Summary
Aqui, descrevemos modelos peixe-zebra xenotransplante usando dois locais de injecção diferentes, ou seja, espaço perivitelínico e duto de Cuvier, para investigar o comportamento invasivo e avaliar a intravasation e extravasamento potencial das células de câncer de mama humanos, respectivamente.
Abstract
Em muitos casos, pacientes com câncer não morrer de um tumor primário, mas sim por causa da metástase. Embora numerosos modelos de roedores estão disponíveis para estudar a metástase do cancro in vivo, outros modelos eficientes, fiáveis e de baixo custo são necessários para aceder rapidamente os efeitos potenciais de (epi) alterações genéticas ou compostos farmacológicos. Como tal, nós ilustrar e explicar a viabilidade de modelos de xenoenxerto utilizando células de cancro da mama humanas injectadas em embriões de peixe-zebra para suportar este objectivo. Sob o microscópio, proteínas fluorescentes ou células de cancro da mama humano quimicamente marcados são transplantadas em embriões de peixes-zebra transgénicos, Tg (fli: EGFP), no espaço perivitelino ou ducto de Cuvier (DOC) 48 h após a fertilização. Pouco depois, o processo temporal-espacial da invasão da célula cancerosa, disseminação e metástase no corpo do peixe vivo é visualizada sob um microscópio fluorescente. Os modelos que utilizam diferentes locais de injecção, isto é, porespaço ivitelline ou doe são complementares um ao outro, o que reflecte a fase inicial (passo intravasamento) e fase tardia (passo extravasamento) da cascata metastática de várias etapas de eventos. Além disso, a angiogénese peritumoral e intratumoral pode ser observada com a injecção no espaço perivitelino. O período experimental todo não mais do que 8 dias é. Estes dois modelos combinam marcação celular, micro-transplante, e as técnicas de imagiologia de fluorescência, permitindo a avaliação rápida de metástase do cancro em resposta a manipulações genéticas e farmacológicas.
Introduction
metástase do cancro manifesta na clínica compreende uma série de eventos complexos e multi-passo conhecido como o "cascata metastática". A cascata tem sido extensivamente revisado e pode ser dissecado em etapas sucessivas: a invasão local, intravasation, difusão, Detenção, extravasamento e colonização 1, 2. Uma melhor compreensão da patogênese da metástase do câncer e o desenvolvimento de potenciais estratégias de tratamento in vivo requerem modelos de acolhimento robustas de disseminação de células cancerígenas. Modelos de roedores estão bem estabelecidos e são largamente utilizados para avaliar a metástase 3, mas estas abordagens têm baixa eficiência e limitações éticos e são dispendiosos como um modelo de vanguarda para determinar se uma manipulação particular poderia afectar o fenótipo metastático. Outros modelos eficaz, fiável e de baixo custo são necessários para aceder rapidamente os efeitos potenciais de (epi) alterações genéticas ou pharmacologcompostos ical. Devido à sua elevada homologia genética para os seres humanos e a transparência da sua embriões de peixe-zebra (Danio rerio) têm emergido como uma importante modelo de vertebrado e estão a ser cada vez mais aplicada ao estudo de processos de desenvolvimento, interacções micróbio-hospedeiro, doenças humanas, o rastreio de fmacos, etc. . 4. Os modelos de metástase cancerosa estabelecidos no peixe-zebra pode proporcionar uma resposta às deficiências dos modelos de roedores 5, 6.
Embora neoplasia espontânea é dificilmente visto em peixes-zebra selvagem 7, existem várias técnicas de longa data para induzir o cancro desejado em peixes-zebra. Mutações de genes induzida por carcinogénico ou activação da via de sinalização pode histologicamente e carcinogénese modelo molecularmente, simulando doença humana em peixes-zebra 7, 8, 9. por taking vantagem de diverso para a frente e reverso manipulações genéticas de oncogenes ou supressores de tumor, (transgénicos) do peixe-zebra também permitiram potenciais estudos de formação e de manutenção 6, 10 cancro. Os modelos de cancro induzidos em peixes-zebra cobrir um largo espectro, incluindo digestivo, reprodutivo, sangue, sistema nervoso, epitelial e 6.
A utilização do peixe-zebra na pesquisa do câncer recentemente expandiu devido ao estabelecimento de modelos de xenotransplante de células tumorais humanas neste organismo. Este foi relatada pela primeira vez com células de melanoma humano metastático que foram enxertadas com sucesso em embriões de peixe zebra na fase de blástula em 2005 11. Vários laboratórios independentes validada a viabilidade deste trabalho pioneiro através da introdução de uma grande variedade de linhas de células cancerosas de mamífero em peixes-zebra em vários locais e estágios de desenvolvimento 5 </ Sup>. Por exemplo, injecções perto do blastodisco e blastocisto da fase de blástula; injecções no saco vitelino, espaço perivitelino, ducto de Cuvier (DOC), e veia cardinal posterior de 6-h- de embriões de 5 dias de idade; e injecções na cavidade peritoneal de larvas imunossuprimidos de 30 dias de idade, foram realizados 5, 12. Adicionalmente, os transplantes de tumor alogénico também foram relatados em peixes-zebra 12, 13. Uma das grandes vantagens da utilização de xenoenxertos é que as células cancerosas enxertada pode ser facilmente marcado por fluorescência e distinguido a partir de células normais. Por conseguinte, as investigações sobre os comportamentos dinâmicos de formação microtumor 14, a invasão de células e metástase 15, 16, 17, a angiogénese induzida por tumores 15, 18, e as interacções entre as células cancerosas e factores do hospedeiro 17 pode ser claramente visualizada no corpo do peixe vivo, especialmente quando as linhas de peixes-zebra transgénicos são aplicados 5.
Inspirado pelo alto potencial de modelos de xenoenxerto de peixe-zebra para avaliar metástases, que demonstraram as propriedades de extravasamento transvascular de diferentes linhas celulares de cancro da mama na área de tailfin de Tg (fli: EGFP) embriões de peixe-zebra através de injecções Doc 16. O papel do factor de crescimento transformante-β (TGF-β) proteína de 16 e osso morfogenética (BMP) 19 vias de sinalização na invasão de células de cancro da pró / anti-mama e de metástases foram também investigados neste modelo. Além disso, também a capacidade recapitulado intravasamento de várias linhas celulares de cancro da mama em circulação, utilizando modelos de xenoenxerto de peixe-zebra com injecções espaço perivitelino.
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Protocol
Todas as pesquisas usando o transgênico fluorescente Tg peixe-zebra (FLI: EGFP) tensão, que tem reforçado a proteína verde fluorescente (EGFP) marcado com vasculatura 20, incluindo a habitação e os experimentos, foi realizado de acordo com as diretrizes internacionais e foi aprovado pelo Comitê Institucional local for animal Welfare (Dier Ethische Commissie (DEC) do Centro Médico da Universidade de Leiden.
NOTA: Como resumido na Figura 1, o protocolo é aproximadamente dividido em quatro passos: colheita de embriões (Figura 1A), micro-injecção (Figura 1B), de rastreio (Figura 1C), e análise (Figura 1D).
1. Prepare as agulhas da injeção
- Prepare agulhas de injecção com microcapilares de vidro de borosilicato. Coloque um microcapilar para um dispositivo de puxador de micropipeta com as seguintes definições: pressão de ar, 500; calor, 650; puxar, 100; velocidade, 200; Tempo,40. Mantenha as agulhas de injecção em uma placa de suporte de agulha até que eles são usados para injecção.
2. Preparar as fluorescentes, geneticamente marcadas Células de cancro da mama para Injecção
- cancro da mama humano MDA-MB-231 células de cultura a 37 ° C em meio DMEM-elevado teor de glucose contendo L-glutamina, soro de bovino fetal a 10%, e 1: 100 de penicilina-estreptomicina (pen-strep).
- Cultura das linhas epiteliais da mama celulares, MCF10A (M1) e MCF10A-Ras (M2), a 37 ° C em meio DMEM / F12 contendo L-glutamina, com soro de cavalo a 5%, / factor de crescimento epidermal 20 ng mL, 10 mg / mL insulina, 100 ng / mL de cólera enterotoxina, 0,5 mg / mL de hidrocortisona, e 1: 100 pen-strep.
- Produzir mCherry lentivírus por co-transfecção de VLP-mCherry, pCMV-VSVG 21, pMDLg-RRE (gag / pol) 22, e pRSV-AP 22 plasmídeo em células HEK293T. sobrenadantes de células de colheita 48 h após a transfecção e armazenar a -80 ° C.
- Eunfect células MDA-MB-231, M1, M2 e, em 30% de confluência, durante 24 horas com sobrenadantes de lentivírus diluída 1: 1 com meio de cultura normal, na presença de 5 ng / mL de polibreno.
- Seleccionar os clones de uma única célula por células diluição numa placa de 96 poços, o que permite o crescimento de clones de células isoladas, até obter as linhas celulares que expressam mCherry estáveis.
- Cultura balão de um T75 de células para injecção. Colheita das células a 80% de confluência com um tratamento tripsina-EDTA a 0,5%. Lavam-se as células com PBS 1x 2-3 vezes.
- Re-suspender as células em cerca de 200 ul de PBS. Armazenar a 4 ° C-los para menos do que 5 h antes da injecção.
3. Prepare embriões Zebrafish por injeção
- Defina-se casais de peixe-zebra e recolher embriões, como mostrado num artigo anterior JoVE por Rosen et al. 23.
- Selecione os embriões que estão em 0-4 hpf, removendo os embriões não fertilizados e anormais. Manter os embriões em um dis Petrih cheio de água ovo (sais do mar / ml 60? g; ~ 60 embriões / prato) e incubar a 28 ° C.
- Dechorionate os embriões com uma pinça fina aos 48 hpf.
- Anestesiar os embriões, transferindo-os para 40 ug / ml tricaina (ácido 3-aminobenzóico) contendo água ovo aproximadamente 2 minutos antes de injecção, mas não mais do que 2 horas antes da injecção.
NOTA: solução estoque tricaina (4 mg / mL, 100x) é preparado tal como 400 mg de pó tricaina em 97,9 mL de água duplamente destilada e 2,1 mL de 1 M de Tris-base (pH 9), com o pH ajustado para 7,4. Armazenar na -20 ° C congelador.
4. Injectar Humanos Células de cancro da mama no espaço perivitelino
- Carga de 15 mL da suspensão de células para uma agulha de injecção. Montar a agulha na micromanipulador e parta a ponta da agulha com uma pinça fina para obter um diâmetro de 5-10? M de abertura de ponta.
- Use um picopump pneumático e um manipulador para executar a microinjeção. Ajur o picopump para injectar 400 culas de cada vez. Antes da injecção, contar o número de células manualmente, injectando as células na parte superior de uma placa de Petri contendo 1% de agarose.
- Linha-se embriões anestesiados (2-3 dias após a fertilização (dpf)) em um, de 1% de agarose placa injectando plana, em torno de 10 embriões de cada vez.
- Orientar a placa de injecção à mão durante as injecções de colocar os embriões na posição preferida para a inserção da agulha (isto é, na diagonal).
- O ponto a ponta da agulha no local de injecção e suavemente inserir a ponta da agulha para dentro do espaço perivitelino entre o saco vitelino e o periderme do embrião do peixe-zebra (Figura 2A).
- Injectar aproximadamente 400 células tumorais marcadas com mCherry. Certifique-se de que o saco vitelino não é rompido para evitar a implantação dentro do saco vitelino.
5. injetar células do cancro da mama humano no doe
- Preparar a agulha de injecção e embriões de peixe-zebra como descrito i protocolo n os passos 1, 2, e 3.
- Utilizar um ângulo de 45 ° da agulha de modo que a doe pode ser aproximado a partir do lado dorsal do embrião.
- Inserir a agulha no ponto da doe (Figura 3A) de partida, apenas dorsal para que a conduta começa alargamento sobre o saco vitelino, e injectar aproximadamente 400 células; a injecção é correcta se o volume no interior da conduta se expande imediatamente após o pulso e o saco vitelino.
NOTA: Vários injecções consecutivas pode ser realizada sem a extracção da agulha. - Transferir os embriões de peixe-zebra injectados com água ovo.
NOTA: Como considerável variação existe entre embriões de peixe-zebra individuais, e como a morte dos embriões após a injecção pode ocorrer, um número relativamente grande de embriões de peixes-zebra (cerca de 100) deve ser injectado com as células cancerosas. - Manter os embriões de peixe-zebra a 33 ° C para acomodar os requisitos de temperatura óptimas para os peixes e células de mamíferos.
- Tela de cada peixe sob um estereomicroscópio de fluorescência em 2 h pós-injecção (hpi) para a injecção espaço perivitelino (Figura 2) ou em hpi 2-24 para a injecção Doc (Figura 2) para assegurar que todos os embriões foram injectados com um número semelhante de células tumorais. Remover os embriões com erros de injecção, tal como rupturas (Figura 2B) ou injecções (Figura 3B) do saco vitelino, e escolher embriões injectados com células abaixo (Figuras 2C e 3B) ou superior (Figuras 2D e 3B) limiar. Manter apenas os embriões com aproximadamente 400 células em cultura.
- Descartar a possibilidade de que as células são introduzidas diretamente em circulação durante o processo de injeção, removendo os embriões com células já em circulação. Além disso, remover qualquer embrião com uma célula de massa perto da doe (Figura 2D
7. Imagem e analisar o processo metastático
- Recolhe vários embriões anestesiados com uma pipeta de Pasteur de toda a ponta e transferi-los para o fundo de vidro de um prato de poliestireno.
- Retire o excesso de água e manter uma quantidade limitada de água ovo. Manipular o embrião em posição com uma ferramenta laço do cabelo e colocar uma tampa na parte superior do vidro.
- Usar um microscópio confocal invertido em combinação com água-imersão ou de longa distância objectivos secos. Posição do embrião de tal forma que a região de interesse é o mais próximo do objetivo possível.
- Realizar imagem imediatamente após anestesia para reduzir o risco de morte devido à evaporação do líquido.
- sinais de captura de vasculatura de EGFP-rotulado e as células tumorais mCherry-marcadas na mesma posição sobre os embriões para co-registar-se as células com os vasos sanguíneos injectado através da fusão dos dois canais de imagem.
- Para cada embrião de peixe-zebra, coletar dois conjuntos diferentes de imagensda região de cabeça e região cauda.
- Quantificar o número de células disseminadas.
- Para injecções espaço perivitelino, contar o número de células em cada peixes que tenham disseminado a partir da massa de células para o corpo do peixe embrionário dentro das regiões da cabeça e da cauda 4, 15; as regiões são para além dos limites da cavidade do coração frontalmente, no topo da bexiga dorsalmente mergulho, e para além da abertura urogenital caudalmente.
- Para a injecção doe, contar o número de células individuais que invadiram as fibras de colagénio do tailfin de circulação (MDA-MB-231) ou o número de grupos formados por células colectivamente (M2) no tecido hematopoiético caudal (CHT) de cada peixe-zebra 19.
- Estudar invasão e metástase em mais detalhe por meio de microscopia confocal (altamente recomendado).
- Use baixa ampliação (objetiva 4X) para a imagem do todocorpo e para obter uma visão geral do padrão de disseminação de células de tumor.
NOTA: ampliação Superior (20X e 40X objetivos) é adequado para estudar a angiogênese intra e peri-tumoral ea localização precisa das células disseminadas no corpo do embrião. - Utilizar um laser de 488 nm para digitalizar a vasculatura de embriões de peixe-zebra e um laser de 543 nm para fazer a varredura células tumorais implantadas marcados com fluorescência vermelha. Obter uma imagem de alta qualidade, verificando cada embrião em oito a dez passos. Digitalizar e média, cada etapa seis vezes.
- Use baixa ampliação (objetiva 4X) para a imagem do todocorpo e para obter uma visão geral do padrão de disseminação de células de tumor.
- Com cuidado, coloque o embrião de volta na água ovo se for necessário para novas experiências.
8. realizar a análise estatística utilizando a análise de variância (ANOVA) seguido por análise post hoc
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Representative Results
No modelo de xenoenxerto de peixe-zebra embrionários com uma injecção espaço perivitelino, o disseminação hemática das células cancerosas marcadas no corpo do peixe é considerado como activo migração. Este processo pode ser detectado e quantificado sob um microscópio de fluorescência, tal como descrito nos métodos acima. Para ilustrar este modelo de xenoenxerto, seguimos o processo de difusão de diferentes linhas celulares de cancro da mama com conhecida (ou sem) invasão / metástase potencial de acordo com a in vitro e em estudos com ratinhos in vivo, incluindo as células M1 benignos epiteliais normais da mama, pré-malignas HRAS-transformado células M2 e células altamente metastáticas MDA-MB-231, após a injecção 1 dia (dpi) em diante. Uma imagem de microscopia confocal de alta resolução mostraram que MDA-MB-231 (vermelho) exibem um fenótipo agressivo, com bordas irregulares no espaço perivitelínico. saliências Pseudópodes semelhante e frentes invasivos foram também frequentemente presentes (Figura 4A, esquerda). Algumas células disseminadas em circulação no sangue tão cedo como 1 dpi (figura 4A, direita). Às 2 dpi, disseminação claro foi observado nas partes distais do peixe (figura 4A, direita). O número de células disseminadas aumentou ainda mais a 3 ppp (Figura 4A e 4D). Em contraste, quando as células M2 foram desafiados no peixe-zebra, eles exibiram difusão modesta no corpo do peixe depois de 2 dpi (Figura 4B). Eles também demonstraram aumento da disseminação após o passar do tempo (Figura 4F). Tal como mostrado na Figura 4C e 4G, células M1 raramente disseminada em circulação peixe-zebra, e mesmo migração local activo dentro do espaço perivitelino foi pouco frequente durante o período de observação. A massa celular M1 foi praticamente detido no local da injeção inicial. Se a definição de difusão positiva ou metástase como> 5 células no corpo do peixess = "refex"> 4, MDA-MB-231 e M2 metástase de células foi observada em 92% e 57% dos peixes, respectivamente, em 3 dpi (Figura 4G). Em contraste, não foi observada difusão positivo com células M1. Por isso, este modelo de peixe-zebra de progressão de células de cancro humano reflete com precisão o nível relativo de potencial metastático das diferentes células em ratos. Neovascularização (verde) que brotaram a partir do plexo subintestinal do peixe-zebra embrionários e penetrou a massa de células MDA-MB-231 ou M2 também estava presente após a injecção espaço perivitelino de células de tumor, seguido de 3 dias de incubação (Figura 4A e 4B, esquerda ). Consistente com a incapacidade na divulgação, apenas ligeira neovascularização foi detectada após a implantação de células M1 (Figura 4C).
No modelo embrionário xenoenxerto peixe-zebra com células MDA-MB-231 mCherry-rotulados e a injeção Doc, o laboratóriocélulas cancerosas ELED no tailfin do peixe-zebra são consideradas representativas de extravasamento activo. As células MDA-MB-231 mCherry-marcadas foram injectados em 2 dpf. Aos 3 dpi, as células começou a migrar para fora dos vasos para o tailfin, que é enriquecido com o colagénio. Células individuais MDA-MB-231 migrou um por um, independentemente, a partir dos vasos, para a tailfin distante (Figura 5A). Aos 6 dpi, a invasão pode ser quantificada através da contagem do número de células que migraram para o tecido tailfin. No modelo de injecção doe celular M2 mCherry-marcado, a injecção também foi realizada a 2 dpf. No entanto, foi observado um fenótipo agrupado durante o processo de extravasamento activo. Em 1 dpi, células M2 começou a migrar para fora dos vasos para o CHT do peixe-zebra. Às 2 dpi, as células migradas M2 começou a formar um agrupamento entre os vasos na CHT (Figura 5B). Quantificação do número do conjunto das células invasivas M2 na região de CHT poderia ser conduzida a6 dpi.
Figura 1: Principais passos para investigar o comportamento invasivo das células cancerosas da mama em peixes-zebra embrionários. (A) Depois de atravessar peixe-zebra parental durante a noite, Tg (FLI1: EGFP) de embriões de peixes-zebra foram colhidas na manhã seguinte e foram mantidas a 28 ° C. (B) Os embriões foram dechorionated com pinças finos sob um estereomicroscópio 48 h após a fertilização (HPF). As células de cancro de mama marcadas foram recolhidas e re-suspensas numa pequena quantidade de PBS. Depois de bem-preparação, as células em suspensão foram carregados para uma agulha. Aproximadamente 400 culas foram injectadas na conduta de Cuvier (doe) do espaço perivitelino sob um estereomicroscópio. Os embriões injectados foram mantidos a 33 ° C. (C) 2 h após a injecção (hpi), os embriões foram submetidos a cArastreio REFUL sob um estereomicroscópio de fluorescência. Os embriões foram mantidas a 33 ° C durante 3 ou 6 dias. Durante o intervalo, os embriões foram submetidos ao tratamento concebido. (D) a disseminação de células do cancro por injecção espaço perivitelino ou invasão por injecção doe foi detectado, contadas e fotografadas por microscopia confocal de 3 ou 6 dias pós-injecção (dpi). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: local da injeção espaço perivitelínico e erros comuns. (A) Aproximadamente 400 culas mCherry-marcados (MDA-MB-231) foram injectadas no espaço perivitelino. O campo claro (a mais acima), vasculatura verde massa celular (média superior), e vermelho (média baixa) de injectarembriões de peixe-zebra ed foram capturadas por microscópio confocal. A imagem resultante da concentração (mais inferior) dos três canais mostra a posição estéreo da massa de células no embrião. (B) As células não alvo o espaço perivitelino apropriadamente. O saco vitelino era rompido. (C) células injectadas abaixo limiar (muito menos do que 400). (D) As células injectadas limiar acima (muito mais do que 400). A massa celular foi demasiado perto da conduta de Cuvier, que tem um largo fluxo de sangue. Escala da barra = 50 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Vista geral da conduta de Cuvier (doe) injecção. (A) Esquema da injecção doe aos 2 dias pós-fertilização (dPF) com células de cancro da mama em embriões de peixe-zebra. A seta indica o doe. (B) Os exemplos de injecções de positivos, com cerca de 400 células de cancro da mama; injecções negativas, incluindo a gema de misinjection; e um número incorrecto de células injectadas em 4 hpi. As setas e os círculos indicam células injectadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Comparação da capacidade de difusão entre as várias linhas de células da mama. Aproximadamente 400 mCherry marcado com MDA-MB-231, MCF10Aras (M2), ou MCF10A (M1), as células foram injectadas no espaço perivitelino de embriões de peixes-zebra 48 HPF. Os embriões injectados foram seguidos durante 3 dias. (A, B, e C) de alta resolução micrografias que mostram o processo de migração e difusão representativo de MDA-MB-231 (A), M2 (B), e células M1 (C) em órgãos embrionários individuais 1, 2 e 3 dias após a injecção (dpi). Esquerda, a migração de células no espaço perivitelino (vermelho) e a vasculatura peritumoral e intratumoral (verde). sinais amarelos indicam a sobreposição de microvasos e células. Média, toda a imagem do embrião. Certo, visualização de células disseminadas na posterior do embrião. setas amarelas indicam células disseminadas individuais. Escala da barra = 50 m. (D, E, e F) A quantificação do número de células disseminadas em cada corpo embrionário em 1, 2, e 3 dpi. Os resultados são expressos como a média ± SEM. Os resultados de uma análise de variância (ANOVA) seguida pela análise post-hoc são mostrados. P <0,05 foi aceite como estatisticamente significativos (* 0,01 <P <0,05; ** 0.001 <P <0,01; *** P <0,001. (G) Comparação entre as incidências de intravasation para células MDA-MB-231, M2 e M1 em corpos embrionárias em 1, 2 e 3 dpi. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Diferentes comportamentos de MDA-MB-231 e M2 metástase celular em peixe-zebra com duto de injeção de Cuvier. (A) imagens confocais representativos do peixe-zebra, seguido pelo 3, 4, e 5 dpi para mostrar o comportamento de migração de célula única de células MDA-MB-231 em peixes-zebra. As setas indicam células invasoras MDA-MB-231 que migraram para fora dos vasos nas tailfins. Barra de escala = 200 pm na coluna da esquerda, de 50 um na coluna da direita. (B) representativasimagens confocais do peixe-zebra, seguido de 1, 2, e 3 dpi para mostrar o comportamento de migração aglomerado de células das células M2 em peixes-zebra. As setas indicam células M2 invasivos que migraram para fora dos vasos para o tecido hematopoiético caudal (CHT) e formaram um conjunto entre os vasos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, são descritos dois métodos para investigar o comportamento invasivo das células cancerosas da mama em Tg (FLI1: EGFP) embriões de peixe-zebra, com espaço perivitelino e Doc injecções. Através da injecção de células cancerosas marcadas com corante químico ou proteína fluorescente em embriões de peixes-zebra transgénicos, as características dinâmicas e espaciais de invasão e metástase pode ser claramente rastreados em tempo real na parte de uma única célula ou nível de agregados sob um microscópio de fluorescência. Na maioria dos casos, a rápida progressão de metástases no peixe-zebra garante que o ensaio pode ser realizado dentro de uma semana após o transplante. Além disso, as estatísticas poderosos pode ser obtido com grandes grupos de peixe.
Precoces e tardias eventos da cascata metastática poderia ser simulado e recapitulou pela injeção de células cancerosas no espaço perivitelínico ou Doc, respectivamente. O espaço perivitelino é o espaço confinado entre a periderme do peixe e o saco vitelino, o qual allows um para monitorar a disseminação de células tumorais individuais a partir de locais primários no corpo vivo. Após a implantação, as células de cancro submetidos a migração e invasão local, no interior do espaço perivitelino (considerado o sítio primário) e, em seguida, eles intravasate em vasos sanguíneos e disseminar juntamente com a circulação. Na cabeça e tailfin (considerado distantes locais alvo), as células cancerígenas se acumulam nos leitos capilares estreitos e extravasamento. Portanto, o número de células que são encontradas nos locais distantes no corpo do peixe é uma medida da capacidade metastática. Além disso, as células mais extravasados pode ser observado em pontos de tempo posteriores, o que também é válido para o ensaio de injecção doe.
O Doc é uma veia cardinal comum alargada com um grande fluxo de sangue 24. Directamente a segmentação doe como um local de injecção introduz as células cancerosas para o sistema circulatório. Na prática, as células de cancro da mama difusa por todo o corpo embrionária através dacorrente sanguínea imediatamente após a injeção Doc. As células então prender na veia e dorsal aorta caudal. Extravasamento, invasão, e formação de micrometástases pode ser observado sucessivamente dentro de 6 dias. Como relatado anteriormente 16, as células MDA-MB-231 metasticas e células mamarias pré-malignas M2 exibem diferentes fenótipos invasivos. células MDA-MB-231 submetido a invasão de célula única de tailfin rico em matriz de colagénio. Assim, o potencial de invasão de células MDA-MB-231 pode ser medido pela contagem do número de células que extravasadas e invadiram o tecido tailfin. Em contraste, as células M2 formam aglomerados de tamanhos diferentes e submetidos a invasão colectiva do CHT. A quantificação da capacidade de invasão de células M2 através da contagem do número de cachos deste protocolo é difícil e é preferencialmente realizada através de uma imagem 3D utilizando microscopia confocal e determinação do volume de células tumorais em cluster.
O desafio técnico em micro células de câncerinjeção é alvo com sucesso o espaço perivitelínico ou Doc. A micro-injecção de um grande número de embriões é um procedimento tedioso, que exige um operador altamente qualificado e paciente. Os factores que contribuem para a variação dos resultados em peixes individuais incluem a fase de desenvolvimento do embrião, aquando da injecção, as diferenças no número de células injectadas e o vazamento de células dentro do saco vitelino. Embora raro, a manipulação poderia penetrar inadvertidamente a vasculatura e introduzir células no sistema circulatório directamente, especialmente no espaço perivitelino injecção. Para reduzir ainda mais a variação e para garantir a fiabilidade das análises, o exame microscópico é necessário excluir peixe não qualificado em pontos de tempo ao longo do processo. Além disso, cego análise por um profissional sem conhecer o cenário é fortemente sugerido para alcançar quantificação imparcial.
Em resumo, os dois modelos que introduzimos aqui lançar luz sobrevisualizar os processos de invasão e metástase de células in vivo sem procedimentos invasivos. Embora nós só estudou células de câncer de mama em dois modelos em relação a potencial metastático, que poderiam ser extrapolados para outros tipos de câncer. Além disso, os modelos poderia ter aplicações mais vastas para determinar os mecanismos e novos alvos moleculares que controlam a metástase de células de cancro utilizando (epi) manipulação genética. Devido à maior penetrabilidade de embriões de peixes-zebra de compostos de molula pequena, em comparação com a alimentação ou a injecção de roedores 25, os dois modelos apresentados também tem vantagens em termos de rastreio de alto rendimento de potenciais novos fármacos anti-invasão / metástase.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Estudos sobre os membros da família TGF-β são suportados pelo Cancer Genomics Centro Holanda. Sijia Liu e Jiang Ren são suportadas pelo Conselho Scholarship China para 4 anos de estudo na Universidade de Leiden. Agradecemos ao Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, EUA) para as linhas celulares MCF10A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
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