Comportement invasif des cellules cancéreuses du sein humain dans Embryonic Zebrafish

Summary

Nous décrivons ici les modèles de xénogreffes de poisson zèbre en utilisant deux sites d'injection différents, à savoir, l' espace périvitelline et canal de Cuvier, pour étudier le comportement invasif et d'évaluer le potentiel de intravasculaire et extravasation des cellules cancéreuses du sein humain, respectivement.

Abstract

Dans de nombreux cas, les patients atteints de cancer ne meurent pas d'une tumeur primaire, mais plutôt à cause de métastases. Bien que de nombreux modèles de rongeurs sont disponibles pour l' étude des métastases cancéreuses in vivo, d' autres efficaces, fiables, les modèles à faible coût sont nécessaires pour accéder rapidement aux effets potentiels de (Epi) modifications génétiques ou des composés pharmacologiques. En tant que tel, nous illustrons et expliquons la faisabilité des modèles de xénogreffes en utilisant des cellules de cancer du sein humain injecté dans des embryons de poisson zèbre pour soutenir cet objectif. Sous le microscope, ou des protéines fluorescentes marquées chimiquement les cellules cancéreuses du sein humain sont transplantés dans des embryons de poisson zèbre transgénique, Tg (fli: EGFP), à l'espace périvitellin ou conduit de Cuvier (Doc) 48 h après la fécondation. Peu de temps après, le processus spatio-temporelle de l'invasion de cellules cancéreuses, la diffusion, et des métastases dans le corps du poisson vivant est visualisé sous un microscope à fluorescence. Les modèles utilisant différents sites d'injection, soit, parespace ivitelline ou Doc sont complémentaires les unes aux autres, ce qui reflète le stade précoce (étape de intravasation) et stade tardif (étape de extravasation) de la cascade métastatique en plusieurs étapes des événements. De plus, l'angiogenèse péritumorale et intratumorale peut être observée avec l'injection dans l'espace périvitellin. La période expérimentale est plus de 8 jours. Ces deux modèles combinent marquage cellulaire, micro-transplantation, et des techniques d'imagerie par fluorescence, ce qui permet l'évaluation rapide de métastases du cancer en réponse à des manipulations génétiques et pharmacologiques.

Introduction

Overt métastases du cancer dans la clinique comprend une série d'événements complexes et en plusieurs étapes appelées la « cascade métastatique ». La cascade a été largement revue et peut être disséqué en plusieurs étapes successives: l' invasion locale, intravasculaire, diffusion, arrestation, extravasation et la colonisation ^{1, 2.} Une meilleure compréhension de la pathogenèse des métastases du cancer et l'élaboration de stratégies de traitement potentielles in vivo nécessitent des modèles d'accueil robustes de propagation des cellules cancéreuses. Modèles murins sont bien établis et sont largement utilisés pour évaluer les métastases ^3, mais ces approches ont une faible efficacité et les limites éthiques et sont coûteuses comme un modèle avant - garde pour déterminer si une manipulation particulière pourrait affecter le phénotype métastatique. D'autres efficaces, fiables, les modèles à faible coût sont nécessaires pour accéder rapidement aux effets potentiels de (Epi) modifications génétiques ou pharmacologcomposés iques. En raison de leur forte homologie génétique avec l'homme et la transparence de leurs embryons de poisson zèbre (Danio rerio) ont émergé comme un modèle de vertébrés importants et sont de plus en plus appliquée à l'étude des processus de développement, les interactions microbe-hôte, les maladies humaines, le dépistage des drogues, etc. . ^4. Les modèles de métastases cancéreuses établies chez le poisson zèbre peut fournir une réponse aux insuffisances des modèles de rongeurs ^{5, 6.}

Bien que la néoplasie spontanée est à peine vu chez le poisson zèbre sauvage ^7, il existe plusieurs techniques de longue date pour induire le cancer désiré chez le poisson zèbre. Mutations du gène cancérigène ou induite par activation de la voie de signalisation peuvent histologiquement et le modèle moléculaire carcinogenèse, mimant la maladie humaine chez le poisson zèbre ^{7, 8, 9.} par taking avantage de diversité avant et arrière manipulations génétiques des oncogènes ou des suppresseurs de tumeurs, (transgéniques) zebrafish ont également permis des études potentiels de la formation du cancer et de maintenance ^{6, 10.} Les modèles de cancer induits chez le poisson zèbre couvrent un large spectre, y compris digestif, reproductif, le sang, le système nerveux et l' épithélium ^6.

L'utilisation du poisson zèbre dans la recherche sur le cancer a augmenté récemment en raison de la mise en place de modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines dans cet organisme. Ce fut d' abord rapporté avec des cellules de mélanome métastatique humaines qui ont été greffées avec succès dans des embryons de poisson zèbre au stade de la blastula en 2005 ^11. Plusieurs laboratoires indépendants ont validé la faisabilité de ce travail de pionnier en introduisant toute une gamme de cellules cancéreuses de mammifères dans des lignes à zebrafish différents sites et stades de développement ^{5 <}/ Sup>. Par exemple, des injections près blastodisque et blastocyste du stade blastula; injections dans le sac vitellin, l'espace périvitellin, canal de Cuvier (Doc), et la veine cardinale postérieure de 6-h- à des embryons âgés de 5 jours; et des injections dans la cavité péritonéale de vieux de 30 jours de larves immunodéprimés ont été effectuées ^{5, 12.} De plus, la tumeur allogénique transplantations ont également été signalées dans ^{12 zebrafish, 13.} L'un des grands avantages de l'utilisation xénogreffes est que les cellules cancéreuses greffées peuvent être facilement marquées par fluorescence et distingué des cellules normales. Par conséquent, les enquêtes sur les comportements dynamiques de la formation de microtumor ^14, l' invasion cellulaire et la métastase ^{15, 16, 17,} l' angiogenèse induite par une tumeur ^{15, 1}8, et les interactions entre les cellules cancéreuses et les facteurs de l' hôte ¹⁷ peut être clairement visualisé dans le corps de poissons vivants, en particulier lorsque les lignes de poisson - zèbre transgénique sont appliqués ^5.

Inspiré par le fort potentiel des modèles de poisson zèbre de xénogreffes pour évaluer les métastases, nous avons démontré les propriétés transvasculaires extravasation de différentes lignées cellulaires du cancer du sein dans la zone tailfin de Tg (FLI: EGFP) embryons de poisson zèbre par des injections de Doc ^16. Le rôle de facteur de transformation-β (TGF-β de) ¹⁶ et protéines morphogénétiques osseuses (BMP) ¹⁹ voies de signalisation dans pro / invasion des cellules cancéreuses anti-sein et métastases croissance ont également été étudiée dans ce modèle. De plus, nous avons également récapitulé la capacité de pénétration intravasculaire de diverses lignées cellulaires du cancer du sein en circulation en utilisant des modèles de xénogreffes avec des injections de poisson zèbre espace périvitelline.

Protocol

Toutes les recherches en utilisant la Tg zebrafish fluorescente transgénique (de Fli: EGFP) souche, qui a amélioré la protéine fluorescente verte (EGFP) marqué à la vasculature ^20, y compris le logement et les expériences, a été réalisée conformément aux directives internationales et a été approuvé par le Comité institutionnel local pour le bien-être des animaux (Dier Ethische Commissie (DEC) du Centre médical de l'Université de Leiden.

Remarque: Comme résumé sur la figure 1, le protocole est grossièrement divisé en quatre étapes: collecte d'embryons (Figure 1A), la micro - injection (figure 1B), le dépistage (figure 1c), et l' analyse (figure 1D).

1. Préparer les aiguilles d'injection

1. Préparer des aiguilles d'injection avec microcapillaires en verre de borosilicate. Mettre un microcapillaire dans un dispositif d'étirage de micropipettes avec les paramètres suivants: pression d'air, 500; la chaleur, 650; tirer, 100; vitesse, 200; temps,40. Maintenir les aiguilles d'injection dans une plaque porte-aiguille jusqu'à ce qu'ils soient utilisés pour l'injection.

2. Préparer les fluorescents, génétiquement les cellules cancéreuses Labellisées du sein pour injection

1. Culture cancer mammaire humain MDA-MB-231 cellules à 37 ° C dans du milieu DMEM glucose élevé contenant de la L-glutamine, 10% de sérum bovin fœtal et 1: 100 de pénicilline-streptomycine (pen-strep).
2. Culture des lignées de cellules epitheliales du sein, MCF10A (M1) et MCF10A-Ras (M2), à 37 ° C dans du milieu DMEM / F12 contenant de la L-glutamine avec 5% de sérum de cheval, 20 ng / ml de facteur de croissance épidermique, 10 mg / mL insuline, 100 ng / ml d'entérotoxine cholérique, 0,5 mg / ml d'hydrocortisone et 1: 100 pen-strep.
3. Produire mCherry lentivirus par co-transfection PLV-mCherry, pCMV-VSVG ^21, pMDLg-RRE (gag / pol) ^22, et pRSV-REV ²² plasmide dans des cellules HEK293T. récolte des surnageants de cellules 48 h après la transfection et stocker à -80 ° C.
4. jenfect MDA-MB-231, M1, M2 et des cellules à confluence de 30% pendant 24 heures avec des surnageants dilués lentiviraux 1: 1 avec du milieu de culture normal en présence de 5 ng / ml de polybrène.
5. Sélectionner des clones monocellulaires en diluant les cellules dans une plaque à 96 puits, ce qui permet l'excroissance de clones de cellules isolées, jusqu'à l'obtention des lignées cellulaires stables exprimant mCherry.
6. Culture un flacon T75 de cellules pour l'injection. Récolter les cellules à 80% de confluence avec un traitement à la trypsine-EDTA 0,5%. Laver les cellules avec du PBS 1x fois 2-3.
7. Re-suspendre les cellules dans environ 200 pi de PBS. Magasin à les 4 ° C pendant moins de 5 h avant l'injection.

3. Préparer Embryons pour injection Zebrafish

1. Mettre en place les couples reproducteurs de poisson zèbre et de recueillir des embryons, comme indiqué dans un précédent article JoVE par Rosen et al. ^23.
2. Sélectionnez les embryons qui sont à 0-4 HPF en supprimant les embryons non fécondés et anormaux. Gardez les embryons dans une dis Petrih d'eau d'oeuf (60 sels de mer ug / ml; ~ 60 embryons / boîte) et incuber à 28 ° C.
3. Dechorionate les embryons avec des pincettes fines à 48 HPF.
4. Anesthésier les embryons en les transférant à 40 ug / mL de tricaïne (acide 3-aminobenzoïque) contenant de l'eau d'oeuf à environ 2 min avant l'injection, mais pas plus de 2 h avant l'injection.
   NOTE: tricaïne solution mère (4 mg / ml, 100x) est préparé sous forme de 400 mg de poudre de tricaïne dans 97,9 ml d'eau doublement distillée et 2,1 ml de 1 M Tris-base (pH 9), avec le pH ajusté à 7,4. A conserver dans le congélateur à -20 ° C.

4. Injecter des cellules humaines du cancer du sein dans l'espace périvitellin

1. Charge: 15 ul de la suspension cellulaire dans une aiguille d'injection. Monter l'aiguille sur le micromanipulateur et détacher la pointe d'aiguille avec des pinces fines afin d'obtenir un diamètre d'ouverture d'extrémité de 5 à 10 um.
2. Utiliser un picopump pneumatique et un manipulateur pour exécuter la micro-injection. ADJUst le picopump à injecter 400 cellules à chaque fois. Avant l'injection, compter les nombres de cellules manuellement par l'injection des cellules sur la partie supérieure d'une boîte de Petri contenant 1% d'agarose.
3. mise en ligne des embryons anesthésiés (2-3 jours après la fécondation (dpf)) sur une surface plane, 1% d'agarose plaque injection, environ 10 embryons à chaque fois.
4. Orienter la plaque d'injection à la main pendant les injections de placer les embryons dans la position préférée pour l' insertion de l'aiguille ( par exemple, en diagonale).
5. Pointer le bout de l' aiguille au niveau du site d'injection et insérer doucement la pointe de l' aiguille dans l'espace périvitellin entre le sac vitellin et le périderme de l'embryon de poisson zèbre (figure 2A).
6. Injecter environ 400 cellules tumorales mCherry marqué. Assurez-vous que le sac jaune n'est pas rompu pour éviter l'implantation dans le sac jaune.

5. Injecter des cellules humaines du cancer du sein dans le Doc

1. Préparer l'aiguille d'injection et embryons de poisson zèbre comme décrit i protocole n étapes 1, 2 et 3.
2. Utiliser une aiguille angle de 45 ° de sorte que le Doc peut être approché à partir du côté dorsal de l'embryon.
3. Insérer l'aiguille dans le point de départ du Doc (figure 3A), juste dorsale à l' endroit où le conduit commence l' élargissement sur le sac vitellin, et injecter environ 400 cellules; l'injection est correct si le volume intérieur de la conduite se développe directement après l'impulsion et la vésicule ombilicale.
   NOTE: Plusieurs injections consécutives peut être effectuée sans extraire l'aiguille.
4. Transférer les embryons de poisson zèbre injecté à l'eau d'oeuf.
   NOTE: Comme une variation considérable existe entre les embryons de poisson zèbre individuels, et comme la mort d'embryons après l'injection peut se produire, un nombre relativement important d'embryons de poisson zèbre (environ 100) doit être injecté avec des cellules cancéreuses.
5. Maintenir les embryons de poisson zèbre à 33 ° C pour tenir compte des conditions de température optimales pour les poissons et les cellules de mammifères.

_title "> 6. Écran du Injecté Embryons

1. Cribler chaque poisson sous un stéréomicroscope de fluorescence à 2 h post-injection (hpi) pour l'injection de l' espace périvitellin (Figure 2) ou à 24/2 hpi pour l'injection de Doc (figure 2) pour assurer que l' on injecte toutes les embryons avec un le même nombre de cellules tumorales. Retirer les embryons avec des erreurs d'injection, telles que les ruptures (figure 2B) ou des injections (figure 3B) de la vésicule ombilicale, et choisir les embryons avec des cellules injectées ci - dessous (figures 2C et 3B) ou au- dessus (figures 2D et 3B) seuil. Ne garder que les embryons avec environ 400 cellules en culture.
2. Règle la possibilité que les cellules sont introduites directement dans la circulation au cours du processus d'injection en retirant les embryons avec des cellules déjà en circulation. De plus, enlever un embryon à une cellule de masse à proximité de la Doc (Figure 2D

7. image et analyser le processus métastasique

1. Recueillir plusieurs embryons anesthésiés avec une pipette de Pasteur large pointe et les transférer vers le fond de verre d'une boîte en polystyrène.
2. Retirer l'excès d'eau et de garder une quantité limitée d'eau d'œufs. Manipuler l'embryon en position avec un outil de boucle de cheveux et de placer un couvercle sur le dessus du verre.
3. Utilisation d'un microscope confocal inversé en combinaison avec l'eau d'immersion ou objectifs secs à longue distance. Placez l'embryon de telle sorte que la région d'intérêt est aussi proche de l'objectif que possible.
4. Imager immédiatement après l'anesthésie pour réduire le risque de mort due à l'évaporation du liquide.
   1. des signaux de capture de EGFP marqué vasculature et les cellules tumorales marquées mCherry à la même position sur les embryons de co-injectées avec des cellules enregistrer les vaisseaux sanguins en fusionnant les deux canaux d'imagerie.
   2. Pour chaque embryon de poisson zèbre, recueillir deux ensembles différents d'imagesà partir de la zone de tête et la région de queue.
5. Quantifier le nombre de cellules disséminées.
   1. Pour les injections d'espace périvitellin, compter le nombre de cellules dans chaque poisson ayant diffusé à partir de la masse cellulaire vers le corps du poisson embryonnaire dans les régions de tête et de queue ^{4, 15;} les régions sont au-delà des limites de la cavité cardiaque frontalement, au-dessus de la face dorsale de la vessie natatoire, et au-delà de l'ouverture urogénitale caudale.
   2. Pour l'injection de Doc, compter le nombre de cellules individuelles qui ont envahi les fibres de collagène de l'empennage de la circulation (MDA-MB-231) ou le nombre de groupes formés par des cellules collectivement (M2) dans le tissu hématopoïétique caudal (CHT) de chaque poisson zèbre ^19.
6. Étude invasion et métastases plus en détail à l'aide de la microscopie confocale (fortement recommandé).
   1. Utiliser un faible grossissement (objectif 4X) à l'image l'ensemblele corps et pour obtenir une vue d'ensemble du motif de diffusion de cellules tumorales.
      REMARQUE: un grossissement supérieur (20X et 40X objectifs) est adapté à l'étude de l'angiogenèse intra et péri-tumorale et la localisation précise des cellules disséminées dans le corps de l'embryon.
   2. Utiliser un laser de 488 nm pour balayer le système vasculaire d'embryons de poisson zèbre et un laser 543 nm pour balayer les cellules tumorales implantées marqués par fluorescence rouge. Obtenir une image de haute qualité en balayant chaque embryon dans huit à dix étapes. Numériser et faire la moyenne de chaque étape six fois.
7. placer délicatement l'embryon dans l'eau d'œuf si elle est nécessaire pour d'autres expériences.

8. Effectuer une analyse statistique en utilisant une analyse de variance (Anova) Suivi par analyse post - hoc

Representative Results

Dans le modèle de poisson zèbre xénogreffe embryonnaire avec une injection d'espace périvitelline, la diffusion hématogène des cellules cancéreuses marquées dans le corps du poisson est considéré comme la migration active. Ce processus peut être détecté et quantifié sous un microscope à fluorescence, comme décrit dans les procédés ci-dessus. Pour illustrer ce modèle de xénogreffe, nous avons suivi le processus de diffusion des différentes lignées cellulaires de cancer du sein connu (ou sans) invasion / métastases potentiel selon in vitro et in vivo des études de souris, y compris les cellules épithéliales mammaires bénignes normale M1, précancéreuses ASDH transformé des cellules M2 et hautement métastatiques des cellules MDA-MB-231, 1 jour après l'injection (ppp) en avant. Une image de microscopie confocale haute résolution a montré que les cellules MDA-MB-231 (rouge) présentent un phénotype agressif, avec des bords irréguliers dans l'espace périvitellin. protubérances en forme de pseudopodes et fronts invasifs étaient aussi fréquemment présents (Figure 4A, à gauche). Quelques cellules disséminées dans la circulation sanguine dès 1 dpi (figure 4A, à droite). A 2 dpi, la diffusion claire a été observée dans les parties distales du poisson (figure 4A, à droite). Le nombre de cellules disséminées a encore augmenté à 3 dpi (Figure 4A et 4D). En revanche, lorsque les cellules ont été contestées M2 zebrafish, ils ont fait preuve propagation modeste dans le corps du poisson après 2 dpi (figure 4B). Ils ont également montré une diffusion accrue après le temps passé (figure 4F). Comme le montre la figure 4C et 4G, les cellules M1 rarement diffusées en circulation zebrafish, et même la migration locale active dans l'espace périvitelline était peu fréquente au cours de la période d'observation. La masse cellulaire M1 a été pratiquement détenu au site d'injection d'origine. Si la définition de la diffusion positive ou métastases comme> 5 cellules dans le corps du poissonss = "xref"> 4, la métastase des cellules MDA-MB-231 et M2 a été observée chez 92% et 57% des poissons, respectivement, à 3 dpi (figure 4G). En revanche, aucune diffusion positive a été observée avec des cellules M1. Par conséquent, ce modèle zebrafish de la progression des cellules cancéreuses humaines reflète exactement le niveau relatif du potentiel métastatique des différentes cellules chez les souris. La néovascularisation (verte) qui a germé à partir du plexus sous - intestinaux du poisson zèbre embryonnaire et a pénétré dans la masse des cellules MDA-MB-231 ou M2 était également présente après l'injection de l' espace périvitellin de cellules tumorales suivi de 3 jours d'incubation (Figure 4A et 4B, à gauche ). Conformément à l'incapacité dans la diffusion, seulement une légère néovascularisation a été détectée lors de l' implantation de cellules M1 (figure 4C).

Dans le modèle de poisson zèbre xénogreffe embryonnaire avec mCherry marqués cellules MDA-MB-231 et l'injection de Doc, le laboratoireles cellules cancéreuses DELE dans le tailfin du poisson zèbre sont considérés comme représentatifs de l'extravasation actif. Les cellules MDA-MB-231 ont été marquées mCherry injectés à 2 dpf. A 3 dpi, les cellules ont commencé à migrer hors des vaisseaux à la nageoire caudale, qui est enrichie en collagène. Simple MDA-MB-231 cellules migrées une par une, de façon indépendante à partir des vaisseaux, à l'empennage distant (figure 5A). A 6 dpi, l'invasion peut être quantifiée en comptant le nombre de cellules ayant migré dans le tissu empennage. Dans le modèle d'injection Doc cellulaire M2 marqué mCherry, l'injection a également été réalisée à 2 dpf. Cependant, un phénotype a été observé au cours de cluster du processus de extravasation actif. A 1 dpi, les cellules M2 ont commencé à migrer hors des vaisseaux dans le CHT du poisson zèbre. A 2 dpi, les cellules M2 migrés ont commencé à former un cluster entre les navires dans le CHT (figure 5B). Quantification du nombre de groupe de cellules invasives M2 dans la région CHT pourrait être menée à6 dpi.

Figure 1: Principales étapes pour étudier le comportement invasif des cellules cancéreuses du sein chez le poisson zèbre embryonnaire. (A) Après avoir traversé le poisson zèbre parental pendant une nuit, Tg (FLI1: EGFP) embryons de poisson zèbre ont été recueillies le matin suivant et ont été maintenues à 28 ° C. (B) Les embryons ont été dechorionated avec des pincettes fines sous une loupe binoculaire 48 fécondation h (HPF). Les cellules cancéreuses du sein marquées ont été recueillies et remises en suspension dans une petite quantité de PBS. Après préparation bien, les cellules en suspension ont été chargés dans une aiguille. Environ 400 cellules ont été injectées dans le conduit de Cuvier (Doc) de l'espace périvitellin sous un stéréomicroscope. Les embryons injectés ont été maintenus à 33 ° C. (C) 2 h après l' injection (hpi), les embryons ont été soumis à cale dépistage Reful sous un stéréomicroscope de fluorescence. Les embryons ont été maintenus à 33 ° C pendant 3 ou 6 jours. Pendant l'intervalle, les embryons ont été soumis au traitement prévu. (D) la diffusion des cellules cancéreuses par injection de l' espace périvitellin ou invasion par injection doc a été détectée, compté, et imagée par microscopie confocale 3 ou 6 jours après l' injection (dpi). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: site d'injection de l' espace périvitellin et erreurs communes. (A) A environ 400 cellules marquées mCherry (MDA-MB-231) ont été injectées dans l'espace périvitellin. Le fond clair (le plus haut), le vert vasculature (moyenne supérieure), et la masse de globules rouges (moyenne inférieure) d'injectioned embryons de poisson zèbre ont été capturés par microscope confocal. L'image fusionnée (la plus basse) des trois canaux montre l'emplacement stéréo de la masse cellulaire dans l'embryon. (B) Les cellules ne visaient pas de manière appropriée l'espace périvitelline. Le sac jaune a été rompu. (C) des cellules injectées en dessous du seuil (moins de 400). (D) des cellules injectées seuil ci - dessus (plus de 400). La masse cellulaire était trop proche du canal de Cuvier, qui a un large flux sanguin. Barre d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: Vue d' ensemble du conduit d'injection Cuvier (Doc). (A) Schéma de l'injection de Doc à 2 jours post-fertilisation (dPf) avec des cellules de cancer du sein chez les embryons de poisson zèbre. La flèche indique le Doc. (B) Exemples d'injections positives, avec environ 400 cellules de cancer du sein; injections négatives, y compris le jaune misinjection; et un nombre incorrect de cellules injectées à 4 hpi. Les flèches et les cercles indiquent les cellules injectées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4: Comparaison de la capacité de diffusion entre les différentes lignées de cellules du sein. Environ 400 mCherry marqué MDA-MB-231, MCF10Aras (M2), ou des cellules MCF10A (M1) ont été injectés dans l'espace périvitellin de l'embryon de poisson zèbre 48 HPF. Les embryons injectés ont été suivis pendant 3 jours. (A, B, et C) Haut-resolution micrographies montrant le processus de migration et la diffusion représentant de MDA-MB-231 (A), M2 (B), et M1 cellules (C) dans les corps embryonnaires individuelles 1, 2 et 3 jours après l'injection (dpi). À gauche, la migration des cellules dans l'espace périvitelline (rouge) et la vasculature peritumoral et intratumorale (vert). signaux jaunes indiquent le chevauchement des microvaisseaux et des cellules. Moyen-Orient, l'image entière de l'embryon. Droit, visualisation des cellules disséminées dans la partie postérieure de l'embryon. jaune indiquent les pointes de flèches simples cellules disséminées. Barre d'échelle = 50 pm. (D, E, et F) Quantification du nombre de cellules disséminées dans chaque corps embryonnaire à 1, 2, et 3 dpi. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Les résultats de l'analyse à sens unique de la variance (Anova), suivie par l'analyse post-hoc sont présentés. P <0,05 a été acceptée comme significative statistiquement (* 0,01 <P <0,05; ** 0.001 <P <0,01; *** P <0,001. (G) La comparaison de l'incidence des intravasation pour MDA-MB-231, M2, M1 et les cellules dans les organes embryonnaires à 1, 2, et 3 dpi. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5: Les différents comportements de la métastase des cellules MDA-MB-231 et M2 dans le poisson zèbre avec conduit d'injection Cuvier. (A) représentatifs des images confocales du poisson zèbre suivis à 3, 4, et 5 dpi pour montrer le comportement de migration cellulaire unique de cellules MDA-MB-231 chez le poisson zèbre. Les flèches indiquent invasifs MDA-MB-231 cellules qui ont migré hors des vaisseaux dans les tailfins. Barre d'échelle = 200 pm dans la colonne de gauche, 50 pm dans la colonne de droite. (B) représentantimages confocale du poisson zèbre ont suivi à 1, 2 et 3 ppp pour montrer le comportement de migration des amas de cellules des cellules M2 zebrafish. Les flèches indiquent les cellules M2 invasives qui ont migré hors des vaisseaux du tissu hématopoïétique caudale (CHT) et forment un groupe entre les navires. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Ici, nous avons décrit deux méthodes pour étudier le comportement invasif des cellules cancéreuses du sein dans Tg (FLI1: EGFP) embryons de poisson zèbre, avec des injections d'espace périvitelline et Doc. En injectant des cellules cancéreuses marquées par un colorant chimique ou protéine fluorescente dans des embryons de poisson zèbre transgénique, les caractéristiques dynamiques et spatiales de l'invasion et les métastases peuvent être clairement suivis en temps réel à la seule cellule ou au niveau du groupe sous un microscope à fluorescence. Dans la plupart des cas, la progression rapide de métastases chez le poisson zèbre assure que le dosage peut être effectué dans 1 semaine après la transplantation. De plus, les statistiques puissantes peuvent être obtenues avec de grandes cohortes de poissons.

Les événements précoces et tardifs de la cascade métastatique pourraient être simulés et récapitulées en injectant des cellules cancéreuses dans l'espace périvitelline ou Doc, respectivement. L'espace périvitellin est l'espace confiné entre le périderme du poisson et de la vésicule ombilicale, qui pr Interdictionws pour surveiller une dissémination des cellules tumorales uniques provenant de sites primaires dans le corps vivant. Après l'implantation, les cellules cancéreuses subissent la migration locale et l'invasion dans l'espace périvitelline (considéré comme le site principal), puis ils intravasate dans les vaisseaux sanguins et diffuser ainsi que la circulation. A la tête et empennages (considéré des sites cibles éloignés), les cellules cancéreuses s'accumulent dans les lits capillaires étroits et extravasation. Par conséquent, le nombre de cellules qui se trouvent sur les sites distants dans le corps du poisson est une mesure de la capacité métastatique. En outre, les cellules plus extravasées peuvent être observées à des points de temps plus tard, ce qui est également vrai de l'essai d'injection de Doc.

Le Doc est une veine cardinale commune élargie avec un flux sanguin étendu ^24. Cibler directement le Doc comme un site d'injection introduit des cellules cancéreuses dans le système circulatoire. Dans la pratique, les cellules cancéreuses du sein diffuse dans tout le corps embryonnaire par leflux sanguin immédiatement après l'injection de Doc. Les cellules arrêtent ensuite à la veine caudale et de l'aorte dorsale. Extravasation, l'invasion et la formation de micrométastases peuvent être observées successivement dans les 6 jours. Comme indiqué précédemment ^16, métastatique MDA-MB-231 cellules et cellules précancéreuses mammaires M2 présentent différents phénotypes invasives. cellules MDA-MB-231 subissent une invasion unicellulaire de la tailfin matrice riche en collagène. Ainsi, le potentiel d'invasion des cellules MDA-MB-231 peut être mesurée en comptant le nombre de cellules qui ont extravasées et envahies le tissu tailfin. En revanche, les cellules M2 forment des groupes de tailles différentes et subissent une invasion collective du CHT. Quantification du potentiel d'invasion des cellules M2 en comptant le nombre de grappes de ce protocole est difficile et est réalisée de préférence en faisant une image en 3D en utilisant la microscopie confocale et la détermination du volume des cellules tumorales en cluster.

Le défi technique en micro des cellules cancéreusesinjection cible avec succès l'espace périvitelline ou Doc. La micro-injection d'un grand nombre d'embryons est une procédure fastidieuse nécessitant un opérateur hautement qualifié et patient. Les facteurs qui contribuent à des variations dans les résultats de chaque poisson comprennent le stade de développement de l'embryon lors de l'injection, les différences dans le nombre de cellules injectées, et la fuite des cellules dans le sac jaune. Bien que rare, la manipulation non intentionnelle peut pénétrer dans le système vasculaire et à introduire les cellules dans le système circulatoire directement, en particulier dans l'injection de l'espace périvitellin. Pour réduire davantage la variation et d'assurer la fiabilité des analyses, l'examen microscopique est nécessaire d'exclure du poisson non qualifié à des moments tout au long du processus. En outre, aveuglé l'analyse par un professionnel sans connaissance du cadre est fortement recommandé d'obtenir une quantification impartiale.

En résumé, les deux modèles que nous avons présentés ici mettent en lumièrevisualiser les processus d'invasion cellulaire et les métastases in vivo sans procédures invasives. Bien que nous ne ont étudié les cellules de cancer du sein en deux modèles en ce qui concerne le potentiel métastatique, ils pourraient être extrapolés à d'autres types de cancer. De plus, les modèles pourraient avoir des applications plus larges pour déterminer les mécanismes et de nouvelles cibles moléculaires qui contrôlent les métastases des cellules cancéreuses en utilisant (epi) la manipulation génétique. En raison de la pénétrabilité plus élevé d'embryons de poisson zèbre par des composés à petite molécule par rapport à l'alimentation ou l' injection de rongeurs ^25, les deux modèles présentés ont également des avantages en termes de criblage à haut débit de potentiels nouveaux médicaments anti-invasion / métastases.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	MP Biomedicals	AGAF0500
Borosilicate glass capillary	Harvard Apparatus	300038
Cholera enterotoxin	Calbiochem	227035
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
DMEM-high glucose media containing L-glutamine	ThermoFisher Scientific	11965092
DMEM/F-12 media containing L-glutamine	ThermoFisher Scientific	21041025
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc	11252-20
Epidermal growth factor	Merck Millipore	01-107
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	16140071
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
HEK293T cell line	American Type Culture Collection	CRL-1573
Hydrocortisone	SigmaAldrich	227035
Horse serum	ThermoFisher Scientific	26050088
Insulin	SigmaAldrich	I-6634
MCF10A (M1) cell line			Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)
MCF10Aras (M2) cell line			Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)
MDA-MB-231 cell line	American Type Culture Collection	CRM-HTB-26
Manual micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL)	Eppendorf	F276456I
pCMV-VSVG plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
PLV-mCherry plasmid	Addgene	36084
pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Pneumatic picoPump	World Precision Instruments	SYS-PV820
Polybrene	SigmaAldrich	107689
Prism 4 software	GraphPad Software
pRSV-REV plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Tris-base	SigmaAldrich	11814273001
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040
Trypsin-EDTA (0.5%)	ThermoFisher Scientific	15400054
Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm)	SigmaAldrich	P5481-500EA
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040