Summary
Her beskriver vi xenograft zebrafisk modeller ved hjælp af to forskellige injektionssteder, dvs. perivitelline plads og kanal- af Cuvier, for at undersøge den invasive adfærd og vurdere intravasation og ekstravasation potentiale af humane brystkræftceller, hhv.
Abstract
I mange tilfælde behøver cancerpatienter ikke dø af en primær tumor, men snarere på grund af metastaser. Skønt talrige gnavermodeller er tilgængelige til undersøgelse cancermetastase in vivo, er behov for andre effektive, pålidelige, billige modeller til hurtigt at få adgang de potentielle virkninger af (epi) genetiske ændringer eller farmakologiske forbindelser. Som sådan, vi illustrere og forklare mulighederne for xenograftmodeller med humane brystkræftceller sprøjtes ind zebrafiskembryoer at støtte dette mål. Under mikroskopet er fluorescerende proteiner eller kemisk mærkede humane brystcancerceller transplanteret ind transgene zebrafiskembryoer, Tg (Fli: EGFP), ved perivitelline rum eller kanalen i Cuvier (dok) 48 timer efter befrugtningen. Kort efter er den tidsmæssige-rumlige proces med cancercelleinvasion, formidling, og metastase i den levende fisk krop visualiseres under et fluorescerende mikroskop. Modellerne anvender forskellige injektionssteder, dvs. privitelline rum eller Doc er komplementære til hinanden, hvilket afspejler den tidlige fase (intravasation trin) og sen fase (ekstravasation trin) af flertrins-metastatiske kaskade af hændelser. Desuden kan peritumoral og intratumoral angiogenese iagttages med injektion i perivitelline rum. Hele forsøgsperiode er ikke mere end 8 dage. Disse to modeller kombinerer celle mærkning, mikro-transplantation, og fluorescens billeddannelse teknikker, giver mulighed for hurtig evaluering af kræft metastaser som reaktion på genetiske og farmakologiske manipulationer.
Introduction
Åbenlys cancermetastase i klinikken omfatter en række komplekse og flere trin begivenheder kendt som "metastatisk kaskade". Den kaskade er blevet grundigt gennemgået og kan dissekeres i successive trin: lokal invasion, intravasation, udbredelse, arrest, ekstravasation og kolonisering 1, 2. En bedre forståelse af patogenesen af kræft metastaser og udvikling af potentielle behandlingsstrategier in vivo kræver robuste vært modeller af kræftcelle spredning. Gnavermodeller er veletablerede og er almindeligt anvendt til at evaluere metastaser 3, men disse metoder har lav effektivitet og etiske begrænsninger og er dyre som en forkant model til at afgøre, om en bestemt manipulation kan påvirke metastatisk fænotype. Andre effektive, pålidelige, billige modeller er behov for hurtigt at få adgang til de potentielle virkninger af (epi) genetiske ændringer eller pharmacologgiske forbindelser. Grund af deres høje genetisk homologi til mennesker og gennemsigtigheden af deres embryoner zebrafisk (Danio rerio) er dukket op som en vigtig hvirveldyr model og i stigende grad anvendes til studiet af udviklingsprocesser, mikrobe-værtssammenspil, humane sygdomme, lægemiddelscreening, etc . 4. De kræft metastase-modeller, der er etableret i zebrafisk kan give et svar på manglerne i gnavermodeller 5, 6.
Selvom spontan neoplasi næppe ses i vild zebrafisk 7, er der flere langvarige teknikker til at fremkalde den ønskede kræft i zebrafisk. Carcinogen-induceret genmutationer eller signalvejen aktivering kan histologisk og molekylært model carcinogenese, efterligner human sygdom i zebrafisk 7, 8, 9. ved taking fordel af forskelligartede forward og reverse genetiske manipulationer af onkogener eller tumorsuppressorer, (transgene) zebrafisk har også gjort det muligt potentielle studier af dannelsen og vedligeholdelsen 6, 10 cancer. De inducerede kræftmodeller i zebrafisk dækker et bredt spektrum, herunder fordøjelsessystemet, reproduktive, blod, nervesystem, og epitelial 6.
Udnyttelsen af zebrafisk i kræftforskning har udvidet for nylig på grund af etableringen af menneskelige tumor-xenograftmodeller i denne organisme. Dette blev først rapporteret med human metastatisk melanom celler, der lykkedes indpodede i zebrafisk embryoner på blastula scenen i 2005 11. Flere uafhængige laboratorier har valideret gennemførligheden af dette pionerarbejde ved at indføre en bred vifte af cancerceller hos pattedyr linjer i zebrafisk på forskellige steder og udviklingsstadier 5 </ Sup>. For eksempel injektioner nær kimskiven og blastocyt i blastula-stadiet; injektioner i blommesækken, perivitelline rum, kanalen i Cuvier (dok), og posterior kardinalvene af 6-H- til 5 dage gamle embryoner; og injektioner i peritonealhulen af 30 dage gammel immunundertrykt larver er blevet udført 5, 12. Derudover blev også rapporteret allogen tumor transplantationer i zebrafisk 12, 13. En af de store fordele ved at bruge xenotransplantater er, at podede cancerceller let kan fluorescensmærket og skelnes fra normale celler. Derfor undersøgelser af dynamiske adfærd af microtumor formation 14, og -metastase 15, 16, 17, tumor-induceret angiogenese 15, 18, og samspillet mellem cancerceller og vært faktorer 17 klart kan visualiseres i levende fisk krop, især når transgene zebrafisk linjer påføres 5.
Inspireret af det store potentiale af zebrafisk xenograftmodeller at evaluere metastase, demonstrerede vi de transvaskulær ekstravasation angår forskellige brystcancercellelinier i halefinne område i Tg (Fli: EGFP) zebrafiskembryoer gennem Doc injektioner 16. Rollen af transformerende vækstfaktor-β (TGF-β) 16 og knoglemorfogenetisk protein (BMP) 19 signalveje i pro / anti-brystcancer og -metastase blev også undersøgt i denne model. Desuden har vi også sammenfattet den intravasation evne forskellige brystcancercellelinier i omsætning med xenograft zebrafisk modeller med perivitelline space injektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al forskning under anvendelse af transgene fluorescerende zebrafisk Tg (Fli: EGFP) stamme, som har forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP) -mærket vaskulatur 20, herunder bolig og forsøg blev udført i overensstemmelse med de internationale retningslinier og er godkendt af den lokale Institutional Udvalg for Animal Welfare (Dier Ethische Commissie (DEC) i Leiden University Medical center.
BEMÆRK: Som opsummeret i figur 1, er protokollen groft opdeles i fire trin: embryonindsamlings- (figur 1A), mikroinjektion (figur 1B), screening (Figur 1C) og analyse (figur 1D).
1. Klargør injektionsnålene
- Forberede injektionsnåle med borsilicatglashulsfærer mikrokapillærer. Løber mikrokapillærør i en mikropipette aftrækker enhed med følgende indstillinger: lufttryk, 500; varme, 650; trække, 100; hastighed, 200; tid,40. Hold injektionsnålene i en nåleholder plade, indtil de anvendes til injektion.
2. Forbered Fluorescerende, Genetisk Mærkede Breast Cancer Cells for Injection
- Kultur human brystcancer MDA-MB-231-celler ved 37 ° C i DMEM med højt glucoseindhold medium indeholdende L-glutamin, 10% føtalt bovint serum og 1: 100 penicillin-streptomycin (pen-strep).
- Kultur de brystepitelceller cellelinjer, MCF10A (M1) og MCF10A-Ras (M2), ved 37 ° C i DMEM / F12-medium indeholdende L-glutamin med 5% hesteserum, 20 ng / ml epidermal vækstfaktor, 10 mg / ml insulin, 100 ng / mL kolera enterotoxin, 0,5 mg / ml hydrocortison og 1: 100 pen-strep.
- Producere mCherry lentivirus ved co-transfektion PLV-mCherry, pCMV-VSVG 21, pMDLg-RRE (gag / pol) 22, og pRSV-REV 22 plasmid i HEK293T celler. Harvest cellesupernatanter 48 timer efter transfektion og opbevares ved -80 ° C.
- jegnfect MDA-MB-231, M1, og M2-celler ved 30% konfluens i 24 timer med lentivirale supernatanter fortyndet 1: 1 med normalt dyrkningsmedium i nærvær af 5 ng / ml polybren.
- Vælg single-cellekloner ved fortynding celler i en plade med 96 brønde, som tillader udvæksten af isolerede cellekloner, indtil opnåelse af de stabile mCherry-udtrykkende cellelinjer.
- Kultur en T75-kolbe af celler til injektion. Høst cellerne ved 80% konfluens med en 0,5% trypsin-EDTA-behandling. Vask cellerne med 1 x PBS 2-3 gange.
- Re-suspendere cellerne i ca. 200 pi PBS. Opbevares ved dem 4 ° C i mindre end 5 timer før injektion.
3. Forbered zebrafiskembryoer til injektion
- Oprette zebrafisk ynglepar og indsamle embryoner, som vist i en tidligere JOVE artikel af Rosen et al. 23.
- Vælg de embryoner, der er ved 0-4 HPF ved at fjerne de ubefrugtede og abnorme embryoner. Hold embryoner i en Petri dish fuld af æg vand (60 ug / ml havet salte; ~ 60 embryoner / skål) og inkuberes ved 28 ° C.
- Dechorionate embryoner med fine pincet på 48 HPF.
- Bedøver embryoner ved at overføre dem til 40 ug / ml tricaine (3-aminobenzoesyre) indeholdende æg vand ca. 2 minutter før injektion, men ikke længere end 2 timer før injektion.
BEMÆRK: tricaine stamopløsning (4 mg / ml, 100x) fremstilles som 400 mg tricaine pulver i 97,9 ml dobbeltdestilleret vand og 2,1 ml 1 M Tris-base (pH 9), med pH justeret til 7,4. Opbevares i -20 ° C fryser.
4. Injicer humane brystcancerceller i det perivitelline Space
- Belastning 15 pi af cellesuspensionen i en injektionsnål. Montere nålen på mikromanipulator og brække nålespidsen med fine pincet til opnåelse af en spids åbning diameter på 5-10 um.
- Bruge en pneumatisk picopump og en manipulator til at udføre mikroinjektion. adjust picopump at injicere 400 celler hver gang. Før injektion tælle celleantallet manuelt ved at injicere cellerne på toppen af en petriskål indeholdende 1% agarose.
- Line up bedøvede embryoner (2-3 dage efter befrugtning (dpf)) på en flad, 1% agarose indsprøjtning plade, omkring 10 embryoer hver gang.
- Orientere injektionspladen med hånden under injektionerne at placere embryoner i den foretrukne position til indføring af nålen (dvs. diagonalt).
- Vend nålen spids på injektionsstedet og indføres forsigtigt nålespidsen ind i perivitelline rum mellem blommesækken og peridermen af zebrafisk embryo (figur 2A).
- Injicere ca. 400 mCherry-mærkede tumorceller. Sørg for, at blommesækken ikke er bristet for at undgå implantering i blommesækken.
5. Injektion humane brystcancerceller i Doc
- Forberede injektionsnålen og zebrafiskembryoer som beskrevet i n protokol trin 1, 2 og 3.
- Brug en 45 ° nål vinkel, så Doc kan gribes an fra den dorsale side af fosteret.
- Stik nålen ind udgangspunktet af Doc (figur 3A), blot dorsal til hvor kanalen begynder at udvide over blommesækken, og injicere ca. 400 celler; injektionen er korrekt, hvis volumenet inden i kanalen udvider direkte efter impulsen og blommesækken.
BEMÆRK: Flere på hinanden følgende injektioner kan udføres uden at udtrække nålen. - Overfør de injicerede zebrafiskembryoer til æg vand.
eksisterer Som betydelig variation blandt individuelle zebrafiskembryoer, og som død af embryoner efter injektion kan forekomme, bør et relativt stort antal zebrafiskembryoer (omkring 100) injiceres med cancerceller: BEMÆRK. - Opretholde de zebrafiskembryoer ved 33 ° C for at imødekomme de optimale temperaturkrav for fisk og pattedyrceller.
- Screene hver fisk under en fluorescens stereomikroskop ved 2 timer efter injektion (HPI) til perivitelline space injektion (figur 2) eller ved 2-24 hpi for Doc injektion (figur 2) for at sikre, at alle embryonerne injiceres med en tilsvarende antal tumorceller. Flytte embryoner med injektion fejl, såsom brud (figur 2B) eller injektioner (Figur 3B) af blommesækken, og udvælge embryoer med injicerede celler nedenfor (figur 2C og 3B) eller derover (figur 2D og 3B) tærskel. Behold kun de embryoner med cirka 400 celler i kultur.
- Udelukke, at cellerne introduceres direkte i omløb i injektion proces ved at fjerne de embryoner med celler, der allerede er i omløb. Også fjerne enhver foster med en cellemasse tæt på Doc (figur 2D
7. Image og Analyser metastatiske proces
- Indsamle flere bedøvede embryoer med en bred spids Pasteur-pipette og overføre dem til glasset bunden af en polystyrenskålen.
- Fjern overskydende vand og holde en begrænset mængde æg vand. Manipulere embryoet i position med et hår løkke værktøj og placere en dækning på toppen af glasset.
- Bruge en omvendt konfokalt mikroskop i kombination med vand-nedsænkning eller lange afstande tørre mål. Placer embryo sådan, at regionen af interesse er så tæt på målet som muligt.
- Udføre billeddannelse umiddelbart efter anæstesi for at reducere risikoen for dødsfald som følge af flydende fordampning.
- Capture signaler fra EGFP-mærket vaskulatur og mCherry-mærkede tumorceller på den samme position på embryonerne at co-registrere injicerede celler med blodkar ved at slå de to billeddannende kanaler.
- For hver zebrafisk embryo, indsamle to forskellige sæt af billederfra hovedet region og haleregionen.
- Kvantificere antallet af disseminerede celler.
- For perivitelline space injektioner, tælle antallet af celler i hver fisk, der formidles fra cellemassen mod embryoniske fiskekroppen inden for hoved og hale regioner 4, 15; regionerne er ud over grænserne for hjertet hulrum frontalt, oven på svømmeblæren dorsalt, og ud over den urogenitale åbning kaudalt.
- For Doc injektion, tælle antallet af individuelle celler, der har invaderet collagenfibrene i halefinne fra omløb (MDA-MB-231) eller antallet af klynger dannet af celler kollektivt (M2) i den kaudale hæmatopoietisk væv (CHT) af hver zebrafisk 19.
- Undersøgelse invasion og metastase i detaljer ved hjælp af konfokalmikroskopi (anbefales).
- Brug lav forstørrelse (4X objektiv) til billedet helekrop og for at opnå et overblik over udbredelsen tumorcellen mønster.
BEMÆRK: Højere forstørrelse (20X og 40X mål) er egnet til at studere intra- og peri-tumoral angiogenese og den præcise lokalisering af disseminerede celler i embryoet krop. - Brug en 488 nm laser til at scanne zebrafisk embryo vaskulatur og en 543 nm laser til at scanne implanterede tumorceller mærket med rød fluorescens. Opnå en høj kvalitet billede ved at scanne hver embryo i otte til ti trin. Scan og midle hvert trin seks gange.
- Brug lav forstørrelse (4X objektiv) til billedet helekrop og for at opnå et overblik over udbredelsen tumorcellen mønster.
- Læg forsigtigt embryo tilbage ind i ægget vand, hvis det er nødvendigt for yderligere forsøg.
8. statistisk analyse Brug envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af post-hoc analyse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det embryoniske xenograft zebrafisk model med en perivitelline space injektion er hæmatogen spredning af mærkede cancerceller i fiskekroppen betragtes som aktiv migration. Denne proces kan detekteres og kvantificeres under et fluorescensmikroskop, som beskrevet i fremgangsmåderne ovenfor. For at illustrere dette xenograft model, fulgte vi formidlingsprocessen forskellige brystcancercellelinier med kendt (eller uden) invasion / metastase potentiale ifølge in vitro og in vivo studier på mus, herunder godartede normale brystepitelceller M1-celler, HRAS-transformerede præmaligne M2-celler, og stærkt metastatiske MDA-MB-231-celler, 1 dag efter injektion (dpi) fremefter. En høj opløsning konfokal mikroskopi billedet viste, at MDA-MB-231-celler (rød) udviser en aggressiv fænotype, med uregelmæssige grænser i perivitelline rum. Pseudopodia udvækster og invasive fronter forekom også hyppigt (Figur 4A, venstre). Enkelte celler formidles i blodcirkulationen så tidligt som 1 dpi (figur 4A, højre). Ved 2 dpi blev klar formidling observeret i de distale dele af fisken (figur 4A, højre). Antallet af disseminerede celler steg yderligere ved 3 dpi (figur 4A og 4D). I modsætning hertil, når M2-celler blev udfordret i zebrafisk, de udviste beskedent spread i fiskekroppen efter 2 dpi (figur 4B). De viste også øget udbredelse på gang igennem (figur 4F). Som vist i figur 4C og 4G, M1 celler sjældent formidles i zebrafisk omsætning, og selv aktiv lokal migration i perivitelline rum var sjældent under observationsperioden. M1 cellemasse blev næsten tilbageholdt ved den oprindelige injektionsstedet. Hvis definere positiv formidling eller metastaser som> 5 celler i fisken kropss = "xref"> 4, MDA-MB-231 og M2 cellemetastase blev observeret i 92% og 57% af fisk, henholdsvis ved 3 dpi (figur 4G). I modsætning hertil blev ingen positiv formidling observeret med M1 celler. Derfor er denne zebrafisk model af human cancercelle progression præcist afspejler det relative niveau af metastatisk potentiale af de forskellige celler i mus. Neovaskularisering (grønne), der spirede fra subintestinal plexus af det embryoniske zebrafisk og trængte MDA-MB-231 eller M2 cellemasse var også til stede efter perivitelline space injektion af tumorceller efterfulgt af 3 dages inkubation (figur 4A og 4B, venstre ). Overensstemmelse med handicap i formidling, blev kun lille neovaskularisering detekteres ved M1 celleimplantation (figur 4C).
I det embryoniske xenograft zebrafisk model med mCherry-mærkede MDA-MB-231-celler og Doc injektion, laboratorietELED kræftceller i halefinne af zebrafisk anses repræsentative for aktiv ekstravasation. De mCherry-mærkede MDA-MB-231 celler blev injiceret ved 2 dpf. Ved 3 dpi, cellerne begyndte at migrere ud af beholderne til halefinne, der er beriget med collagen. Single MDA-MB-231-celler migreret én efter én, uafhængigt af de fartøjer, til den fjerne halefinne (figur 5A). Ved 6 dpi, kunne invasionen kvantificeres ved at tælle antallet af celler, der migrerede ind i halefinne væv. I mCherry-mærkede M2 celle Doc injektion model blev injektionen også udført ved 2 dpf. Imidlertid blev en klynge fænotype observeret under den aktive ekstravasation proces. Ved 1 dpi, M2 celler begyndte at migrere ud fra skibene ind i CHT af zebrafisk. Ved 2 dpi, begyndte de migrerede M2-celler til dannelse af en klynge mellem fartøjerne i CHT (figur 5B). Kvantificering af M2 invasiv celle klynge nummer i CHT regionen kunne udføres ved6 dpi.
Figur 1: De vigtigste trin for at undersøge den invasive opførsel af brystcancerceller i embryoniske zebrafisk. (A) Efter at have krydset parental zebrafisk natten over Tg (FLI1: EGFP) zebrafiskembryoer blev opsamlet den følgende morgen og blev holdt ved 28 ° C. (B) Embryoerne blev dechorionated med fine pincet under et stereomikroskop 48 timer efter befrugtning (HPF). De mærkede brystcancerceller blev opsamlet og resuspenderet i en lille mængde PBS. Efter godt fremstilling blev suspenderede celler fyldt i en nål. Ca. 400 celler blev injiceret i kanalen af Cuvier (dok) af perivitelline rum under et stereomikroskop. De injicerede embryoner blev holdt ved 33 ° C. (C) 2 h efter injektion (hpi) blev embryoerne underkastet caomhyggelige screening under en fluorescens stereomikroskop. Embryonerne blev holdt ved 33 ° C i 3 eller 6 dage. Under intervallet blev embryoerne underkastes designet behandling. (D) Cancer celle formidling af perivitelline space injektion eller invasion af Doc injektion blev påvist, talt og afbildes ved konfokal mikroskopi 3 eller 6 dage efter injektion (dpi). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: perivitelline space injektionsstedet almindelige fejl. (A) Ca. 400 mCherry-mærkede celler (MDA-MB-231) blev injiceret i perivitelline rum. Den lysfelt (øverste), grøn kar (midten øverst), og erytrocytmassen (midterste lavere) i injicereed zebrafiskembryoer blev erobret af konfokalt mikroskop. Det flettede billede (nederste) af de tre kanaler viser stereo placering af cellemassen i embryoet. (B) Cellerne ikke målrette perivitelline rum passende. Blommesækken blev sprængt. (C) Injicerede celler under tærskelværdien (meget mindre end 400). (D) Injicerede celler over tærskelværdien (meget mere end 400). Cellemassen var for tæt på kanalen i Cuvier, som har et bredt blodet. Målestok = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Oversigt over kanalen i Cuvier (dok) injektion. (A) Skematisk af Doc injektion ved 2 dage efter befrugtning (dpf) med brystkræft celler i zebrafisk embryoner. Pilen viser dok. (B) Eksempler på positive injektioner, med omkring 400 brystcancerceller; negative injektioner, herunder blommen misinjection; og et forkert antal celler injiceret ved 4 hpi. Pile og cirkler indikerer injicerede celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Sammenligning af formidling evne blandt forskellige bryst cellelinier. Ca. 400 mCherry-mærket MDA-MB-231, MCF10Aras (M2), eller MCF10A (M1) celler blev injiceret i perivitelline rum af zebrafiskembryoer 48 HPF. De injicerede embryoner blev fulgt i 3 dage. (A, B, og C) High-resolution mikrografer, der viser den repræsentative migration og formidlingsprocessen af MDA-MB-231 (A), M2 (B), og M1 (C) celler i individuelle embryoniske legemer 1, 2 og 3 dage efter injektion (dpi). Venstre, celle migration i perivitelline rum (rød) og den peritumoral og intratumoral vaskulatur (grøn). Gule signaler indikerer overlapningen af mikrokar og celler. Mellemøsten, hele billedet af fosteret. Ret, visualisering af formidlede celler i den bageste af fostrene. Gule pilespidser angiver enkelte disseminerede celler. Målestok = 50 um. (D, E og F) Kvantificering af antallet af disseminerede celler i hver embryoniske krop ved 1, 2, og 3 dpi. Resultaterne er udtrykt som middelværdien ± SEM. Resultater fra envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af post-hoc analyse er vist. P <0,05 blev accepteret som statistisk signifikant (* 0,01 <P <0,05; ** 0.001 <P <0,01; *** P <0,001. (G) Sammenligning af forekomsten af intravasation for MDA-MB-231, M2, og M1 celler i embryonale organer på 1, 2, og 3 dpi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Forskellige adfærd af MDA-MB-231 og M2 cellemetastase i zebrafisk med kanalen i Cuvier injektion. (A) Repræsentative konfokale billeder af zebrafisk følges på 3, 4 og 5 dpi viser enkelt-cellemigrering opførslen af MDA-MB-231 celler i zebrafisk. Pile viser invasive MDA-MB-231-celler, der migrerede ud af beholderne i tailfins. Skala bar = 200 um i venstre kolonne, 50 um i den højre kolonne. (B) repræsentantkonfokale billeder af zebrafisk følges på 1, 2, og 3 dpi at vise celleklyngen migration adfærd M2-celler i zebrafisk. Pile viser invasive M2-celler, der migrerede ud af beholderne til den kaudale hæmatopoietisk væv (CHT) og dannede en klynge mellem fartøjerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi to metoder til at undersøge den invasive opførsel af brystcancerceller i Tg (FLI1: EGFP) zebrafiskembryoer, med perivitelline rum og dok injektioner. Ved at injicere cancerceller mærket med kemisk farvestof eller fluorescerende protein i transgene zebrafiskembryoer, kan de dynamiske og rumlige karakteristika for invasion og metastase tydeligt spores i realtid på enkelt-celle eller klyngeniveau under et fluorescensmikroskop. I de fleste tilfælde den hurtige progression af metastase i zebrafisk sikrer, at assay kan udføres inden for 1 uge efter transplantation. Desuden kan kraftfulde statistik opnås med store grupper af fisk.
Tidlige og sene begivenheder i metastatiske kaskade kunne simuleres og sammenfattet ved at indsprøjte kræftceller i perivitelline rum eller Doc hhv. Den perivitelline rum er det afgrænsede rum mellem peridermen af fisken og blommesækken, som allows én til at overvåge udbredelsen af enkelte tumorceller fra primære steder i det levende legeme. Efter implantering, kræftcellerne undergår lokal migration og invasion i perivitelline rum (behandlede primære sted) og derefter de intravasate i blodkar og udbrede sammen med kredsløbet. Ved hovedet og halefinne (betragtet fjerne målsteder), cancerceller ophobes i smalle kapillarlag og ekstravasatet. Derfor er antallet af celler, som findes ved de fjerne steder i fiskekroppen er en måling af metastatisk kapacitet. Desuden kan mere ekstravaseret celler iagttages på senere tidspunkter, hvilket også gælder for Doc injektion assay.
Doc er et forstørret fælles kardinalvene med en omfattende blodstrømmen 24. Direkte rettet mod Doc som injektionssted introducerer kræftceller i kredsløbet. I praksis brystcancerceller diffundere gennem det embryoniske kroppen viablodstrømmen straks efter Doc injektion. Cellerne derefter arrestere på den caudale vene og dorsale aorta. Ekstravasation invasion, og mikrometastase dannelse kan observeres successivt inden for 6 dage. Som tidligere 16 rapporteret, metastatiske MDA-MB-231-celler og præmaligne brystepitelceller M2-celler udviser forskellige invasive fænotyper. MDA-MB-231 celler undergår encellede invasion af kollagenmatrixen-rige halefinne. Således kan invasionen potentiale af MDA-MB-231-celler måles ved at tælle antallet af celler, som har ekstravaseret og invaderet halefinne væv. I modsætning hertil M2 celler danner klynger af forskellige størrelser og gennemgå kollektive invasion af CHT. Kvantificering af invasion potentiale M2-celler ved at tælle antallet af klynger i denne protokol er vanskelig og udføres fortrinsvis ved at lave et 3D-billede ved hjælp konfokal mikroskopi og bestemmelse af rumfanget af klynger af tumorceller.
Den tekniske udfordring i kræftcellen mikroinjektion er lykkedes at målrette perivitelline rum eller dok. Mikroinjektionen af store antal embryoer er en kedelig procedure, som kræver en højt kvalificeret og patient operatør. Faktorer, der bidrager til variationer i resultaterne i de enkelte fisk omfatter udviklingsstadium embryonet ved injektion, forskelle i antallet af injicerede celler, og lækagen af celler ind i blommesækken. Men sjældne, kunne manipulationen utilsigtet trænger vaskulaturen og introducere celler ind i kredsløbssystemet direkte, især i perivitelline rum injektion. For yderligere at reducere variation og for at sikre pålideligheden af analyserne, er det nødvendigt mikroskopisk undersøgelse for at udelukke ukvalificeret fisk på tidspunkter i hele processen. Hertil kommer, blændet analyse af en professionel uden kendskab til den indstilling er kraftigt antydet at opnå saglig kvantificering.
Sammenfattende de to modeller vi introduceret her kaste lys overvisualisere processerne og -metastase in vivo uden invasive procedurer. Selvom vi kun studeret brystkræftceller i to modeller med hensyn metastatisk potentiale, kunne de ekstrapoleres til andre former for kræft. Endvidere kunne modellerne har bredere anvendelser i fastlæggelsen af mekanismer og nye molekylære mål styrer cancercelle metastase under anvendelse af (epi) genetisk manipulation. Grund af den højere penetrerbarheden af zebrafiskembryoer af forbindelser med små molekyler sammenlignet med fodring eller injektion af gnavere 25, de to præsenterede modeller har også fordele med hensyn til high-throughput screening af potentielle nye anti-invasion / metastase narkotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Undersøgelser af TGF-β familiemedlemmer understøttes af Cancer Genomics Centre Holland. Sijia Liu og Jiang Ren understøttes af Kina Scholarship Rådet for 4 års studier ved universitetet i Leiden. Vi takker Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) for de MCF10A cellelinjer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
- Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).
- Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).
- Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).
- Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, Suppl 1. 62-87 (2003).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).
- He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
