Summary
In dit artikel wordt een microscopie-werkstroom voor hoge inhoud voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus aangeboden, evenals mitochondriale membraanpotentiaal en morfologie - gezamenlijk aangeduid als mitochondriale morfofunctie - in levend aanhechtende cellen met behulp van de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen 5- (en- 6) -chloormethyl-2 ', 7'-dichloordihydrofluoresceendiacetaat, acetylester (CM-H2 DCFDA) en tetramethylrhodamine methylester (TMRM).
Abstract
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) regelen essentiële cellulaire processen, waaronder genuitdrukking, migratie, differentiatie en proliferatie. Overmatige ROS-niveaus veroorzaken echter een toestand van oxidatieve stress, die gepaard gaat met onomkeerbare oxidatieve schade aan DNA, lipiden en eiwitten. Zo geeft kwantificering van ROS een directe proxy voor cellulaire gezondheidstoestand. Aangezien mitochondriën tot de belangrijkste cellulaire bronnen en doelstellingen van ROS behoren, is gezamenlijke analyse van mitochondriale functie en ROS-productie in dezelfde cellen van cruciaal belang voor het beter begrijpen van de interconnectie in pathofysiologische omstandigheden. Daarom is een microscopie gebaseerde strategie ontwikkeld voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS niveaus, mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨ m ) en mitochondriale morfologie. Het is gebaseerd op geautomatiseerde widefield fluorescentiemicroscopie en beeldanalyse van levende aanhechtende cellen, gegroeid in platen met meerdere putjes en staineD met de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen CM-H 2 DCFDA (ROS) en TMRM (ΔΨ m en mitochondriale morfologie). In tegenstelling tot fluorimetrie of flowcytometrie, kan deze strategie kwantificering van subcellulaire parameters op het niveau van de individuele cel met hoge spatiotemporale resolutie, zowel voor als na experimentele stimulatie. Belangrijk is dat de beeldgebaseerde aard van de werkwijze het mogelijk maakt om morfologische parameters te extraheren naast signaalintensiteiten. De gecombineerde funktieset wordt gebruikt voor exploratieve en statistische multivariate data-analyse om verschillen tussen subpopulaties, celtypes en / of behandelingen te detecteren. Hier wordt een gedetailleerde beschrijving van de analyse verstrekt, samen met een voorbeeld-experiment dat zijn potentieel voor ondubbelzinnige discriminatie tussen cellulaire staten bewijst na chemische verstoring.
Introduction
De concentratie van intracellulaire ROS wordt nauwgezet gereguleerd door een dynamisch wisselwerking tussen ROS-producerende en ROS-defusing systemen. Onevenwicht tussen de twee veroorzaakt een staat van oxidatieve stress. Onder de belangrijkste bronnen van ROS zijn mitochondriën 1 . Gezien hun rol in cellulaire ademhaling, zijn ze verantwoordelijk voor het grootste deel van intracellulaire superoxide (O 2 • - ) moleculen 2 . Dit komt voornamelijk uit elektronleklek op O2 bij complex 1 van de elektron transportketting onder omstandigheden van sterk negatief innerlijk mitochondriaal membraanpotentieel (ψψ m ), dat wil zeggen mitochondriale hyperpolarisatie. Aan de andere kant is mitochondriale depolarisatie ook gecorreleerd met verhoogde ROS-productie die wijst op meerdere werkingsmethoden 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Door middel van redoxmodificaties in eiwitten van de splitsingsfusie-machines coördineren ROS de mitochondriale morfologie 9. Bijvoorbeeld, fragmentatie is gecorreleerd met verhoogde ROS-productie en apoptose 10 , 11 , terwijl filamente mitochondriën zijn gekoppeld aan voedingshongersnood en bescherming tegen Mitofagie 12 . Gezien de ingewikkelde relatie tussen cellulaire ROS en mitochondriale morfofunctie, zouden beide ideaal gelijktijdig in levende cellen gekwantificeerd moeten worden. Om dit precies te doen, werd een hoogwaardige beeldbepalingstest ontwikkeld op basis van geautomatiseerde widefieldmicroscopie en beeldanalyse van aanhechtende celculturen die gekleurd zijn met de fluorescerende probes CM-H 2 DCFDA (ROS) en TMRM (mitochondriale Δψ m en morfologie). High-content beeldvorming verwijst naar de extractie van spAtiotemporally rich ( dat wil zeggen een groot aantal beschrijvende eigenschappen) informatie over cellulaire fenotypen met behulp van meerdere complementaire markers en geautomatiseerde beeldanalyses. In combinatie met geautomatiseerde microscopie kunnen veel monsters parallel worden gescreend ( dwz hoge doorvoer), waardoor de statistische kracht van de test wordt verhoogd. Inderdaad, een belangrijk voordeel van het protocol is dat het gelijktijdige kwantificering van meerdere parameters in dezelfde cel mogelijk maakt, en dit voor een groot aantal cellen en condities.
Het protocol is verdeeld in 8 delen (in detail beschreven in het protocol hieronder): 1) Zaadcellen in een 96-putjesplaat; 2) Bereiding van voorraadoplossingen, werkoplossingen en afbeeldingsbuffer; 3) Opstelling van de microscoop; 4) Laden van de cellen met CM-H2 DCFDA en TMRM; 5) Eerste live imaging ronde om basale ROS niveaus en mitochondriale morphofunction te meten; 6) Tweede live imaging ronde na toevoeging van tert -butylPeroxide (TBHP) om geïnduceerde ROS niveaus te meten; 7) Automatische beeldanalyse; 8) Gegevensanalyse, kwaliteitscontrole en visualisatie.
De test werd oorspronkelijk ontwikkeld voor normale humane dermale fibroblasten (NHDF). Aangezien deze cellen groot en plat zijn, zijn ze goed geschikt voor het beoordelen van mitochondriale morfologie in 2D breedbeeldbeelden 13 , 14 . Echter, met kleine wijzigingen, is deze methode van toepassing op andere aanhechtende celtypes. Bovendien, naast de combinatie van CM-H 2 DCFDA en TMRM, voldoet de workflow aan een verscheidenheid aan fluorescerende kleurstofparen met verschillende moleculaire specificaties 1 , 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het onderstaande protocol wordt beschreven als uitgevoerd voor NHDF-cellen en met behulp van de multiwellplaten die in het materiaalbestand zijn gespecificeerd. Zie Figuur 1 voor een algemeen overzicht van de workflow.
1. Bereiding van reagentia
- Bereid volledig medium op door Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) te gebruiken met 10% v / v foetale boviene serum (FBS) en 100 IE / ml penicilline en 100 IE / mL streptomycine (PS). Voor 500 ml volledig medium, voeg 50 ml FBS en 5 ml PS toe aan 445 ml DMEM.
- Bereid HBSS-HEPES (HH) beeldbuffer door Hank's Gebalanceerde Zoutoplossing (met magnesium en calcium, maar zonder fenolrood) met 20 mM HEPES aan te vullen. Voor 500 ml HH voeg 10 ml 1M HEPES voorraadoplossing toe aan 490 ml HBSS. Controleer de pH en, indien nodig, aanpassen aan pH 7.2.
- Bereid 1 mM CM-H2 DCFDA voorraadoplossing door 50 μg CM-H2 DCFDA gelyofiliseerde poeder op te lossen in 86,5 &# 181; L watervrije DMSO. Meng door vortexing of pipettering omhoog en omlaag en maak 20 μL porties in bruine microcentrifugebuizen. Bewaar in het donker bij -20 ° C en gebruik binnen 1 week. Als deze onder N 2- atmosfeer wordt opgeslagen, kan de houdbaarheid tot tenminste 1 maand worden verhoogd.
- Bereid 1 mM TMRM voorraadoplossing door 25 mg TMRM poeder in 50 ml watervrije DMSO op te lossen. Meng door vortexing of pipettering omhoog en omlaag en maak 10 μL porties in bruine microcentrifuge buizen. Bewaar in het donker bij -20 ° C. Deze oplossing is minstens een jaar stabiel.
- Bereid een nieuw deel van Tert -butyl peroxide (TBHP) voorraad (~ 7 M) voor elk experiment door een volume van de 70% voorraadoplossing (10 μL / 96-putplaat) direct te pipetteren. Bewaar deze aliquot bij 4 ° C tot verder gebruik.
- Bereid antilichaam werkoplossing (AB) door twee secundaire antilichamen te verdunnen (Alexa Fluor 488 ezel anti-konijn en CY3 ezel anti-konijn) 1.000 keer in 1x HH-buffer.
2. Opstellen van het Microscoop- en Acquisitieprotocol (± 15 min)
OPMERKING: Beeldverzameling wordt uitgevoerd met een brede veldmicroscoop uitgerust met een geautomatiseerde fase en luiken, en een op hardware gebaseerde autofocus-systeem met behulp van een 20X luchtplan gecorrigeerde doelstelling (NA = 0.75) en een EM-CCD camera. Bij het opstellen van de test voor de eerste keer wordt een testplaat met controlecellen, gekleurd volgens de instructies van het protocol, gebruikt om de XY-fase te kalibreren en de acquisitie-instellingen te optimaliseren. Als de acquisitie-instellingen al zijn vastgesteld, kan de kalibratie worden uitgevoerd met behulp van een lege plaat.
- Verlaag de doelstelling naar het absolute basisniveau en kalibreer de XY-fase volgens de software-instructies.
- Zorg ervoor dat de juiste filterblokken zijn geïnstalleerd. Om CM-H 2 DCFDA te visualiseren, gebruik een standaard GFP filterkubus met een 472/30 nm excitatie bandpass filter, een 495 nm cutoff dichroIc spiegel en een 520/35 nm bandpass emissie filter. Voor TMRM, gebruik een filterkubus voor TRITC met een 540/25 nm bandpass excitatie filter, een 565 nm cutoff dichroic spiegel en een 605/55 nm bandpass emissie filter.
- Maak een beeldprotocol met behulp van de acquisitie software.
- Selecteer het juiste type multiwellplaat (fabrikant en code) uit de lijst met beschikbare platen die in de software zijn geleverd. U kunt ook uw eigen multiwellplaatformaat definiëren met behulp van plaat- en putafmetingen.
- Breng de putplaat uit volgens de instructies van de software, bijv. Door twee hoeken van de vier buitenste hoekputten te definiëren. Deze stap heeft betrekking op de variatie van de camera-oriëntatie.
- Selecteer de bronnen die moeten worden verworven. Als deze optie niet beschikbaar is in de software, gebruik dan een set handmatig gedefinieerde XY-locaties die overeenkomen met de geselecteerde putten.
- Optimaliseer de acquisitie-instellingen (belichtingstijd, lampintensiteit, EM-gain) voor thE twee kanalen afzonderlijk met behulp van de testplaat. Minimaliseer de blootstelling en intensiteit als fluorescentie-excitatie licht zelf induceert ROS. Maar zorg ervoor dat de signaal-naar-achtergrond verhouding ten minste 2 voor basale CM-H 2 DCFDA en 3 voor TMRM is voor TBHP-behandeling, en dat er geen verzadiging is na TBHP-behandeling. De acquisitie-instellingen zijn sterk afhankelijk van de microscopische opstelling en het gebruikte celtype, maar als referentie dienen indicatieve instellingen bij het gebruik van een metalen halogeenlamp van 130 W als lichtbron- en NHDF-cellen die zijn gebrand volgens de instructies van het protocol, als volgt: voor beide CM- H 2 DCFDA en TMRM worden een belichtingstijd van 200 ms en ND filter 8 gebruikt, gecombineerd met een EM-gain van respectievelijk 15 (13 MHz, 14 bit) en 4 (27 MHz, 14 bit). Eenmaal geoptimaliseerd voor een bepaalde setup en celtype, kan deze stap worden overgeslagen.
OPMERKING: het is essentieel dat de acquisitie-instellingen gedurende het gehele beeldproces gelijk blijven. Voor grootschalige, multi-day experimenten, lamp staDe mogelijkheid moet worden geregeld door middel van een regelmatige kwaliteitscontrole. - Definieer een acquisitie protocol, bestaande uit een opeenvolgende lambda (golflengte) acquisitie. Selecteer het CM-H 2 DCFDA-kanaal dat eerst wordt verworven, om de lichtbelichting voor de meting te minimaliseren.
- Definieer een plaatplaatlus om 4 regelmatige, niet-overlappende beelden op elkaar te plaatsen die rondom het midden van elke bron van de putselectie worden geplaatst, met behulp van het acquisitieprotocol gedefinieerd in 2.3.4. Kies meanderende beeldverzameling, dwz eerst van links naar rechts, van goed B02 tot B11, dan terug, van rechts naar links, van put C11 tot C02 enzovoort ( Figuur 2A ). Dit bespaart tijd in vergelijking met links naar rechts beeldverwerving. Als deze optie niet beschikbaar is in de software, moet u de aangepaste set XY-locaties aangemaakt in 2.3.3 aanpassen om dit afbeeldingspatroon aan te nemen.
- Bewaar de XY-coördinaten van de afbeeldingsposities ( bijv. In een apart xml-bestand), om een eenvoudige revisitie mogelijk te makenNg in het geval van microscoopherkenning. Dit is vooral belangrijk als de uitlezing uit deze analyse moet worden gecorreleerd met een post-hoc immunofluorescentie (IF) kleuring voor dezelfde cellen.
3 . Zaadcellen in een 96-putjesplaat (45 - 90 minuten, afhankelijk van het aantal verschillende cellijnen)
- Werk in steriele omgeving, zoals een klasse 2 bioveiligheidskast en draag handschoenen.
- Decontamineren alle oppervlakken en materialen met behulp van 70% v / v ethanol in gedistilleerd water.
- Neem een celkweek fles met een 90% confluente celcultuur uit de incubator en plaats het in de biosafety-kast.
- Was de cellen tweemaal met PBS 1x.
- Voeg de juiste hoeveelheid 0,05% trypsine-EDTA-oplossing op de cellen toe, zorg ervoor dat het volledige celoppervlak bedekt is ( bijv . 1 ml voor een T25-fles) en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
- Als alle cellen losgemaakt zijn (controleer met een microscoop ), Voeg kweekmedium (DMEM + 10% FBS + 1% penicilline-streptomycine, ± 4 ml in een T25-fles) toe om de trypsine-EDTA-oplossing in te schakelen.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 xg bij kamertemperatuur.
- Gooi de supernatant weg en verwijder de celpellet in kweekmedium. Bepaal de hoeveelheid medium voor elk celtype om een celconcentratie te verkrijgen die compatibel is met celtelling. Gewoonlijk bevat een 90% confluente T25-fles NHDF ongeveer 1-1,5 miljoen cellen, die geresuspendeerd zijn in 3-4 ml kweekmedium.
- Tel de cellen met behulp van een cel teller kamer of Coulter teller.
- Zaad 8.000-10.000 cellen in elk van de binnenste 60 putten van een zwarte 96-putjesplaat met een dunne continue polystyreen of glazen bodem (zwart om verstrooiing en kruisgesprek tussen naburige putjes tijdens beeldvorming te vermijden). Wanneer u verschillende condities / behandelingen / cellijnen gebruikt, verdeel uw zaaizaadjes homogeen op de plaat om de plaatseffecten te minimaliseren (Fig.> Figuur 2A). De buitenputten, met uitzondering van put B01 en A01, worden niet gebruikt omdat ze meer gevoelig zijn voor rand effecten.
- Zaad 8.000-10.000 cellen in B01. Deze bron wordt gebruikt voor focus aanpassing, net voor de opname van het beeld.
- Vul de lege buitenbronnen met medium om de gradiënten (temperatuur, vochtigheid, enz. ) Tussen de putten en het milieu te minimaliseren.
- Trek de plaat voorzichtig drie keer op voordat u deze terug in de incubator plaatst om te voorkomen dat cellen in patches groeien.
- Cultuur de cellen gedurende 24 uur, of tot een samenloopgraad van ca. 70%.
- Sla de behandelingsinformatie voor het experiment op in een spreadsheet genaamd "Setup.xlsx". Het bestand bevat vier kolommen en wordt gebruikt om de behandelingen met putten en beeldinformatie te koppelen tijdens data analyse. De vier kolommen zijn: 'Wel', 'Behandelnummer', 'Behandeling' en 'Beheer' (één rij per putje). Elke behandeling is gekoppeldMet een uniek behandelingsnummer, dat wordt gebruikt tijdens data visualisatie om de volgorde van de behandelingen op de X-as van plots te bepalen. De controle kolom geeft de behandeling aan die als controle voor de behandeling in de huidige rij fungeert. Illustraties van een typische experimentele indeling en bijbehorend instellingsbestand worden in figuur 2 afgebeeld.
4. Laden van de cellen met CM-H 2 DCFDA en TMRM (± 45 min)
OPMERKING: Hantering van de cellen op de dag van het experiment kan uitgevoerd worden in een steriele omgeving (biosafety cabinet), maar dit is niet verplicht omdat cellen direct na de test worden verwijderd of opgelost.
- Verhit de HH-buffer naar 37 ° C.
- Bereid een 20 μM TMRM werkoplossing door verdunning van de 1 mM voorraadoplossing 50 keer in HH-buffer (voeg 490 μL HH-buffer toe aan 1 aliquot van 10 μL TMRM voorraadoplossing).
- Bereid een lading voorOplossing met 2 μM CM-H2 DCFDA en 100 nM TMRM. Daartoe verdund de 1 mM CM-H 2 DCFDA voorraadoplossing 500x en de 20 μM TMRM werkoplossing 200x in HH-buffer.
- Typisch voor 60 putjes, bereiden 7,5 ml laadoplossing door 15 μl CM-H2 DCFDA en 37,5 μL TMRM-oplossing toe te voegen aan 7447,5 μL HH.
- Verwijder het kweekmedium uit de cellen door de plaat ondersteboven in een enkele vloeistofbeweging te draaien.
- Was de cellen twee keer zachtjes met HH-buffer met behulp van een multikanaalspipet (100 μl / putje). Gooi de HH-buffer tussen de wasstapjes door de plaat ondersteboven in een enkele vloeistofbeweging te draaien.
- Laad de cellen met CM-H 2 DCFDA en TMRM door 100 μL van de laadoplossing aan elke put toe te voegen, opnieuw met behulp van een multikanaalspipet. Incubeer gedurende 25 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Vergeet niet goed B01.
- Bereid de werkoplossingen van de oxidant TBHP gedurende deze 25 minuten en zorg ervoor dat de microscoop en accessoire hardware zijn ingeschakeld.
- Bereid werkoplossing I: Verdun de 7M voorraadoplossing 70x tot 100 mM (10 μL voorraad in 690 μL HH-buffer).
- Bereid werkoplossing II uit: Verdun WS I 100x tot 1 mM (10 μL WSI in 990 μL HH-buffer).
- Bereid werkoplossing III uit: Verdun WS III 25x tot 40 μM (voor 60 putjes voeg 300 μL WS II in 7200 μL HH buffer) toe.
- Na 25 minuten wassen de cellen tweemaal tweemaal met 100 μl HH-buffer zoals eerder beschreven.
- Voeg 100 μL HH-buffer toe aan alle 60 binnenbronnen.
5. Eerste Live Imaging Round om basale ROS-niveaus en mitochondriale morfofunctie te meten (± 15 min)
- Zorg ervoor dat de acquisitie software operationeel is en het beeldprotocol is geladen.
- Installeer de plaat op de microscoop, zet de hardware ba aanSed autofocus systeem en gebruik goed B01 om de autofocus offset aan te passen met behulp van het TMRM kanaal. Aangezien deze procedure een toename in CM-H 2 DCFDA signaalintensiteit veroorzaakt, wordt deze bron uitgesloten van stroomafwaartse beeldanalyse.
- Voer het afbeeldingsprotocol uit.
6. Tweede Live Imaging Round na toevoeging van TBHP om geïnduceerde ROS-niveaus te meten (± 20 min)
- Verwijder de 96-putjesplaat uit de microscoop zorgvuldig.
- Voeg 100 μL TBHP WS III (40 μM) toe aan elke put met een multikanaalspipet (dit resulteert in een 20 μM TBHP-concentratie in de putjes). Deze verbinding wordt gebruikt als een interne positieve controle voor de CM-H 2 DCFDA-kleuring (het signaal moet stijgen) alsook een middel om geïnduceerde ROS-niveaus te meten.
OPMERKING: H 2 O 2 kan ook worden gebruikt in plaats van TBHP, maar deze verbinding is minder stabiel en dus minder betrouwbaar. - Wacht tenminste 3 minuten om de complete reactie van TBHP w mogelijk te makenMet CM-H 2 DCFDA.
- Voeg gedurende deze tijd 100 μL antilichaam werkoplossing (1/1000) toe aan put A01.
- Monteer de plaat weer op de microscoop en controleer opnieuw de focus met behulp van de B01.
- Verkrijg dezelfde posities als in de eerste afbeeldingsronde met hetzelfde beeldprotocol.
- Exporteer de verworven datasets in een enkele map als afzonderlijke tiff-bestanden met behulp van gestandaardiseerde nomenclatuur die verwijzing naar de plaat, pre- of post-TBHP-behandeling, put, veld en kanaal bevat, gescheiden door onderstrepen, bijv . 'P01_Pre_B02_0001_C1' voor plaat 1, pre-TBHP-behandeling, put B02, veld 1 en kanaal 1. Deze informatie wordt gebruikt tijdens beeldanalyse ( bijv. Om de juiste segmenteringsinstellingen te selecteren), alsmede tijdens data-analyse (om analysegegevens te verbinden Met de juiste behandelingen).
- Verkrijg platte veldafbeeldingen voor beide kanalen op alle vier de posities rond het centrum van put A01 met behulp van het acquisitieprotocol. Sla thEm als individuele tiff-bestanden in dezelfde map als de andere afbeeldingen met behulp van de volgende gestandaardiseerde nomenclatuur: 'P01_FF_A01_0001_C1' voor plaat 1, veld 1 en kanaal 1. Zorg ervoor dat de signalen goed in het dynamische bereik liggen; In geval van verzadiging, gebruik een lagere concentratie werkzame oplossing van antilichamen.
- Verwijder de plaat of sla het op voor verdere verwerking.
OPMERKING: In plaats van de plaat uit de microscoop te verwijderen en een multikanaalspipet te gebruiken om de TBHP-oplossing toe te voegen, kan een geautomatiseerde pipet op het microscoopfase worden geïnstalleerd en verbonden met de acquisitie software om te functioneren bij het ontvangen van een trigger. Dit zorgt ervoor dat TBHP bij elke eerste put rechtstreeks na de eerste aansluiting wordt toegevoegd, voordat u naar de volgende put gaat. Op deze manier, wanneer de eerste afbeeldingsronde is afgerond, kan de tweede meteen beginnen en alle putten hebben een gelijke incubatietijd met de TBHP.
7. Beeldverwerking en analyse (± 30 min per96-putje plaat)
OPMERKING: Alle beeldverwerking wordt uitgevoerd in FIJI (http://fiji.sc), een verpakte versie van ImageJ freeware. Een speciaal script werd geschreven voor geautomatiseerde analyse van intracellulaire ROS- en mitochondriale signalen, evenals morfologische parameters (RedoxMetrics.ijm, beschikbaar op aanvraag). De onderliggende algoritmen zijn beschreven in Sieprath et al. 1 .
- Zorg ervoor dat FIJI is geïnstalleerd en operationeel.
- Start FIJI en installeer de macro-set (Plugins -> Macros -> Install ...). Dit zal een aantal nieuwe macro-opdrachten en een set actieprogramma's aanroepen om de analyse-instellingen te optimaliseren, zoals weergegeven in Figuur 3A .
- Open de instellingsinterface om de analyse instellingen in te stellen door op de 'S' knop te klikken ( Figuur 3B ).
- Selecteer het beeldtype, het aantal kanalen en de bron die is gebruiktVoor het verwerven van flatfieldbeelden.
- Geef aan welk kanaal cellen bevatten (CM-H 2 DCFDA-kanaal) of mitochondria (TMRM-kanaal) en pas de voorverwerkings- en segmenteringsparameters voor elk kanaal aan, afhankelijk van de beeldkwaliteit ( Figuur 3B ). Vink het selectievakje 'Achtergrond' en 'Contrast' aan om respectievelijk respectievelijk respectievelijk achtergrondaftrekking of contrastbegrenzende adaptieve histogramuitkering 16 uit te voeren. Definieer een sigma voor Gaussiaanse vervaging van cellen en Laplaciaanse verbetering van mitochondria. Selecteer een automatisch drempelalgoritme en vul de limietgrootte uit (in pixels). Als een vaste drempel wordt gekozen in plaats van een automatisch drempelalgoritme, vul dan de bovenste drempel in.
- Test de segmentatie instellingen op een paar geselecteerde afbeeldingen van de verworven datasets door ze te openen en de 'C' of 'M' knoppen in het menu voor cel- of mitochondria segmentatie respectievelijk te klikken,En pas indien nodig de instellingen aan. Een voorbeeld resultaat is weergegeven in figuur 3C .
- Voer de batchanalyse uit op de map (en) van belangstelling door op de knop '#' te klikken en de map met de afbeeldingen te selecteren. Per map produceert dit een nieuwe 'Output'-map met individuele ROI-sets (zip-bestanden) en resultaatbestanden (.txt) per afbeelding. Voor beide kanalen bevat het resultatenbestand intensiteit en morfologische descriptoren. Het CM-H 2 DCFDA-kanaal (cellen) resultatenbestand bevat per descriptor de gemiddelde waarde voor de gecombineerde ROI's in een afbeelding. Voor het TMRM-kanaal bevat het resultatenbestand per omschrijving de waarde voor elke afzonderlijk gesegmenteerde mitochondriale ROI.
- Na batchanalyse verifieer je de segmenteringsprestaties visueel op een 'Verificatie stack', een hyperstack van alle afbeeldingen met hun respectieve ROI overlay door op de 'V' knop te klikken. Op deze manier worden artefacten zoals over-/ Onderverdeling, uit focusbeelden of stofdeeltjes / vezels in afbeeldingen kan al snel worden gezien. Verdere curatie kan worden gedaan tijdens de data kwaliteitscontrole (zie §8).
8. Gegevensanalyse, kwaliteitscontrole (QC) en visualisatie
De verwerking en analyse van de rauwe data wordt uitgevoerd met behulp van R statistisch freeware (http://www.rproject.org - versie 3.3.2) en RStudio (http://www.rstudio.com/ - versie 1.0.44). Om de resultaten snel te verkrijgen en te visualiseren is een intuïtieve glanzende applicatie 17 (beschikbaar op aanvraag) ontwikkeld die de data integreert en visualiseert in heatmaps en boxplots en ook statistische analyses uitvoert. In het algemeen bestaat de workflow uit twee opeenvolgende stappen. Ten eerste worden de gegevens verwerkt en geïnspecteerd per 96-putjesplaat om afwijkende datapunten te detecteren. Ten tweede worden gecorrigeerde data van alle platen van een bepaald experiment gecombineerd en geanalyseerd met behulp van niet-parametrische multiVariabele tests 18 en een hoofdcomponent analyse.
- Zorg ervoor dat R en RStudio geïnstalleerd en operationeel zijn.
- Start RStudio.
- Open de glanzende applicatie RedoxMetrics en voer de app uit (kies deze in een externe browser).
- Selecteer op de pagina 'invoer' de map waar de resultatenbestanden van RedoxMetrics.ijm zijn.
- Zorg ervoor dat 'Setup.xlsx' (aangemaakt in stap 3.15) ook aanwezig is in deze map.
- De resultatenbestanden en instellingen worden automatisch geïmporteerd, herschikt en zichtbaar.
- Op de pagina 'Experimentele instellingen' wordt de indeling van het experiment weergegeven. Gebruik deze pagina voor verificatie.
- Op de volgende pagina, 'resultaten per bord' worden de gegevens voor elke plaat afzonderlijk weergegeven in een kleurcodes met multi-well plate-indeling en in doosplaten met outliers gemarkeerd met naam en beeldnummer. Deze laat toezicht en identificatie toeAfwijking van afwijkende gegevenspunten (extreem hoge of lage waarden vergeleken met de gemiddelde waarden gemeten voor die specifieke behandeling - zie figuur 4 voor een voorbeeld).
Gebruik deze informatie, controleer de afbeeldingen die overeenkomen met de afwijkende punten. Als abnormaliteiten worden gedetecteerd, moeten ze verwijderd worden van de analyse. De meeste abnormaliteiten worden veroorzaakt door onjuiste segmentatie wanneer (deel) van het beeld buiten focus ligt, of wanneer zeer fluorescerende stofdeeltjes de juiste segmentatie verstoren. Extreme gevallen kunnen al snel worden gedetecteerd met behulp van het Verificatie stapelgereedschap (stap 7.5), maar in deze stap worden meer subtiele gebeurtenissen ontdekt. Als er geen duidelijke of technische reden voor de afwijkende waarde kan worden gevonden, moet de afbeelding niet uit de analyse worden verwijderd. - Optioneel: maak een nieuwe spreadsheet genaamd 'Drop.xlsx' met slechts één kolom genaamd 'Drop'. In deze kolom, geef de bestandsnamen (inclusief ".tif" extensie) van alle beelden opDie uit de analyse moeten worden verwijderd (geïdentificeerd in stap 7.5 of stap 8.6.2). Upload dit bestand met de 'invoer' pagina.
- De pagina 'resultaten hele experiment' toont de resultaten van alle platen gecombineerd. Als een dossier is geüpload, wordt dit bestand gebruikt om de opgegeven gegevenspunten uit de analyse te verwijderen.
Voor elke parameter afzonderlijk worden de gegevens genormaliseerd per plaat volgens hun respectieve controles. Gegevens uit alle platen worden dan gecombineerd, gevolgd door niet-parametrische multivariate tests uit het nparcomp-pakket 18 . Als er slechts 2 behandelingen worden vergeleken, worden twee proefproeven uitgevoerd voor het nonparametrische Behrens-Fisher probleem. Voor meer dan 2 behandelingen wordt een niet-parametrische contrast gebaseerde meervoudige vergelijkingstest gebruikt. De resultaten worden visualiseerd met behulp van boxplots. - De pagina 'cluster analyse' toont de resultaten van een hoofdcomponentanalyse (PCA - R core 'stats' pakket). Gegevens uit 5 parameters (baSal & geïnduceerde ROS, en mitochondriale membraanpotentieel, grootte en cirkelvormigheid) worden gecombineerd om de verschillende behandelingen te onderscheiden op basis van een gevoelig redoxprofiel. Hiertoe wordt een hoofdcomponentanalyse (PCA) uitgevoerd (R core 'stats' pakket). De resultaten worden visualiseerd met behulp van een biplot (ggbiplot pakket - http://github.com/vqv/ggbiplot).
- Gebruik de 'download data' pagina om de backend data frames te downloaden die de verwerkte en herschikt data bevatten, zodat ze hergebruik kunnen worden voor meer geavanceerde data visualisatie of statistische analyses.
OPMERKING: Typische valkuilen en mogelijke oplossingen staan vermeld in tabel 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De test is getest met behulp van verschillende controle experimenten, waarvan de resultaten worden beschreven in Sieprath et al. 1 . In het kort is de fluorescentie reactie van CM-H2 DCFDA en TMRM op extrane geïnduceerde veranderingen in respectievelijk intracellulaire ROS en Δψm , gekwantificeerd om het dynamische bereik te bepalen. Voor CM-H 2 DCFDA vertoonde NHDF een lineaire toename in fluorescentiesignaal wanneer behandeld met toenemende concentraties TBHP tussen een bereik van 10 μM tot 160 μM. Ook voor TMRM bleek NHDF-cellen een lineaire toename van mitochondriale fluorescentie wanneer ze werden behandeld met toenemende concentraties oligomycine (die induceert Δψm hyperpolarisatie) binnen een gebied van 1 tot 10 μg / μl. Omgekeerd, real-time toevoeging van valinomycine, een antibioticum dat Δψ m depolarisatie induceert, resulteerde in een geleidelijke, kwantitatieveOmkeerbare afname van TMRM fluorescentie .
De test is ook gebruikt in een verscheidenheid aan experimenten om verschillen in redoxstatus tussen celtypes of behandelingen 1 , 15 te onthullen. Om dit te illustreren worden de resultaten getoond van een experiment waarbij NHDF werd behandeld met de HIV protease-remmer Saquinavir (SQV) ( Figuur 5 ). Met behulp van het beschreven protocol werd een significante toename gedetecteerd voor zowel basale als geïnduceerde ROS niveaus in vergelijking met controle cellen behandeld met DMSO ( Figuur 5B ). SQV-behandeling heeft ook een significante invloed gehad op mitochondriale morfofunctie. Morfologisch verwierf mitochondria een zeer gefragmenteerd patroon, dat ook werd bevestigd door een hogere cirkelvormigheid en kleinere gemiddelde grootte van de individuele mitochondria. Functioneel, Δψ m , gemeten als gemiddeld TMRM signaal per mitochOndrial pixel werd ook aanzienlijk verhoogd ( figuur 5A ). Bij het combineren van de gegevens van de 5 hierboven beschreven parameters, kunnen de twee voorwaarden (controle en SQV) duidelijk onderscheiden worden door middel van hoofdcomponentanalyse. Gegevens uit drie onafhankelijke biologische replicaten worden getoond in een 2D-biplot waarin de eerste twee hoofdcomponenten worden weergegeven, die 81,4% van de totale variantie uitleggen ( Figuur 5C ). Dit bewijst de robuustheid van de test en suggereert dat de gecombineerde uitlezing kan dienen als een gevoelige indicator voor de cellulaire gezondheidsstatus.
Figuur 1 : Algemeen overzicht van de High-content Imaging Assay voor gelijktijdige meting van intracellulaire basale en geïnduceerde ROS-niveaus en mitochondriale morfofunctie. ( A ) SChemische representatie van de belangrijkste operationele blokken. ( B ) Geïllustreerd voorbeeld: cellen worden geplant in meerdere identieke 96-putjes platen. Een standaard well plate layout is meer gedetailleerd weergegeven in Figuur 2A . Na het vullen worden 4 beelden per kanaal in het midden van elke put verkregen, zowel voor en na TBHP- behandeling, die geïllustreerd wordt door de grote montages met ingangen. Na beeldanalyse worden de intensiteitsresultaten weergegeven met behulp van een intuïtieve warmtekaart die geprojecteerd wordt op de plaatplaat. Dit maakt het snel detecteren van plaatseffecten of afwijkende putjes mogelijk. Na afronding van de volledige experimentele datasets wordt de einddata-analyse uitgevoerd, die resulteert in single- en multi-parameter output. (Dit cijfer is gewijzigd van referentie 1 , met toestemming van Springer) Klik hier om een groter versio te bekijkenN van deze figuur.
Figuur 2 : Een typische experimentele 96-puts-lay-out en het corresponderende 'Setup'-bestand. ( A ) 4 verschillende condities worden homogeen verdeeld over de binnenste 60 putten van de plaat. Nou, B01 bevat ook cellen, maar wordt alleen gebruikt om de initiële PFS-compensatie net voor beeldvorming aan te passen. De andere buitenputten worden alleen gevuld met kweekmedium om de gradiënten (temperatuur, vochtigheid, enz. ) Tijdens de celcultuur te minimaliseren. Beeldverzameling gebeurt op een meanderende manier, dwz eerst van links naar rechts, van goed B02 tot B11, dan terug, van rechts naar links, van put C11 tot C02 enzovoort. Na het verkrijgen van een beeld worden platte veldbeelden verworven in put A01, die gebruikt wordt voor het corrigeren van ruimtelijke verlichtings heterogeniteit tijdens beeld en ANALYSE. ( B ) Het bijbehorende instellingsbestand (Setup.xlsx) is een spreadsheet die informatie bevat over de lay-out van het experiment. Het specificeert de locaties van elke behandeling in de multiwellplaat en hun respectieve controles. Elke rij staat voor een putje. Elke behandeling heeft zijn eigen unieke behandelingsnummer, die gebruikt wordt om de volgorde van de behandelingen op de X-as van de gegenereerde percelen te specificeren tijdens data-analyse. De kolom 'Beheer' bevat de behandeling die moet worden gebruikt als controle voor het normaliseren van de gegevens van de behandeling die in dezelfde rij wordt vermeld. In het voorbeeld is behandeling 1 de behandeling die gebruikt wordt als controle voor het normaliseren van de gegevens van alle andere behandelingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
9 / 55449fig3.jpg "/>
Figuur 3 : RedoxMetrics Macro-set, Lay-out en Setup Interface. ( A ) Wanneer de macro-set van RedoxMetrics voor FIJI is geïnstalleerd, wordt in het menubalk een aantal nieuwe macroopdrachten en een set actieprogramma's voor het testen en optimaliseren van de analyse-instellingen gemaakt. 'S' maakt de configuratie-interface aan. 'F' voert een flatfieldcorrectie uit op een open beeld. 'C' en 'M' voeren een testsegmentatie voor cellulaire gebieden uit ("Cell", CM-H2DCFDA kanaal) en mitochondriale gebieden ("Mito", TMRM kanalen) respectievelijk op een enkel geopend beeld met behulp van de analyse instellingen die zijn geselecteerd in de setup Interface, die een overlay van de gesegmenteerde regio's van belang (ROI's) teruggeven. '#' Voert batchanalyse uit in een map met afbeeldingen met behulp van de instellingen die zijn opgegeven in de setup-interface (meestal na verificatie op een of een paar afbeeldingen). 'V' creëert een verificatie hyperstack usinG de uitvoergegevens van de batchanalyse. Deze hyperstack is een samengesteld beeld van alle ruwe beelden die aanwezig zijn in de map en hun respectieve regio's van belang (getekend in een tweede kanaal). 'O' kan worden geklikt om de overlay van het gesegmenteerde gebied te tonen of te verbergen. ( B ) Setup interface. Hier worden alle analysemogelijkheden geselecteerd, inclusief algemene informatie, zoals het beeldtype (extensie), aantal kanalen (golflengten) en de bron die gebruikt werd voor flatfieldcorrectie. Vervolgens zijn er instellingen die specifiek zijn voor het beeldinhoudstype (Cell of Mito). In beide gevallen zijn er opties (checkboxes) die een achtergrondcorrectie ("achtergrond") en lokale contrastverbetering ("contrast") bevatten. Voor celsegmentatie is er de mogelijkheid om een Gaussische vervagingstraal (sigma) te definiëren voor het verminderen van geluid. Voor mito segmentatie is er de mogelijkheid om de radius van een Laplacian operator te bepalen voor selectieve verbetering van de mitochondria. De volgende segmentatie is pGeformatteerd met behulp van een automatische (of vaste) drempelmethode die per inhoudstype kan worden gedefinieerd. Wanneer een vaste drempel is gekozen, kan de bovenste drempelwaarde handmatig worden toegewezen. Tenslotte kan de analyse worden beperkt tot een selectie van objecten die binnen een minimum en maximale grootte vallen. ( C ) Een voorbeeld van een segmenteringsresultaat als run met de opdracht 'C' (bovenste) of 'M' (bodem), weergegeven als de ruwe afbeelding in grijs overlaid met de regio's die van belang zijn voor geel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4 : Geïllustreerde Voorbeeld van Intermediate Data Visualisaties. ( A ) Multiwell plaat visualisatie waar putten B02 en D07 verschijnenverdacht. ( B ) Boxplot die dezelfde gegevens vertegenwoordigt, met de afwijkers gemarkeerd met naam en naam van de naam. Samen met F03_0003 verschijnen beelden van B02 en D07 als afwijkers. ( C ) De visuele inspectie van deze beelden laat zien dat B02_0000 en D07_0001 uit verdere analyse moeten worden verwijderd omdat er segmenteringsfouten zijn (geïllustreerd door het rode 'X'). F03_0003 moet worden bewaard omdat er geen zichtbare segmentatie of technische fout is. (Indien er geen technische reden is voor de afwijking, moeten de gegevens niet verwijderd worden). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5 : Effect van Saquinavir (SQV; 20 μM) op Primaire Menselijke FibrOblasts (controle is DMSO). ( A ) Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨ m ) en mitochondriale morfologie (circulaire en gemiddelde grootte van individuele mitochondria), gemeten door TMRM ( B ) Verhoogde basale niveaus van intracellulaire ROS zoals gemeten door CM-H 2 DCFDA en respons tegen geïnduceerde ROS, gemeten Als relatieve winst in intensiteit na toevoeging van 20 μM TBHP toevoeging. ( C ) 2D scatterplot van de eerste 2 hoofdcomponenten (PC's) uit een PCA-analyse op de 5 hierboven beschreven variabelen (basale en geïnduceerde ROS-niveaus, gemiddelde mitochondriale grootte, circulariteit en ΔΨ m ). De zwarte pijlen vertegenwoordigen de aanwijzingen van de oorspronkelijke 5 variabelen ten opzichte van de hoofdcomponenten. (Onafhankelijke replicaten zijn met een andere kleur getekend; alle gegevens zijn genormaliseerd met betrekking tot de DMSO-controle; * = p waarde <0,05; ** = p waarde <0,01; *** = p waarde <0,001; het bereik van de Y -Assen zijn aangepast om de verschillen optimaal weer te geven; Dit cijfer is gewijzigd van referentie 1 , met toestemming van Springer) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Probleem | Potentiële reden | Mogelijke oplossing |
| Te weinig cellen in de putten tijdens beeldvorming | Te weinig cellen gepoederd | Zaad meer cellen 24 uur voor afbeelden |
| Slechte celgroei | Controleer de kweekomstandigheden (medium, temperatuurstabiliteit, CO 2 -regeling) | |
| Te gewelddadige wasstappen | Vermijd de wassen van cellen weg, pipet voorzichtig | |
| Te veel cellen in de putten tijdens beeldvorming | TeVeel cellen gepoederd | Zaad minder cellen 24 uur voor beeldvorming |
| Zwakke signalen of niet-lineaire respons van CM-H 2 DCFDA fluorescentie naar stimulus | Gebruikte te lage / hoge kleurstofconcentratie | Als u andere dan NHDF-cellen gebruikt, moeten optimale belastingconcentraties empirisch worden bepaald |
| Kleurstofbelasting is onvoldoende | Voeg 0,02% w / v van het surfactant Pluronic-127 toe aan de laadoplossing om de opname te verhogen. | |
| CM-H 2 DCFDA-signaal stijgt visueel tijdens de belichtingstijd | Te hoge kleurstofconcentratie | Verminder kleurstofconcentratie |
| Excitatie-intensiteit is te hoog | Verminder de intensiteit van de excitatie door gebruik te maken van ND-filters en / of de belichtingstijd te verminderen | |
| CM-H 2 DCFDA-intensiteit neemt af tijdens de aanschaf van de putplaat | CM-H 2 DCFDA lekt uitde cel. | Gebruik 2 mM Probenicide (anionpompremmer). Voeg toe aan de laadoplossing, evenals de afbeeldingsbuffer om lekkage te verminderen |
| Er is geen toename van CM-H 2 DCFDA signaalintensiteit na toevoeging van TBHP | TBHP is niet actief | Gebruik verse TBHP |
| CM-H 2 DCFDA lekt uit de cel. | Gebruik Probenicide zoals hierboven beschreven. | |
| (Sommige van de) verworven beelden lijken buiten de focus te zijn, terwijl de focus goed lijkt als het wordt gecontroleerd. | De plaat is kantelbaar gemonteerd waardoor de focus verder gaat dan de PFS-offset | Controleer de montage van de plaat en het podiumniveau. Plaats de plaat opnieuw |
| De bodem van de plaat bevat stof of onregelmatigheden | Maak de bodem van de plaat schoon met een metalen vetpapier | |
| Cellen sterven tijdens beeldvorming | Verminder de intensiteit van de excitatie of krijg minder beelden per put. | |
| Verkeerde imaging-buffer samenstelling | Remake imaging-buffer | |
| Er zijn geen fluorescent spots in de afbeeldingen | Vrijstaande cellen zweven buiten focus | Was zachtder tijdens het laadprotocol |
| Een of meer kolommen hebben een lagere intensiteit dan de andere putten van de plaat | Een of meer tips van de multichannelpipet waren niet stevig vastgemaakt en daarom werd minder verslaggever bij deze putjes toegevoegd | Controleer of alle tips perfect worden ingevuld wanneer u een multikanaalspipet gebruikt. |
| Focus draait dramatisch tijdens het maken van beelden | De polystyreenbodem van de plaat kan reageren met onderdompelingsolie bij gebruik van een olie lens | Gebruik een droge lens of gebruik een multiwellplaat met glazenZoals onderaan |
| De TMRM signaalintensiteit neemt toe tussen het imago van de eerste en laatste put | De laadtijd van de verslaggever was niet lang genoeg, TMRM is nog steeds evenwichtig | Verhoog de laadtijd van de verslaggever |
| CM-H 2 DCFDA-signaal na TBHP-behandeling neemt toe tijdens het verwerven van de putplaat | De tijd tussen de behandeling met TBHP en het begin van de tweede afbeeldingsronde was niet lang genoeg, TBHP is nog steeds oxiderende CM-H 2 DCFDA. | Verhoog de incubatietijd tussen de behandeling met TBHP en de tweede afbeeldingsronde. (Begin met minstens 3 minuten) |
| Platte veldbeelden zijn verzadigd | Antibody werkoplossing is geconcentreerd | Gebruik een lagere concentratie van antilichaam werkoplossing |
| Acquisitie instellingen zijn niet geoptimaliseerd (belichtingstijd tot hoog, ND-filter naar laag, ...) | Optimaliseer acquisitie-instellingen,Het signaal moet in het dynamische bereik van de sensor liggen | |
| Platte veldbeelden zijn donker | Antibody werkoplossing moet verdund worden | Gebruik een hogere concentratie van antilichaam werkoplossing |
| Acquisitie instellingen zijn niet geoptimaliseerd (belichtingstijd tot hoog, ND-filter naar laag, ...) | Optimaliseer acquisitie-instellingen, het signaal moet in dynamisch bereik van de sensor zijn | |
| Over / Undersegmentatie artefacten | Drempel niet correct ingesteld | Stel de drempelinstelling in |
| Grootte filters niet correct aangepast | Pas de minimale en maximale maatcriteria voor beeldanalyse aan | |
| Cell confluency is te hoog | Het juiste niveau van samenhang is zeer belangrijk voor betrouwbare beeldanalyse. Voor andere celsoorten dan NHDF moet de optimale zaaldichtheid empirisch worden bepaald | |
| De glanzende toepassing werkt niet | Verkeerde map geselecteerd | Kies de juiste map op de invoerpagina. |
| Ontbrekende bestanden in de map | Zorg ervoor dat alle benodigde bestanden (output van imagej macro en setup file) aanwezig zijn in de geselecteerde directory | |
| Ontbrekende pakketten | Normaal gesproken controleert en installeert de app alle benodigde pakketten, maar als dit mislukt, controleer dan handmatig de volgende pakketten: devtools, ggbiplot, pacman, ggplot2, plyr, nparcomp, data.table, readxl, gplots, ggbiplot, glanzend, glanzend, glanzend, glanzend En shinyjs inclusief alle afhankelijkheden. |
Tabel 1: Typische valkuilen en mogelijke oplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit document beschrijft een microscopiemethode met hoge inhoud voor de gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus en mitochondriale morfofunctie in NHDF. Zijn prestatie werd aangetoond met een casestudy over SQV-behandelde NHDF. De resultaten ondersteunen eerder bewijs uit de literatuur waarin verhoogde ROS niveaus of mitochondriale dysfunctie zijn waargenomen na behandeling met type 1 HIV protease remmers, zij het in afzonderlijke experimenten 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . Het belangrijke verschil is dat de beschreven test deze parameters tegelijkertijd in dezelfde levende cellen kan meten, samen met morfologische gegevens. Het grote voordeel van deze aanpak is de ondubbelzinnige bepaling van beide factoren in de ruimte en tIme, die het mogelijk maakt om causale relaties te bepalen. Een hoofdcomponent analyse wordt uitgevoerd die het mogelijk maakt om een gevoelig redox profiel van specifieke verstoringen te genereren. Echter, meer geavanceerde data mining technieken en (gecontroleerde) clustering algoritmen kunnen ook worden gebruikt op de geëxtraheerde data om predictieve redox profilering mogelijk te maken. Dit kan een waardevol kenmerk zijn voor diagnostische of prognostische classificatietools in digitale pathologie, evenals bij het screenen voor therapeutische doelen, bijvoorbeeld wanneer er een duidelijke classificatiemodel wordt gemaakt, kunnen kleine molecuulbibliotheken worden gescreend om therapeutische kandidaten te vinden om oxidatieve stress tegen te gaan, analoog aan Een recent scherm voor veelbelovende leidingen in therapieontwikkeling voor humane mitochondriale aandoeningen 26 .
De test werd opgesteld voor NHDF, maar kan aangepast worden aan andere aanhechtende celtypes. Dit vereist optimalisatie van het kleurprotocol en reporter kleurstofconcentraties. De hoeveelheid r Eporter kleurstof moet worden geminimaliseerd, aangezien overbelasting kan leiden tot niet-lineaire effecten door blussen of zelfs worden cytotoxische 27 . Uitbreiding van de analyse naar suspensiecellen is minder voor de hand liggend vanwege de moeilijkheden met het opbouwen en observeren van dergelijke cellen op een fysiologische wijze. Ze kunnen cytospun op een deklaag of in serumvrije media worden gekweekt om adhesie te veroorzaken, maar beide van deze processen interfereren met fysiologische condities 28 , 29 . Echter, deze beperkingen zouden kunnen worden overwonnen door gebruik te maken van micropatenteerde celkweeksteunen die individuele cellen (aanhechtend of niet-aanhechtend) houden, opgesloten in kleine microputjes, terwijl ze hun levensvatbaarheid 30 handhaven of door gebruik te maken van een thermo-omkeerbare hydrogel om cellen te laten vallen tijdens beeldvorming 31 . Deze methoden zijn al gebruikt voor het screenen van plasmamembraanpotentiaal, of cellulaire zuurstof in afzonderlijke suspensiecellen= "Xref"> 32 , 33 of het imaging van intracellulaire markers in de levende, zeer motiele parasieten 31 . Aanpassingen zouden ook moeten worden gemaakt aan de beeldvormingsmodaliteit, aangezien morfologische analyse van het mitochondriale netwerk in deze cellen snelle 3D-acquisitiemogelijkheden zou vereisen, zoals de confocal of Bessel beam-lichtmicroscopie 34 , 35 , alsmede de analyse Pijpleiding, om de Z-dimensie op te nemen bij het berekenen van morfologische parameters.
De test werd geoptimaliseerd voor 96-putjes platen, maar het is uiteraard vatbaar voor verdere opschaling, bijv. Aan 384-putjes. De belangrijkste beperkende factor is de plaatverwervingstijd, dat wil zeggen de tijd die nodig is om beelden van alle putten te verkrijgen. De fluorescente signalen moeten gedurende dit tijdsbestek stabiel blijven om met elkaar de metingen te kunnen vergelijkenIndividuele putten. Maar omdat de kleuring transient is en het proces dat wordt onderzocht dynamisch is, is dit een uitdaging. Daarom werden de fluorescente signalen gemeten in een reeks gerepliceerde experimenten en dit bleek dat zowel CM-H 2 DCFDA als TMRM signalen stabiel blijven van 7 tot ten minste 50 minuten na kleuring (coëfficiënt van variatie <2%). Dit geeft een venster van ongeveer 40 minuten. Een plaat van 96 putjes duurt ongeveer 10 minuten. Zo zou een extrapolatie naar 384-putplaten de verwervingsduur binnen de stabiele tijdsleuf houden. Met een gemiddelde van 50 cellen per beeld (gebaseerd op het gebruik van een 20X objectief en NHDF cellen) zou dit resulteren in gegevens voor ongeveer 30.000 cellen per uur van screening, die sterk toevoegt aan de statistische kracht van de test. Een andere factor die de fluorescerende signaalstabiliteit beïnvloedt is de temperatuur. Om vacuolisatie van CM-H 2 DCFDA (dwz accumulatie van kleurstof in intracellulaire vesicles) te vermijden, wat zou leiden tot heteroGeneuze kleuring en niet-lineaire effecten, vindt de incubatie plaats bij kamertemperatuur in plaats van 37 ° C. Afgezien van stabiliteit is het belangrijk om op te merken dat de blootstelling van levende cellen aan fluorescentie-excitatie licht zelf de productie van ROS veroorzaakt. Dit houdt in dat de blootstellingsomstandigheden (blootstellingstijd en lichtintensiteit van de excitatie) op een absoluut minimum moeten worden gehouden. Het betekent ook dat alle putjes alleen mogen worden blootgesteld wanneer de werkelijke afbeeldingen worden verworven. Dit regelt het gebruik van software-geautomatiseerde autofocusmethoden en garandeert het gebruik van een hardware-based autofocus systeem.
Een voordeel van de beschreven methode is het generieke karakter ervan. Bijna elke combinatie van spectraal compatibele fluorescerende verslaggevers kan worden gebruikt. Dit werd aangetoond door gebruik te maken van de Calcein / MitoSOX combinatie om mitochondriale ROS per levende cel 1 , 15 te meten. Bovendien zijn de applicaties niet beperkt tot de int Geëgrateerde ROS / mitochondriale meting. De test kan ook worden uitgebreid met een post-hoc immunostaining (na de tweede afbeeldingsronde). Aangezien de exacte afbeeldingslocaties zijn opgeslagen, kunnen redoxanalyses direct gecorreleerd worden met locatieproteomics in dezelfde cellen. Dit vergroot de moleculaire uitlezing sterk, wat sterk in contrast staat met andere methoden die vaak gebruikt worden om redoxbiologie of fluorescentieintensiteiten in het algemeen te beoordelen. Bijvoorbeeld, fluorimetrie (microplate reader) wordt veel gebruikt als gevolg van zijn relatief lage kosten (basisinstelling beschikbaar voor zo laag als € 4000) en ondiepe leercurve, maar als een zwarte doos is het meer vatbaar voor confounding factoren zoals variaties in Celdichtheid of achtergrond (auto-) fluorescentie, bijv. Van vervuilende stofdeeltjes. Bovendien kunnen plaatlezers geen extrahering van morfologische parameters toestaan, ze kunnen geen enkele cellen meten en zijn minder gevoelig en betrouwbaar om dynamische of transiënte signalen te metenLass = "xref"> 36 , 37 . Flowcytometrie heeft de capaciteit om enkele cellen te meten en heeft het voordeel van snelheid. Inderdaad kan een 384-putjesplaat zo min als 12 minuten worden gescreend met hoge gevoeligheid voor meerdere markers 38 . Dit is veel sneller dan wat mogelijk is met widefield microscopie. Maar er wordt nog geen spatiotemporale informatie verstrekt ( dwz subcellulaire lokalisatie, morfologische data en / of tijdafhankelijke kinetiek), en laat ook niet dezelfde cellen tijdens of na een behandeling (dwz in fluxo) herhalen . Bovendien moeten cellen in suspensie zijn, waardoor flowcytometrie minder geschikt is om de fysiologie van aanhechtende cellen te bestuderen. Belangrijkste nadelen van high-content microscopie in vergelijking met de andere methoden zijn de behoefte aan grote beeld data opslag, intensieve verwerkende kracht en complexe beeldanalyses. De gepresenteerde test normaliseert het proces voor het verkrijgen van beelden en stroomlijnt de analyseS om deze verwerkingstijd te minimaliseren, het gebruiksgemak te verhogen en daarom de analyse toegankelijker te maken.
Ten slotte, en specifiek voor het gebruik van CM-H 2 DCFDA en TMRM, is de beschreven redox-profileringsmethode robuust, gevoelig en betrouwbaar. Door zijn multiparametrische en kwantitatieve aard is het superieur aan andere fluorescentie gebaseerde methoden. Zo kan het helpen om de relatie tussen mitochondriale functie en intracellulaire ROS signalering te verduidelijken, wat essentieel is voor het beter inzicht krijgen in een breed scala aan pathologieën waarin de redox homeostase wordt verstoord. Bovendien, door zijn generieke karakter, kan de test toepassingen ver boven de oorspronkelijke omvang ervan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs stellen dat er geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten zijn. De bijbehorende auteur zorgt er ook voor dat alle auteurs gevraagd zijn om alle belangenconflicten bekend te maken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 mL | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1 M 500 mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20X objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
- Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
- Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
- Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
- Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
- Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
- Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
- Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology? Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
- Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
- Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
- Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
- Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).
- Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , https://CRAN.R-project.org/package=shiny (2017).
- Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
- Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
- Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
- Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
- Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
- Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
- Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
- Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
- Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
- Invitrogen. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
- Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
- Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
- Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
- Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
- Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
- Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
- Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
