митохондриальной гиперполяризации. С другой стороны, митохондриальная деполяризация также коррелирует с увеличением продукции ROS, указывая на множественные способы действия 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Кроме того, с помощью окислительно-восстановительных модификаций в белках механизмов деления-слияния РОС совместно регулирует митохондриальную морфологию 9. Например, фрагментация коррелирует с повышением продукции АФК и апоптозом 10 , 11 , тогда как нитевидные митохондрии связаны с питательным голоданием и защитой от Митофагия 12 . Учитывая сложную взаимосвязь между клеточной АФК и морфофункциональной функцией митохондрий, в идеале их следует количественно определять одновременно в живых клетках. Для этого был разработан анализ изображений с высоким содержанием, основанный на автоматизированной широкополосной микроскопии и анализе изображений клеточных культур, окрашенных флуоресцентными зондами CM-H 2 DCFDA (ROS) и TMRM (митохондриальная Δψ m и морфология). Отображение с высоким содержанием относится к извлечению sp(То есть , большое количество описательных признаков) информацию о клеточных фенотипах с использованием множественных комплементарных маркеров и автоматизированный анализ изображений. В сочетании с автоматизированной микроскопией многие образцы можно скринировать параллельно ( т.е. с высокой пропускной способностью), тем самым увеличивая статистическую мощность анализа. В самом деле, основным преимуществом протокола является то, что он позволяет одновременно количественно определять несколько параметров в одной и той же ячейке, и это для большого количества ячеек и условий.
Протокол разделен на 8 частей (подробно описанных в протоколе ниже): 1) Посеяющие клетки в 96-луночном планшете; 2) приготовление исходных растворов, рабочих растворов и буфера для визуализации; 3) Настройка микроскопа; 4) загрузка клеток DCFDA и TMRM CM-H 2 ; 5) Первая визуализация в реальном времени для измерения базальных уровней ROS и митохондриальной морфофункциональности; 6) Второе изображение в реальном времени после добавления трет -бутилПероксид (TBHP) для измерения индуцированных уровней ROS; 7) Автоматизированный анализ изображений; 8) Анализ данных, контроль качества и визуализация.
Этот анализ был первоначально разработан для нормальных человеческих дермальных фибробластов (NHDF). Так как эти клетки большие и плоские, они хорошо подходят для оценки морфологии митохондрий в двумерных широкопольных изображениях 13 , 14 . Однако, с небольшими изменениями, этот метод применим к другим типам адгезивных клеток. Кроме того, рядом с комбинацией DCFDA CM-H 2 и TMRM рабочий процесс соответствует множеству пар флуоресцентных красителей с различными молекулярными особенностями 1 , 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ниже описывается протокол, который выполняется для ячеек NHDF и с использованием многолуночных планшетов, указанных в файле материалов. См . Рисунок 1 для общего обзора рабочего процесса.
1. Приготовление реагентов
- Подготовить полную среду путем добавления модифицированной по Дульбекко среды Игла (DMEM) 10% об. / Об. Фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 100 МЕ / мл пенициллина и 100 МЕ / мл стрептомицина (PS). Для 500 мл полной среды добавьте 50 мл FBS и 5 мл PS к 445 мл DMEM.
- Подготовка буфера для визуализации HBSS-HEPES (HH) путем добавления сбалансированного солевого раствора Хэнкса (с магнием и кальцием, но без фенолового красного) с 20 мМ HEPES. Для 500 мл HH добавьте 10 мл 1M раствора HEPES в 490 мл HBSS. Проверьте рН и, при необходимости, доведите рН до 7.2.
- Готовят 1 мМ маточный раствор DCFDA CM-H 2 путем растворения 50 мкг лиофилизированного порошка DC-DC CM-H 2 в 86,5 мл# 181; L безводный ДМСО. Смешайте путем вортекса или пипетирования вверх и вниз и сделайте 20 мкл аликвот в коричневых микроцентрифужных пробирках. Хранить в темноте при температуре -20 ° C и использовать в течение 1 недели. При хранении в атмосфере N 2 срок годности может быть увеличен до 1 месяца.
- Приготовьте 1 мМ маточный раствор TMRM, растворяя 25 мг порошка TMRM в 50 мл безводного ДМСО. Смешайте путем встряхивания или пипетирования вверх и вниз и сделайте аликвоты по 10 мкл в коричневых микроцентрифужных пробирках. Хранить в темноте при температуре -20 ° C. Это решение стабильно в течение как минимум года.
- Подготовьте свежую аликвоту запаса трет -бутилпероксида (TBHP) (~ 7 М) для каждого эксперимента, непосредственно запивая объем из 70% -ного исходного раствора (10 мкл / 96-луночный планшет). Держите эту аликвоту при 4 ° C до дальнейшего использования.
- Приготовьте рабочий раствор антитела (AB), разбавив два вторичных антитела (Alexa Fluor 488 ослепительного антикролика и CY3 осла-кролика) в 1000 раз в 1x HH-buffer.
2. Настройка протокола микроскопа и сбора данных (± 15 мин)
ПРИМЕЧАНИЕ. Съемка изображения производится с помощью широкопрофильного микроскопа, оснащенного автоматизированной сценой и жалюзи, и аппаратной системы автофокусировки с использованием объектива с коррекцией по плану 20Х (NA = 0.75) и камеры EM-CCD. При первой настройке анализа контрольная ячейка, содержащая контрольные ячейки, окрашенные в соответствии с инструкциями протокола, используется для калибровки XY-стадии и оптимизации настроек сбора. Если настройки захвата уже определены, калибровка может быть выполнена с использованием пустой пластины.
- Опустите цель на абсолютный базовый уровень и откалибруйте XY-этап, следуя инструкциям программного обеспечения.
- Убедитесь, что установлены правильные кубы фильтра. Чтобы визуализировать DCFDA CM-H 2, используйте стандартный куб фильтра GFP с полосковым фильтром возбуждения 472/30 нм, дефлектором с отсечкой 495 нмИК-зеркало и полосовой фильтр 520/35 нм. Для TMRM используйте куб фильтра для TRITC с полосковым возбуждающим фильтром 540/25 нм, дихроичным зеркалом с отсечкой 565 нм и полосовым фильтром 605/55 нм.
- Создайте протокол обработки изображений, используя программное обеспечение для сбора данных.
- Выберите правильный тип многолуночной плиты (производитель и код) из списка доступных пластин, входящих в программное обеспечение. Альтернативно, определите свой собственный формат пластины с несколькими планшами, используя размеры пластин и колодцев.
- Выровняйте планшет в соответствии с инструкциями программного обеспечения, например , определив два угла четырех внешних угловых колодцев. Этот шаг охватывает изменение ориентации камеры.
- Выберите лунки, которые необходимо приобрести. Если эта опция недоступна в программном обеспечении, используйте набор определенных вручную XY-мест, которые соответствуют выбранным лункам.
- Оптимизируйте настройки захвата (время экспозиции, интенсивность лампы, коэффициент усиления электромагнитной волны) дляE два канала, отдельно используя испытательную пластину. Минимизируйте экспозицию и интенсивность, поскольку сам свет возбуждения флуоресценции вызывает ROS. Но убедитесь, что отношение сигнала к фону не менее 2 для базового DCFDA CM-H 2 и 3 для TMRM до обработки TBHP и что после обработки TBHP нет насыщения. Параметры сбора сильно зависят от настройки микроскопа и типа используемого элемента, но в качестве ориентировочных ориентировочных параметров при использовании в качестве источника света галогеновой лампы с металлогалогенной лампой, а источником света и NHDF-элементами, окрашенными в соответствии с инструкциями протокола, являются: для обоих CM- H 2 DCFDA и TMRM используется время экспозиции 200 мс и ND-фильтр 8 в сочетании с коэффициентом усиления электромагнитного поля 15 (13 МГц, 14 бит) и 4 (27 МГц, 14 бит) соответственно. После оптимизации для определенной настройки и типа ячейки этот шаг можно пропустить.
ПРИМЕЧАНИЕ. Важно, чтобы параметры сбора сохранялись одинаковыми на протяжении всего процесса формирования изображения. Для крупномасштабных многодневных экспериментов лампаСтабильность должна быть гарантирована регулярным контролем качества. - Определите протокол сбора данных, состоящий из последовательного получения лямбда (длины волны). Выберите сначала канал DC-DC CM-H 2, который должен быть получен, чтобы минимизировать воздействие света до измерения.
- Определите петлю луночного планшета, чтобы получить 4 равномерно распределенных неперекрывающихся изображения, расположенных вокруг центра каждой лунки при выборе скважины, с использованием протокола сбора, определенного в 2.3.4. Выберите извилистое получение изображения, т.е. сначала слева направо, от скважины B02 до B11, затем назад, справа налево, от скважины C11 до C02 и так далее ( рисунок 2A ). Это экономит время по сравнению с захватом изображения слева направо. Если эта опция недоступна в программном обеспечении, настройте пользовательский набор XY-мест, созданных в 2.3.3, чтобы взять этот шаблон изображения.
- Сохраните XY-координаты позиций отображения ( например, в отдельном xml-файле), чтобы облегчить просмотрНг в случае повторной калибровки микроскопа. Это особенно важно, если показания из этого анализа должны быть сопоставлены с последующим окрашиванием иммунофлюоресценции (IF) для тех же клеток.
3 . Посеявшие клетки в 96-луночном планшете (45 - 90 мин, в зависимости от количества различных клеточных линий)
- Работайте в стерильной среде, например, в шкафу биологической безопасности класса 2 и надевайте перчатки.
- Обеззараживать все поверхности и материалы с использованием 70% об. / Об. Этанола в дистиллированной воде.
- Возьмите колбу для культивирования клеток с 90% конфлюентной культуры клеток из инкубатора и поместите ее в шкаф для биобезопасности.
- Промывают клетки дважды PBS 1x.
- Добавьте соответствующее количество 0,05% раствора трипсина-ЭДТА на клетки, убедившись, что вся поверхность клетки покрыта ( например , 1 мл в колбе Т25) и инкубируйте в течение 2 мин при 37 ° С и 5% СО 2 .
- Если все ячейки отсоединены (проверьте с помощью микроскопа ) Добавляли культуральную среду (DMEM + 10% FBS + 1% пенициллин-стрептомицин, ± 4 мл в колбе Т25) для инактивации раствора трипсина-ЭДТА.
- Центрифуга в течение 5 мин при 300 xg при комнатной температуре.
- Отбросьте супернатант и ресуспендируйте осадок клеток в культуральной среде. Определите количество среды для каждого типа клеток, чтобы получить концентрацию клеток, которая совместима с подсчетом клеток. Обычно 90% конфлюентная колба Т25 из NHDF содержит около 1-1,5 млн клеток, которые ресуспендируют в 3-4 мл культуральной среды.
- Подсчитайте ячейки, используя камеру подсчета клеток или счетчик Coulter.
- Семена 8000-10 000 клеток в каждой из 60 внутренних ячеек черной 96-луночного планшета с тонким непрерывным полистиролом или стеклянным дном (черного цвета, чтобы избежать рассеяния и перекрестных помех между соседними лунками при визуализации). При использовании различных условий / обработок / клеточных линий, равномерно распределите их посевные площади на планшете, чтобы минимизировать эффекты пластины (Fig "> Рисунок 2A). Внешние лунки, за исключением колодцев B01 и A01, не используются, потому что они более подвержены краевым эффектам.
- Высевают 8000-10 000 клеток в B01. Эта скважина будет использоваться для регулировки фокуса, непосредственно перед захватом изображения.
- Заполните пустые внешние лунки средой для минимизации градиентов (температура, влажность и т. Д.) Между скважинами и окружающей средой.
- Аккуратно постучите по пластине три раза, прежде чем поместить ее обратно в инкубатор, чтобы избежать роста клеток в пластырях.
- Культуру клеток в течение 24 часов, или до степени слияния ок. 70%.
- Сохраните данные об обработке для эксперимента в электронной таблице под названием «Setup.xlsx». Файл должен содержать четыре столбца и использоваться для связывания обработок с лунками и информацией об изображении во время анализа данных. Четыре столбца: «Ну», «Число обработки», «Обработка» и «Контроль» (одна строка на лунку). Каждая обработка связанаС уникальным номером обработки, который используется при визуализации данных для определения порядка обработки по оси абсцисс участков. Контрольный столбец определяет лечение, которое функционирует как контроль за обработкой в текущей строке. Иллюстрации типового экспериментального макета и соответствующего установочного файла показаны на рисунке 2 .
4. Загрузка клеток с DCFDA CM-H 2 и TMRM (± 45 мин)
ПРИМЕЧАНИЕ. Обращение с клетками в день эксперимента может проводиться в стерильной среде (кабинет биобезопасности), но это необязательно, так как клетки будут удаляться или фиксироваться непосредственно после анализа.
- Нагрейте HH-буфер до 37 ° C.
- Подготовьте 20 мкМ рабочий раствор TMRM, разбавив 1 мМ исходный раствор 50 раз в HH-буфере (добавьте 490 мкл HH-буфера к 1 аликвоте 10 мкл основного раствора TMRM).
- Подготовка нагрузкиС 2 мкМ CM-H 2 DCFDA и 100 нМ TMRM. С этой целью разбавляют 1 мМ маточный раствор DCFDA CM-H 2 500х и рабочий раствор 20 мкМ TMRM 200х в HH-буфере.
- Обычно для 60 лунок готовят 7,5 мл загрузочного раствора, добавляя 15 мкл DCFDA CM-H 2 и 37,5 мкл раствора TMRM к 7447,5 мкл HH.
- Отбросьте культуральную среду из клеток, повернув пластину вверх дном одним движением жидкости.
- Осторожно промывайте клетки дважды HH-буфером, используя многоканальную пипетку (100 мкл / лунку). Удалите HH-буфер между стадиями промывки, повернув пластину вверх дном одним движением жидкости.
- Загружайте клетки с помощью DCFDA и TMRM CM-H 2 , добавляя по 100 мкл загрузочного раствора в каждую лунку, снова используя многоканальную пипетку. Инкубируйте в течение 25 мин в темноте при комнатной температуре. Не забудьте хорошо B01.
- В течение этих 25 минут приготовьте рабочие растворы окислителя TBHP и убедитесь, что микроскоп и вспомогательное оборудование включены.
- Подготовьте рабочий раствор I: Разбавьте маточный раствор 7М 70х до 100 мМ (10 мкл бульона в 690 мкл HH-буфера).
- Подготовка рабочего раствора II: Разбавьте WS I 100x до 1 мМ (10 мкл WS I в 990 мкл HH-буфера).
- Приготовьте рабочий раствор III: Разбавьте WS III 25х до 40 мкМ (для 60 лунок добавить 300 мкл WS II в 7200 мкл буфера HH).
- Через 25 мин снова промывают клетки дважды с помощью 100 мкл HH-буфера, как описано выше.
- Добавьте 100 мкл HH-буфера ко всем 60 внутренним лункам.
5. Первый раунд живой визуализации для измерения базальных уровней ROS и митохондриальной морфофункциональности (± 15 минут)
- Убедитесь, что программное обеспечение для сбора данных работает, и протокол обработки изображений загружен.
- Установите пластину на микроскоп, включите оборудование ba.Sed и использовать B01 для корректировки смещения автофокусировки с использованием канала TMRM. Поскольку эта процедура вызывает увеличение интенсивности сигнала DCFDA CM-H 2 , эта скважина исключается из последующего анализа изображения.
- Запустите протокол формирования изображений.
6. Второй раунд живых изображений после добавления TBHP к измеренным уровням ROS (± 20 минут)
- Осторожно удалите 96-луночный планшет с микроскопа.
- Добавить 100 мкл TBHP WS III (40 мкМ) в каждую лунку, используя многоканальную пипетку (это приводит к концентрации 20 мкМ TBHP в лунках). Это соединение используется в качестве внутреннего положительного контроля окрашивания DCFDA CM-H 2 (сигнал должен повышаться), а также средство для измерения индуцированных уровней ROS.
ПРИМЕЧАНИЕ: H 2 O 2 также можно использовать вместо TBHP, но это соединение является менее стабильным и, следовательно, менее надежным. - Подождите не менее 3 минут, чтобы обеспечить полную реакцию TBHP wС CMF-H 2 DCFDA.
- В течение этого времени, добавьте 100 мкл рабочего раствора антитела (1/1000) в лунку А01.
- Смонтируйте пластину на микроскоп и снова проверьте фокус с помощью лунки B01.
- Получите те же позиции, что и в первом раунде обработки изображений, используя тот же протокол передачи изображений.
- Экспортируйте полученные наборы данных в одну папку в виде отдельных файлов TIFF с использованием стандартизованной номенклатуры, которая включает в себя ссылку на планшет, обработку перед или после TBHP, ну, поле и канал, разделенные символами подчеркивания, например . «P01_Pre_B02_0001_C1» для пластины 1, обработка перед TBHP, скважина B02, поле 1 и канал 1. Эта информация будет использоваться во время анализа изображения ( например, для выбора соответствующих настроек сегментирования), а также во время анализа данных (для подключения данных анализа С правильным лечением).
- Приобретите изображения плоского поля для обоих каналов во всех четырех положениях вокруг центра лунки A01, используя протокол сбора данных. СохранитьEm в виде отдельных файлов TIF в той же папке, что и другие изображения, используя следующую стандартизованную номенклатуру: «P01_FF_A01_0001_C1» для пластины 1, поля 1 и канала 1. Убедитесь, что сигналы находятся в пределах динамического диапазона; В случае насыщения используйте более низкую концентрацию рабочего раствора антитела.
- Выбросьте плиту или сохраните ее для дальнейшей обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Вместо того, чтобы вынимать пластину из микроскопа и использовать многоканальную пипетку для добавления раствора TBHP, на этапе микроскопа может быть установлена автоматическая пипетка и подключена к программному обеспечению для регистрации, чтобы функционировать после получения триггера. Это позволяет добавлять TBHP в каждую лунку сразу после первого приобретения, прежде чем переходить к следующей скважине. Таким образом, когда первый раунд обработки изображений завершен, второй может начинаться сразу же, и все лунки будут иметь равное время инкубации с TBHP.
7. Обработка и анализ изображений (± 30 мин.96-луночный планшет)
ПРИМЕЧАНИЕ. Вся обработка изображений выполняется в FIJI (http://fiji.sc), в упакованной версии бесплатной программы ImageJ. Специальный сценарий был написан для автоматизированного анализа внутриклеточных сигналов ROS- и митохондрий, а также морфологических параметров (RedoxMetrics.ijm, доступен по запросу). Основные алгоритмы описаны в Sieprath et al. 1 .
- Убедитесь, что FIJI установлен и работает.
- Запустите FIJI и установите макрос (Plugins -> Macros -> Install ...). Это вызовет ряд новых макрокоманд, а также набор инструментов действий для оптимизации параметров анализа, как показано на рисунке 3A .
- Откройте интерфейс настройки, чтобы установить параметры анализа, нажав кнопку «S» ( рисунок 3B ).
- Выберите тип изображения, количество каналов и колодец, который был использованДля получения плоских изображений.
- Укажите, какой канал содержит ячейки (канал DCFDA CM-H 2 ) или митохондрии (TMRM-канал), и настройте параметры предварительной обработки и сегментации для каждого канала в зависимости от качества изображения ( рисунок 3B ). Установите флажки «Фон» и «Контраст» для выполнения вычитания фона или уменьшения контрастности адаптивного гистограммного выравнивания 16 соответственно. Определите сигму для гауссового размытия клеток и лапласианского усиления митохондрий. Выберите алгоритм автоматического порога и заполните пределы исключения размера (в пикселях). Если вместо автоматического алгоритма порогового значения выбран фиксированный порог, заполните верхний порог.
- Проверьте настройки сегментации на нескольких выбранных изображениях полученных наборов данных, открыв их и нажав кнопки «C» или «M» в меню для сегментации ячейки или митохондрии соответственно,И при необходимости настройте параметры. Примерный результат показан на рисунке 3C .
- Запустите пакетный анализ в интересующих папках, нажав кнопку «#» и выбрав папку с изображениями. В папке это создаст новый «выходной» каталог, содержащий отдельные наборы ROI (zip-файлы) и файлы результатов (.txt) на изображение. Для обоих каналов файл результатов содержит интенсивность и морфологические дескрипторы. Файл результатов канала (ячейки) CM-H 2 DCFDA содержит для каждого дескриптора среднее значение для комбинированных областей ROI в пределах одного изображения. Для канала TMR файл результатов содержит для каждого дескриптора значение для каждой отдельно сегментированной рентабельности митохондрий.
- После пакетного анализа визуально проверьте эффективность сегментации в «стек проверки», гиперэкстензию всех изображений с их соответствующим наложением ROI, нажав кнопку «V». Таким образом, такие артефакты,/ Undersegmentation, из-за фокусных изображений или частиц пыли / волокон в изображениях уже можно быстро определить. Дальнейшая курация может быть выполнена во время контроля качества данных (см. § 8).
8. Анализ данных, контроль качества (QC) и визуализация
Обработка и анализ необработанных данных осуществляется с использованием статистического бесплатного ПО R (http://www.rproject.org - версия 3.3.2) и RStudio (http://www.rstudio.com/ - версия 1.0.44). Для быстрого получения и визуализации результатов было разработано интуитивное приложение Shiny 17 (доступное по запросу), которое интегрирует и визуализирует данные в тепловых картах и коробчатых диаграммах, а также выполняет статистический анализ. Как правило, рабочий процесс состоит из двух последовательных этапов. Во-первых, данные обрабатываются и проверяются на 96-луночном планшете для обнаружения аберрантных точек данных. Во-вторых, данные куратора из всех таблиц данного эксперимента объединяются и анализируются с использованием непараметрических мультиВарьировать тесты 18 и анализ главных компонентов.
- Убедитесь, что R и RStudio установлены и работают.
- Запустите RStudio.
- Откройте приложение Brightox RedoxMetrics и запустите приложение (выберите его для запуска во внешнем браузере).
- На странице «вход» выберите каталог, в котором находятся файлы результатов с RedoxMetrics.ijm.
- Убедитесь, что в этом каталоге также присутствует «Setup.xlsx» (созданный на шаге 3.15).
- Файлы результатов и информация о настройках автоматически импортируются, переупорядочиваются и визуализируются.
- На странице экспериментальной установки показана схема эксперимента. Используйте эту страницу для проверки.
- На следующей странице «результаты на пластине» показаны данные для каждой пластины отдельно в цветовой кодировке многолуночного планшета, а также в коробчатых диаграммах с выбросами, обозначенными именем скважины и номером изображения. Последнее позволяет легко проверять и идентифицировать(Чрезвычайно высокие или низкие значения по сравнению со средними значениями, измеренными для этой конкретной обработки - см . Рисунок 4 для примера).
Используя эту информацию, проверьте изображения, соответствующие аберрантным точкам. Если обнаружены аномалии, они должны быть удалены из анализа. Большинство аномалий вызвано неправильной сегментацией, когда (часть) изображения не в фокусе, или когда сильно флуоресцирующие частицы пыли нарушают правильную сегментацию. Экстремальные случаи уже можно быстро определить с помощью инструмента стека проверки (шаг 7.5), но на этом этапе обнаруживаются более тонкие случаи. Если нет явных или технических причин для аберрантного значения, изображение не должно быть удалено из анализа. - Необязательно: создайте новую таблицу с именем «Drop.xlsx» только с одним столбцом под названием «Drop». В этом столбце укажите имена файлов (включая расширение «.tif») всех изображенийКоторые должны быть удалены из анализа (идентифицированного на этапе 7.5 или этапе 8.6.2). Загрузите этот файл с помощью страницы ввода.
- На странице результатов с целым экспериментом представлены результаты всех пластин вместе взятых. Если файл выгрузки был загружен, этот файл используется для удаления указанных точек данных из анализа.
Для каждого параметра в отдельности данные нормируются на пластину в соответствии с их соответствующими элементами управления. Затем данные со всех пластин объединяются, затем следуют непараметрические многовариантные тесты из пакета nparcomp 18 . Если сравнивать только 2 обработки, то выполняются два типовых теста для непараметрической задачи Беренса-Фишера. Для более чем двух обработок используется непараметрический анализ множественного сравнения на основе контраста. Результаты визуализируются с использованием boxplots. - На странице «кластерный анализ» показаны результаты анализа основных компонентов (стандартный пакет «статы» PCA-R). Данные по 5 параметрам (баSal и индуцированная ROS и потенциал митохондриальной мембраны, размер и округлость) объединяются, чтобы различать различные методы лечения, основанные на чувствительном окислительно-восстановительном профиле. Для этого выполняется анализ главных компонентов (РСА) (пакет R core 'stats'). Результаты визуализируются с использованием biplot (пакет ggbiplot - http://github.com/vqv/ggbiplot).
- Используйте страницу «данные загрузки» для загрузки фреймов данных, содержащих обработанные и перестроенные данные, чтобы они могли быть повторно использованы для более расширенной визуализации данных или статистического анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ. Типичные ловушки и потенциальные решения перечислены в таблице 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ проводился с использованием нескольких контрольных экспериментов, результаты которых описаны в Sieprath et al. 1 . Вкратце, флуоресцентный отклик DCFDA CM-H 2 и TMRM на внешние вызванные изменения внутриклеточных ROS и Δψm , соответственно, был количественно определен для определения динамического диапазона. Для DCFDA CM-H 2 NHDF показал линейное увеличение сигнала флуоресценции при обработке с увеличением концентрации TBHP между диапазоном от 10 мкМ до 160 мкМ. Аналогичным образом, для TMRM, клетки NHDF демонстрировали линейное увеличение митохондриальной флуоресценции при обработке возрастающими концентрациями олигомицина (который индуцирует гиперполяризацию Δψ m ) в диапазоне от 1 до 10 мкг / мкл. Наоборот, добавление валиномицина в реальном масштабе времени, антибиотик, который индуцирует деполяризацию Δψ m , приводит к постепенному, квантовомуДостоверное снижение флуоресценции TMRM .
Этот анализ также использовался в различных экспериментах для выявления различий в окислительно-восстановительном состоянии между типами клеток или обработками 1 , 15 . Чтобы проиллюстрировать это, показаны результаты эксперимента, в котором NHDF обрабатывали ингибитором протеазы ВИЧ Саквинавир (SQV) ( фиг.5 ). Используя описанный протокол, было обнаружено значительное увеличение как базального, так и индуцированного уровней ROS по сравнению с контрольными клетками, обработанными DMSO ( фиг. 5B ). Обработка SQV также значительно влияла на митохондриальную морфофункциональность. Морфологически митохондрии приобрели сильно фрагментированный характер, что также подтверждается более высокой округлостью и меньшим средним размером отдельных митохондрий. Функционально, Δψ m , измеренный как средний сигнал TMRM на митохЗначительно увеличился также ондрильный пиксель ( рис. 5А ). При объединении данных из 5 параметров, описанных выше, два условия (управление и SQV) могут быть четко отделены друг от друга анализом главных компонентов. Данные из трех независимых биологических репликатов показаны в 2D-биплоте, отображающем первые два главных компонента, что объясняет 81,4% полной дисперсии ( рис. 5C ). Это доказывает надежность анализа и предполагает, что комбинированное считывание может служить чувствительным индикатором состояния клеточного здоровья.
Рисунок 1 : Общий обзор анализа изображений с высоким содержанием для одновременного измерения внутриклеточных базальных и индуцированных уровней ROS и митохондриальной морфофункции. ( A ) SХимическое представление основных операционных блоков. ( B ) Иллюстративный пример: клетки высевают во множество идентичных 96-луночных планшетов. Стандартная компоновка планшета более подробно показана на рисунке 2A . После окрашивания для каждого канала вокруг центра каждой лунки получают 4 изображения, как до , так и после обработки TBHP, что иллюстрируется большими монтажками со вставкой. После анализа изображения результаты интенсивности визуализируются с использованием интуитивной тепловой карты, проецируемой на планшет с планшетом. Это позволяет быстро обнаруживать пластинчатые эффекты или отклоняющиеся лунки. После обработки полных наборов экспериментальных данных выполняется окончательный анализ данных, приводящий к получению одного или нескольких параметров. (Эта цифра была изменена из ссылки 1 , с разрешения Springer). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версиюП этой цифры.
Рисунок 2 : Типичная экспериментальная 96-луночная компоновка и соответствующий файл «Setup». ( A ) 4 различных условия распределены однородно по внутренним 60 ячейкам пластины. Скважина B01 также содержит ячейки, но используется только для корректировки исходного смещения PFS непосредственно перед отображением изображения. Остальные внешние лунки заполняются только культуральной средой, чтобы минимизировать градиенты (температура, влажность и т. Д.) Во время клеточной культуры. Сбор изображений осуществляется в извилистом режиме, то есть сначала слева направо, от скважины B02 до B11, затем назад, справа налево, от скважины C11 до C02 и так далее. После получения изображения плоского поля приобретают в скважине A01, которая используется для коррекции неоднородности пространственной освещенности во время изображения и alysis. ( B ) Соответствующий установочный файл (Setup.xlsx) представляет собой электронную таблицу, которая содержит информацию о макете эксперимента. Он определяет расположение каждой обработки в многопластинчатой пластине и соответствующие им органы управления. Каждая строка представляет собой колодец. Каждая обработка имеет свой уникальный номер обработки, который используется для указания порядка обработки по оси X сгенерированных графиков во время анализа данных. Столбец «Контроль» содержит обработку, которая должна использоваться в качестве контроля для нормализации данных обработки, указанных в той же строке. В этом примере обработка 1 представляет собой обработку, которая используется в качестве контроля для нормализации данных из всех других обработок. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
9 / 55449fig3.jpg "/>
Рисунок 3 : Макросетка, интерфейс Layout и Setup RedoxMetrics. ( A ) Когда установлен макрос для RedoxMetrics для FIJI, в строке меню создается ряд новых макрокоманд, а также набор инструментов действий для проверки и оптимизации параметров анализа. 'S' вызывает интерфейс настройки. «F» выполняет коррекцию плоского поля на открытом изображении. «C» и «M» выполняют тестовую сегментацию для клеточных областей («Ячейка», канал CM-H2DCFDA) и митохондриальных областей («Mito», каналы TMRM), соответственно, на одном открытом изображении с использованием параметров анализа, выбранных в установке Интерфейс, возвращая наложение сегментированных областей интереса (ROI). '#' Выполняет пакетный анализ в папке изображений, используя настройки, заданные в интерфейсе установки (обычно после проверки на одном или нескольких изображениях). «V» создает гиперссылку проверки вG - выходные данные пакетного анализа. Этот гиперстэк представляет собой составное изображение всех необработанных изображений, имеющихся в папке, и их соответствующих областей интереса (нарисованных во втором канале). «O» можно щелкнуть, чтобы показать или скрыть наложение сегментированной области. ( B ) Интерфейс установки. Здесь выбираются все параметры анализа, включая общую информацию, такую как тип изображения (расширение), количество каналов (длины волн) и скважину, которая использовалась для коррекции плоского поля. Далее следуют настройки, специфичные для типа содержимого изображения (ячейка или Mito). В обоих случаях есть опции (флажки) для включения коррекции фона («фон») и улучшения локального контраста («контраст»). Для сегментации ячеек существует возможность определить радиус размытия Гаусса (сигма) для уменьшения шума. Для сегментации мито есть возможность определить радиус оператора Лапласа для селективного усиления митохондрий. Последующая сегментация - pErformed с использованием автоматического (или фиксированного) метода пороговых значений, который может быть определен для каждого типа контента. Когда выбран фиксированный порог, верхнее пороговое значение может быть предоставлено вручную. Наконец, анализ может быть ограничен набором объектов, которые попадают в минимальный и максимальный размер. ( C ) Пример результата сегментации, который выполняется с помощью команды «C» (вверху) или «M» (внизу), отображается в виде необработанного изображения в сером цвете, наложенном на интересующие области желтым цветом. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 : Иллюстрированный пример визуализации промежуточных данных. ( A ) Визуализация многолуночных планшетов, где появляются скважины B02 и D07подозрительный. ( B ) Boxplot, представляющий одни и те же данные, с выбросами, помеченными именем скважины и именем изображения. Вместе с F03_0003 изображения из B02 и D07 снова появляются как выбросы. ( C ) Визуальный осмотр этих изображений показывает, что B02_0000 и D07_0001 должны быть удалены из дальнейшего анализа, потому что есть ошибки сегментации (проиллюстрированные красным «X»). F03_0003 следует хранить, потому что нет видимой сегментации или технической ошибки. (Если для аберрации не найдено технической причины, данные не следует удалять). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5 : Влияние саквинавира (SQV; 20 мкМ) на первичный фиброз человекаОбластей (контроль - ДМСО). ( A ) Потенциал митохондриальной мембраны (ΔΨ m ) и морфология митохондрий (округлость и средний размер отдельных митохондрий), измеренная TMRM ( B ) Увеличенные базальные уровни внутриклеточной ROS, измеренные с помощью DCFDA CM-H 2 и ответ на индуцированную ROS, измеренную Как относительное усиление интенсивности после добавления добавления 20 мкМ TBHP. ( C ) 2D-диаграмма первых двух главных компонентов (ПК) из анализа PCA на 5 переменных, описанных выше (базальный и индуцированный уровни ROS, средний размер митохондрий, округлость и ΔΨ m ). Черные стрелки обозначают направления исходных 5 переменных по отношению к главным компонентам. (Независимые репликации построены по другому цвету, все данные нормированы относительно DMSO-управления, * = p <0,05, ** = p <0,01; *** = p <0,001; Y -Оси были настроены для оптимального отображения различий; Эта цифра была изменена из ссылки 1 , с разрешения Springer). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| проблема | Потенциальная причина | Возможное решение |
| Слишком мало клеток в лунках во время обработки изображений | Слишком мало ячеек | Засеять больше клеток за 24 часа до получения изображения |
| Плохой клеточный рост | Проверьте условия культивирования (среда, температурная стабильность, контроль CO 2 ) | |
| Слишком жестокие шаги мойки | Избегайте вымывания клеток, аккуратно пипетируйте | |
| Слишком много клеток в лунках во время обработки изображений | СлишкомМного клеток посеяно | Засеять меньше клеток за 24 часа до получения изображения |
| Слабые сигналы или нелинейный отклик флуоресценции DC-DC CM-H 2 на стимул | Используется слишком низкая / высокая концентрация красителя | При использовании других, кроме NHDF-клеток, оптимальные концентрации загрузки должны быть определены эмпирически |
| Загрузка красителя недостаточна | Добавить 0,02% мас. / Об. Поверхностно-активного вещества Pluronic-127 в загрузочный раствор для увеличения поглощения. | |
| Сигнал DCFDA CM-H 2 визуально увеличивается во время экспозиции | Слишком высокая концентрация красителя | Уменьшить концентрацию красителя |
| Слишком высокая интенсивность возбуждения | Уменьшите интенсивность возбуждения с помощью ND-фильтров и / или уменьшите время экспозиции | |
| Интенсивность DCFDA CM-H 2 уменьшается во время сбора луночного планшета | CM-H 2 DCFDA вытекает изклетка. | Используйте 2 мМ Пробеницид (ингибитор на основе анионного насоса). Добавьте к загрузочному раствору, а также буфер изображения, чтобы уменьшить утечку |
| Не наблюдается увеличения интенсивности сигнала DCFDA CM-H 2 после добавления TBHP | TBHP не активен | Использовать свежий TBHP |
| CM-H 2 DCFDA вытекает из ячейки. | Используйте Пробеницид, как описано выше. | |
| (Некоторые из) полученных изображений выглядят не в фокусе, в то время как фокус кажется нормальным при проверке. | Пластина монтируется наклонно, что приводит к тому, что фокус выходит за пределы смещения PFS | Проверьте монтаж пластины и уровень ступени, Переместите пластину |
| Нижняя часть пластины содержит пыль или неровности | Очистите нижнюю часть пластины с помощью линзовой бумаги, смоченной этанолом | |
| Клетки умирают во время получения изображений | Уменьшите интенсивность возбуждения или получите меньше изображений на лунку. | |
| Неверная структура изображения-буфера | Remake imaging-buffer | |
| В фокусах имеются флуоресцентные пятна фокуса | Отдельные ячейки выходят из фокуса | Мойте более аккуратно во время загрузки протокола |
| Одна или несколько колонок имеют меньшую интенсивность по сравнению с другими лунками пластины | Один или несколько наконечников из многоканальной пипетки не были прочно прикреплены, и поэтому к этим лункам добавляли меньше репортера | Тщательно проверьте, все ли наконечники заполняются, когда вы используете многоканальную пипетку. |
| Фокус резко смещается во время захвата изображения | Основание полистирола пластины может реагировать с иммерсионным маслом при использовании масляной линзы | Используйте сухой объектив или используйте многолуночную пластину с glaSs bottom |
| Интенсивность сигнала TMRM возрастает между отображением первой и последней ямы | Время загрузки репортера было недостаточным, TMRM все еще уравновешивается | Увеличьте время загрузки репортера |
| Сигнал DCFDA CM-H 2 после обработки TBHP увеличивается во время сбора луночного планшета | Время между обработкой TBHP и началом второго раунда визуализации было недостаточным, TBHP все еще окисляет DCFDA CM-H 2 . | Увеличьте время инкубации между обработкой TBHP и вторым циклом обработки изображений. (Начать с минимум 3 мин) |
| Плоские изображения поля насыщены | Рабочий раствор антитела концентрирован | Используйте более низкую концентрацию рабочего раствора антитела |
| Настройки сбора не оптимизированы (время экспозиции высокое, ND-фильтр низкий, ...) | Оптимизируйте настройки сбора,Сигнал должен находиться в динамическом диапазоне датчика | |
| Изображения с плоскими полями темные | Рабочий раствор антитела разбавляют | Используйте более высокую концентрацию рабочего раствора антитела |
| Настройки сбора не оптимизированы (время экспозиции высокое, ND-фильтр низкий, ...) | Оптимизировать настройки сбора данных, сигнал должен находиться в динамическом диапазоне датчика | |
| Артефакты над / подсекретацией | Пороговое значение установлено неверно | Настройка порога срабатывания |
| Неправильно настроены фильтры размера | Настройте критерии минимального и максимального размера для анализа изображений | |
| Слишком высокое слияние ячеек | Правильный уровень слияния очень важен для надежного анализа изображений. Для других типов клеток, отличных от NHDF, оптимальная плотность посева должна быть определена эмпирически | |
| Блестящее приложение не работает | Выбран неправильный каталог | Выберите правильный каталог на странице ввода. |
| Отсутствующие файлы в каталоге | Убедитесь, что все необходимые файлы (выводятся из макроса imagej и файла установки) присутствуют в выбранном каталоге | |
| Отсутствующие пакеты | Обычно приложение проверяет и устанавливает все необходимые пакеты, но если это не удается, проверьте вручную следующие пакеты: devtools, ggbiplot, pacman, ggplot2, plyr, nparcomp, data.table, readxl, gplots, ggbiplot, shiny, shinyFiles, pbapply И shinyjs, включая все зависимости. |
Таблица 1: типичные ловушки и потенциальные решения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной статье описывается метод микроскопии высокого содержания для одновременной количественной оценки внутриклеточных уровней ROS и митохондриальной морфофункциональности в NHDF. Его эффективность была продемонстрирована на примере исследования SQV-обработанных NHDF. Результаты подтверждают более ранние данные из литературы, в которых наблюдались повышенные уровни ROS или митохондриальная дисфункция после лечения ингибиторами ВИЧ-протеазы 1-го типа, хотя и в отдельных экспериментах 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . Важное отличие состоит в том, что описанный анализ способен измерять эти параметры одновременно, в одних и тех же живых клетках, вместе с морфологическими данными. Основным преимуществом такого подхода является его однозначное определение обоих факторов в пространстве и tIme, что позволяет точно определить причинно-следственные связи. Выполняется анализ главных компонентов, который позволяет генерировать чувствительный редокс-профиль специфических возмущений. Тем не менее, более сложные методы интеллектуального анализа данных и алгоритмы (контролируемые) кластеризации могут также использоваться в извлеченных данных, чтобы обеспечить прогностическое профилирование редокс. Это может быть ценной характеристикой для диагностических или прогностических инструментов классификации при цифровой патологии, а также для скрининга терапевтических целей, например, после создания устойчивых классификационных моделей, скрининг небольших библиотек молекул для поиска терапевтических кандидатов для противодействия окислительному стрессу, аналогичный Недавний экран для перспективных исследований в развитии терапии митохондриальных расстройств у людей 26 .
Анализ был разработан для NHDF, но может быть адаптирован к другим типам адгезивных клеток. Это требует оптимизации протокола окрашивания и концентрации красителя репортера. Количество r Должен быть сведен к минимуму, так как перегрузка может вызвать нелинейные эффекты, обусловленные тушением или даже стать цитотоксическим 27 . Расширение анализа на суспензионные клетки менее очевидно из-за трудностей с установкой и наблюдением таких клеток физиологическим способом. Они могут быть цитоспан на покровном стекле или культивироваться в бессывороточной среде для индукции адгезии, но оба эти процесса мешают физиологическим условиям 28 , 29 . Однако эти ограничения могут быть преодолены с использованием микропластинчатых клеточных культуральных носителей, которые удерживают отдельные клетки (адгезивные или неадгезивные) в небольших микроячейках, сохраняя при этом их жизнеспособность 30 , или путем использования термообратимого гидрогеля для захвата клеток во время получения изображения 31 , Эти методы уже использовались для скрининга высокого потенциала плазматической мембраны или клеточного кислорода в отдельных суспензионных клетках= "Xref"> 32 , 33 или изображение внутриклеточных маркеров у живых, сильно подвижных паразитов 31 . Адаптация также должна быть сделана с использованием метода визуализации, поскольку морфологический анализ сети митохондрий в этих клетках потребует быстрых возможностей получения 3D-данных, таких как конфокальная прядения или бесселевая световая микроскопия 34 , 35 , а также к анализу Трубопровода, чтобы включить Z-измерение при вычислении морфологических параметров.
Анализ был оптимизирован для 96-луночных планшетов, но очевидно, что он поддается дальнейшему наращиванию, например, до 384-луночных планшетов. Основным ограничивающим фактором является время захвата пластины, т. Е. Время, необходимое для получения изображений всех скважин. Флуоресцентные сигналы должны оставаться стабильными в течение этого временного интервала, чтобы иметь возможность уверенно сравнивать измерения междуОтдельные скважины. Но, поскольку окрашивание является кратковременным, а исследуемый процесс является динамичным, это создает проблему. Поэтому флуоресцентные сигналы измерялись в наборе реплицированных экспериментов, и это показало, что сигналы CM-H 2 DCFDA и TMRM остаются стабильными от 7 до по меньшей мере 50 мин после окрашивания (коэффициент вариации <2%). Это дает окно приблизительно 40 мин. 96-луночный планшет обычно занимает около 10 мин. Таким образом, экстраполяция на 384-луночные планшеты сохранила бы продолжительность регистрации в пределах стабильного временного интервала. В среднем по 50 ячеек на изображение (на основе использования объективов 20X и клеток NHDF) это приведет к получению данных для приблизительно 30 000 клеток в час скрининга, значительно увеличивая статистическую силу анализа. Другим фактором, влияющим на стабильность флуоресцентного сигнала, является температура. Чтобы избежать вакуолиза DCFDA CM-H 2 (т.е. накопление красителя во внутриклеточных везикулах), что привело бы к образованию гетероРодовое окрашивание и нелинейные эффекты, инкубация происходит при комнатной температуре вместо 37 ° С. Помимо стабильности, важно отметить, что облучение живых клеток светом возбуждения флуоресценции само по себе вызывает образование ROS. Это означает, что условия экспозиции (время экспозиции и интенсивность света возбуждения) должны поддерживаться на абсолютном минимуме. Это также означает, что все лунки должны быть открыты только при получении фактических изображений. Это исключает использование программных методов автофокусировки и гарантирует использование аппаратной системы автофокусировки.
Преимуществом описанного метода является его общий характер. Можно использовать практически любую комбинацию спектрально совместимых флуоресцентных репортеров. Это было продемонстрировано с использованием комбинации Calcein / MitoSOX для измерения митохондриальной ROS на живую клетку 1 , 15 . Кроме того, приложения не ограничиваются int Измеренное ROS / митохондриальное измерение. Этот анализ также может быть расширен с помощью послойного иммунного окрашивания (после второго цикла визуализации). Так как точные местоположения изображений сохраняются, окислительно-восстановительный анализ может непосредственно коррелировать с протеомикой положения в тех же самых клетках. Это значительно увеличивает молекулярное считывание, которое резко контрастирует с другими методами, часто используемыми для оценки окислительно-восстановительной биологии или интенсивностей флуоресценции в целом. Например, флюориметрия (считыватель микропланшетов) широко используется из-за ее относительно низкой стоимости (базовая установка доступна всего за 4000 евро) и неглубокой кривой обучения, но будучи черным ящиком, она более подвержена влиянию таких факторов, как колебания Плотности клеток или фона (авто-) флуоресценции, например , загрязняющих частиц пыли. Кроме того, считыватели планшетов не позволяют извлекать морфологические параметры, они не могут измерять отдельные ячейки, и они менее чувствительны и надежны для измерения динамических или переходных сигналовLass = "xref"> 36 , 37 . Проточная цитометрия действительно обладает способностью измерять отдельные клетки и имеет преимущество в скорости. Действительно, 384-луночный планшет может быть экранирован всего за 12 минут с высокой чувствительностью для нескольких маркеров 38 . Это намного быстрее, чем это возможно при широкополосной микроскопии. Но до сих пор нет пространственно-временной информации ( то есть субклеточная локализация, морфологические данные и / или зависящая от времени кинетика), и она не позволяет повторно посещать одни и те же клетки во время или после лечения (т.е. во флаксе) . Кроме того, клетки должны находиться в суспензии, что делает проточную цитометрию менее подходящей для изучения физиологии адгезивных клеток. Основными недостатками микроскопии высокого содержания по сравнению с другими методами являются необходимость в крупном хранилище данных изображений, интенсивной вычислительной мощности и комплексном анализе изображений. Представленный анализ стандартизирует процесс получения изображений и упрощает анализС, чтобы минимизировать это время обработки, увеличить простоту использования и, следовательно, сделать анализ более доступным.
В заключение, и конкретно для использования DCFDA и TMRM CM-H 2 , описанный метод редокс-профилирования является надежным, чувствительным и надежным. Из-за его многопараметрического и количественного характера он превосходит другие методы на основе флуоресценции. Таким образом, это может помочь выяснить взаимосвязь между функцией митохондрий и внутриклеточной передачей сигналов ROS, которая имеет решающее значение для лучшего понимания широкого спектра патологий, в которых возмущается окислительно-восстановительный гомеостаз. Кроме того, благодаря своему общему характеру, анализ позволяет приложениям выйти за пределы его первоначальной области.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что не существует конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов. Соответствующий автор также гарантирует, что всем авторам было предложено раскрыть любые и все конфликты интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 mL | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1 M 500 mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20X objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
- Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
- Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
- Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
- Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
- Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
- Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
- Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology? Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
- Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
- Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
- Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
- Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).
- Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , https://CRAN.R-project.org/package=shiny (2017).
- Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
- Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
- Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
- Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
- Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
- Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
- Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
- Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
- Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
- Invitrogen. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
- Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
- Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
- Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
- Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
- Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
- Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
- Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
