Summary
We beschrijven hier xenograft zebravismodellen behulp van twee verschillende injectieplaatsen, dat wil zeggen, perivitelline ruimte en het kanaal van Cuvier, aan de invasief gedrag te onderzoeken en de intravasation en extravasatie potentieel van menselijke borstkankercellen respectievelijk beoordelen.
Abstract
In veel gevallen hebben kankerpatiënten niet sterven van een primaire tumor, maar eerder als gevolg van metastase. Hoewel tal van knaagdier modellen zijn beschikbaar voor het bestuderen van uitzaaiing van kanker in vivo, worden ook andere efficiënte, betrouwbare, goedkope modellen die nodig zijn om snel toegang te krijgen tot de mogelijke effecten van (epi) genetische veranderingen of farmacologische verbindingen. Als zodanig, we illustreren en uitleg over de haalbaarheid van het xenograft modellen met behulp van menselijke borstkankercellen geïnjecteerd in zebravis embryo's om dit doel te ondersteunen. Onder de microscoop zijn fluorescerende eiwitten of chemisch gemerkte menselijke borstkankercellen getransplanteerd in transgene zebravis embryo, Tg (fli: EGFP), de perivitelline ruimte of kanaal van Cuvier (doe) 48 uur na bevruchting. Kort daarna is de tijdruimtelijke proces van kankercel invasie, verspreiding, en metastase in het levende vis lichaam zichtbaar gemaakt onder een fluorescentiemicroscoop. De modellen met behulp van verschillende injectieplaatsen, dat wil zeggen, perivitelline ruimte of Doc complementair aan elkaar, als gevolg van de vroege fase (intravasation stap) en de late fase (stap extravasatie) van de meerstaps metastatische cascade van gebeurtenissen. Bovendien kan peritumorale en intratumorale angiogenese worden waargenomen met de injectie in de perivitelline ruimte. De gehele experimentele periode is niet meer dan 8 dagen. Deze twee modellen combineren cel labeling, micro-transplantatie, en fluorescentie beeldvormende technieken, waardoor de snelle evaluatie van kanker metastase in reactie op de genetische en farmacologische manipulaties.
Introduction
Openlijke uitzaaiing in de kliniek omvat een reeks complexe en multi-step events zogenaamde "metastatische cascade". De cascade is uitvoerig beoordeeld en kan worden ontleed in opeenvolgende stappen: de lokale invasie, intravasation, verspreiding, arrestatie, extravasatie, en kolonisatie 1, 2. Een beter begrip van de pathogenese van kanker metastase en de ontwikkeling van potentiële therapeutische strategieën in vivo vereisen robuuste gastheer modellen van kankercel te verspreiden. Knaagdiermodellen zijn goed ingeburgerd en worden veel gebruikt voor metastase 3 evalueren, maar deze benaderingen hebben lage efficiëntie en ethische beperkingen en zijn kostbaar als voorgrond model om te bepalen of een bepaalde manipulatie kunnen hebben voor de metastatische fenotype. Andere efficiënte, betrouwbare, goedkope modellen zijn nodig om snel toegang te krijgen tot de mogelijke effecten van (epi) genetische veranderingen of pharmacologsche verbindingen. Vanwege hun hoge genetische homologie voor mens en transparantie van de embryo zebravis (Danio rerio) naar voren gekomen als een belangrijke gewervelde model en worden steeds meer toegepast voor het onderzoek van ontwikkelingsprocessen, microbe-gastheer interacties, menselijke ziekten, screening van geneesmiddelen, enz . 4. De in de zebravis gevestigde uitzaaiing van kanker modellen kunnen een antwoord op de tekortkomingen van knaagdiermodellen 5, 6 te bieden.
Het spontaan neoplasie nauwelijks is te zien in wild zebravis 7, zijn er verschillende langdurige technieken om de gewenste kanker in zebravis induceren. Carcinogeen-geïnduceerde genmutaties of signaleringsroute activering kan histologisch en moleculair model carcinogenese, nabootsen menselijke ziekte zebravis 7, 8, 9. door taking maken van diverse voorwaartse en omgekeerde genetische manipulaties van oncogenen of tumor suppressors, (transgene) zebravis konden ook potentieelstudies van vorming en instandhouding 6, 10 kanker. De geïnduceerde kankermodellen in zebravis bestrijken een breed spectrum, zoals spijsvertering, voortplanting, bloed, zenuwstelsel en epitheliale 6.
Het gebruik van zebravis in kankeronderzoek is onlangs uitgebreid als gevolg van de oprichting van de menselijke tumorcel xenograft modellen in dit organisme. Dit werd voor het eerst gemeld met menselijke gemetastaseerd melanoom cellen die met succes werden geënt in zebravis embryo's in het blastula stadium in 2005 11. Verschillende onafhankelijke laboratoria hebben de haalbaarheid van dit pionierswerk gevalideerd door het inbrengen van een breed scala van zoogdierlijke kankercellen lijnen in zebravis op verschillende plaatsen en ontwikkelingsstadia 5 </ Sup>. Bijvoorbeeld injecties bij de blastoschijf en blastocyst van het blastula stadium; injecties in de dooierzak, perivitelline ruimte, kanaal van Cuvier (Doc), en achterste hoofdader van 6-H- tot 5 dagen oude embryo's; en injecties in de buikholte van de 30-dagen oude immuungesuppresseerde larven zijn uitgevoerd 5, 12. Bovendien werden allogene transplantaties tumor ook vermeld in zebravis 12, 13. Een van de grote voordelen van het gebruik van xenotransplantaten is dat de geënte kankercellen kan gemakkelijk fluorescerend gemerkt en onderscheiden van normale cellen. Derhalve onderzoek naar het dynamische gedrag van microtumor formatie 14 cellen invasie en metastase 15, 16, 17, door tumor geïnduceerde angiogenese 15, 18, en de interacties tussen kankercellen en gastheerfactoren 17 duidelijk worden gevisualiseerd in levende vislichaam, vooral wanneer transgene zebravis lijnen toegepast 5.
Geïnspireerd door het grote potentieel van zebravis xenograftmodellen metastase evalueren we aangetoond dat de transvasculaire extravasatie eigenschappen van verschillende borstkanker cellijnen in de staartvin gebied van Tg (Amst: EGFP) zebravis embryo's door middel van Doc injecties 16. De rol van transforming growth factor-β (TGF-β) 16 en bot morfogenetisch proteïne (BMP) 19 signaalwegen in pro- / anti-borstkankercellen invasie en metastase werden ook onderzocht in dit model. Bovendien hebben we recapituleerde ook de intravasation vermogen van verschillende borstkanker cellijnen in het verkeer met behulp van xenograft zebravismodellen met perivitelline ruimte injecties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al het onderzoek met behulp van de transgene fluorescerende zebravis Tg (Amst: EGFP) stam, die groen fluorescerend eiwit is verbeterd (EGFP) gemerkt vaatstelsel 20, met inbegrip van huisvesting en experimenten, werd uitgevoerd in overeenstemming met de internationale richtlijnen en werd goedgekeurd door de lokale Institutional Comité for Animal Welfare (Dier Ethische commissie (DEC) van het Leids Universitair medisch Centrum.
Opmerking: Zoals weergegeven in figuur 1, wordt het protocol ruwweg onderverdeeld in vier stappen: het embryo (Figuur 1A), micro-injectie (Figuur 1B), screening (figuur 1C) en analyse (figuur 1D).
1. Bereid de injectienaalden
- Bereid injectienaalden met borosilicaatglas microcapillairen. Liep microcapillair in een micropipet trekinrichting met de volgende instellingen: luchtdruk, 500; warmte, 650; pull, 100; velocity, 200; tijd,40. Bewaar de injectienaalden in een naaldhouder plaat totdat ze worden gebruikt voor injectie.
2. Bereid de TL, genetisch gelabelde borstkankercellen voor injectie
- Humane borstkanker MDA-MB-231-cellen bij 37 ° C in DMEM-hoog-glucose-medium bevattende L-glutamine, 10% foetaal runderserum en 1: 100 penicilline-streptomycine (pen-strep).
- Cultuur de borst epitheliale cellijnen, MCF10A (M1) en MCF10A-Ras (M2), bij 37 ° C in DMEM / F12 medium met L-glutamine met 5% paardenserum, 20 ng / ml epidermale groeifactor, 10 mg / mL insuline, 100 ng / ml cholera enterotoxine, 0,5 mg / ml hydrocortisone en 1: 100 pen-strep.
- Produceren mCherry lentivirus door co-transfectie PLV-mCherry, pCMV-VSVG 21, pMDLg-RRE (gag / pol) 22 en pRSV-REV 22 plasmide in HEK293T-cellen. Oogst celsupernatanten 48 uur na transfectie en bewaar bij -80 ° C.
- iknfect MDA-MB-231, M1 en M2 cellen bij 30% confluentie gedurende 24 uur met lentivirale supernatanten verdund 1: 1 met normaal kweekmedium bij aanwezigheid van 5 ng / ml polybreen.
- Selecteert eencellige klonen door verdunning van cellen in een plaat met 96 putjes, waarbij de uitgroei van geïsoleerde cel klonen toelaat, tot het verkrijgen van het stabiele mCherry expressie brengende cellijnen.
- Cultuur een T75 kolf van cellen voor injectie. Oogst de cellen bij 80% confluentie met een 0,5% trypsine-EDTA behandeling. Was de cellen met 1x PBS 2-3 keer.
- Resuspendeer de cellen in 200 pi PBS. Bewaar bij hen 4 ° C gedurende minder dan 5 uur voor injectie.
3. Bereid zebravis embryo's Injectie
- Opgericht zebravis broedparen en verzamel embryo, zoals in een eerder Jove artikel van Rosen et al. 23.
- Selecteer de embryo's die bij 0-4 HPF door het verwijderen van de onbevruchte en abnormale embryo's. Houd de embryo's in een Petri dish vol eieren water (60 ug / ml zeezout; -60 embryo / plaat) en incubeer bij 28 ° C.
- Dechorionate de embryo's met fijne pincet op 48 HPF.
- Verdoven de embryo's door ze tot 40 ug / ml tricaïne (3-aminobenzoëzuur) bevattende ei water ongeveer 2 minuten voorafgaand aan injectie, maar niet langer dan 2 uur voor injectie.
OPMERKING: tricaïne voorraadoplossing (4 mg / ml, 100x) wordt bereid als 400 mg tricaïne poeder in 97,9 ml tweevoudig gedestilleerd water en 2,1 ml 1 M Tris-base (pH 9), met de pH ingesteld op 7,4. Bewaren in de -20 ° C vriezer.
4. Spuit menselijke borstkankercellen in de perivitelline Space
- Belasting 15 pi van de celsuspensie in een injectienaald. Monteer de naald op de micromanipulator en breek de naaldpunt met fijne pincet om een tip openingsdiameter van 5-10 urn.
- Gebruik een pneumatische picopump en een manipulator aan de micro-injectie uit te voeren. stellinst de picopump 400 cellen telkens de injectieplaats. Voorafgaand aan injectie tellen celaantallen handmatig door het injecteren van de cellen op de top van een petrischaal met 1% agarose.
- Line up onder narcose embryo's (2-3 dagen na de bevruchting (DPF)) op een vlakke, 1% agarose injecteren plaat, ongeveer 10 embryo's per keer.
- Oriënteren de injectieplaat met de hand tijdens de injecties om de embryo's in de gewenste positie plaatsen van de naald (bijv diagonaal).
- Richt de naaldpunt op de injectieplaats en voorzichtig steek de naald in de perivitelline ruimte tussen de dooierzak en periderm van de zebravis embryo (Figuur 2A).
- Injecteer ongeveer 400 mCherry gemerkte tumorcellen. Zorg ervoor dat de dooierzak niet wordt gescheurd aan implantatie in de dooierzak te vermijden.
5. Spuit Menselijke borstkankercellen in de Doc
- Bereid de injectienaald en zebravis embryo's zoals beschreven i n protocol stappen 1, 2 en 3.
- Met een naald 45 ° hoek, zodat de doe kan worden benaderd vanuit de dorsale zijde van het embryo.
- Steek de naald in het beginpunt van het Doc (figuur 3A), net dorsaal waar het kanaal begint verbreding via dooierzak en injecteer ongeveer 400 cellen; de injectie is correct als het volume binnen het kanaal direct na de puls en de dooierzak expandeert.
OPMERKING: meerdere opeenvolgende injecties kan worden uitgevoerd zonder het extraheren van de naald. - Breng de geïnjecteerde zebravis embryo ei water.
OPMERKING: aanzienlijke verschillen bestaan tussen afzonderlijke zebravis embryo en de dood van embryo na injectie optreden, zou een relatief groot aantal zebravis embryo's (ongeveer 100) worden geïnjecteerd met kankercellen. - Handhaving van de zebravis embryo's bij 33 ° C de optimale temperatuur vereisten voor vissen en zoogdiercellen tegemoet.
- Scherm elke vis onder een fluorescentie stereomicroscoop bij 2 uur na injectie (p.i.) voor de perivitelline ruimte injectie (figuur 2) of 2-24 hpi de doe injectie (figuur 2), zodat alle embryo's worden geïnjecteerd met een vergelijkbaar aantal tumorcellen. Verwijder de embryo's met injectie fouten, zoals scheuren (figuur 2B) of injecties (figuur 3B) van de dooierzak en bereiken embryo's met onder geïnjecteerde cellen (Figuren 2C en 3B) of boven (Figuren 2D en 3B) drempelwaarde. Bewaar alleen de embryo's met ongeveer 400 cellen in kweek.
- Uitsluiten dat de cellen direct in het verkeer gedurende het injectieproces door verwijdering van de embryo's met cellen die reeds in omloop worden gebracht. Verwijder bovendien alle embryo met een celmassa dichtbij het Doc (Figuur 2D
7. Beeld en Analyseer het metastatische proces
- Verzamel verschillende verdoofd embryo's met een breed uiteinde Pasteur pipet en over te brengen naar de glazen bodem van een polystyreen schaaltje.
- Overtollig water en houdt een beperkte hoeveelheid ei water. Manipuleren van de embryo in positie met een haar loop gereedschap en plaats een deksel bovenop het glas.
- Gebruik een omgekeerde confocale microscoop in combinatie met water onderdompeling of interlokale droog doelstellingen. Plaats de embryo zodanig dat de regio van belang is zo dicht mogelijk bij het doel mogelijk te maken.
- Voer imaging onmiddellijk na de anesthesie om het risico op overlijden te verminderen als gevolg van vloeistof verdamping.
- Capture signalen van EGFP-gelabelde vasculatuur en mCherry-gelabelde tumorcellen op dezelfde positie op het embryo om samen te registreren geïnjecteerde cellen van bloedvaten door het samenvoegen van de twee kanalen beeldvorming.
- Voor elke zebravis embryo, het verzamelen van twee verschillende sets van beeldenhet kopgebied en staartgebied.
- Kwantificeren aantal verspreide cellen.
- Perivitelline ruimte voor injecties, tel het aantal cellen in elke vis die in de kop- en staartgebieden 4, 15 zijn verspreid vanuit de celmassa richting embryonale vislichaam; de regio's buiten de grenzen van de hartholte frontaal bovenop de blaas dorsaal zwemmen, en buiten de urogenitale opening caudaal.
- Voor het Doc injectie tel het aantal individuele cellen die de collageenvezels van de staartvin zijn binnengedrongen uit de circulatie (MDA-MB-231) of het aantal clusters uit cellen collectief (M2) in de caudale hematopoietische weefsel (CHT) van elke zebravis 19.
- Bestudeer invasie en metastase in meer detail met behulp van confocale microscopie (sterk aanbevolen).
- Gebruik een lage vergroting (4x objectief) het imago van de helelichaam en een overzicht van de tumorcelverspreiding patroon te verkrijgen.
OPMERKING: Hogere vergroting (20x en 40x doelstellingen) is geschikt voor het bestuderen van intra- en peri-tumorale angiogenese en de precieze lokalisatie van verspreid cellen in het embryo lichaam. - Met een 488 nm laser om de zebravisembryo vaatstelsel en een 543 nm laser scannen geïmplanteerde tumorcellen gemerkt met rode fluorescentie scan. Het verkrijgen van een afbeelding met hoge kwaliteit door het scannen van elk embryo in acht tot tien stappen. Scannen en gemiddeld elke stap zes keer.
- Gebruik een lage vergroting (4x objectief) het imago van de helelichaam en een overzicht van de tumorcelverspreiding patroon te verkrijgen.
- Plaats het embryo terug in het ei water als het nodig is voor verdere experimenten.
8. Voer Statistische analyse met behulp van One-analyse van de variantie (ANOVA) Gevolgd door post hoc analyse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de embryonale xenograft zebravis model met een perivitelline ruimte injectie wordt de hematogene verspreiding van gemerkte kankercellen in de vis lichaam beschouwd als actieve migratie. Dit proces kan worden gedetecteerd en gekwantificeerd onder een fluorescentiemicroscoop, zoals beschreven in de werkwijzen hierboven. Deze xenograft model te illustreren, volgden we de verspreidingsproces verschillende borstkankercellijnen met bekende (of zonder) invasie / metastase potentieel volgens in vitro en in vivo muizen hebben, waaronder goedaardige normale borstepitheelcellen M1 cellen, HRAS-getransformeerde premaligne M2 cellen, en zeer metastatische MDA-MB-231-cellen, 1 dag na de injectie (dpi) verder. Een afbeelding in hoge resolutie confocale microscopie toonde aan dat MDA-MB-231-cellen (rood) vertonen een agressieve fenotype, met onregelmatige randen in de perivitelline ruimte. Pseudopodia uitsteeksels en invasieve fronten kwamen ook frequent voor (Figuur 4A, links). Enkele cellen verspreid in de bloedsomloop al dpi 1 (figuur 4A, rechts). 2 dpi, werd duidelijk waargenomen verspreiding in de distale delen van de vis (figuur 4A, rechts). Het aantal verspreide cellen verder toegenomen 3 dpi (figuur 4A en 4D). Wanneer daarentegen M2 cellen werden uitgedaagd zebravis, vertoonden zij geringe spreiding in de vislichaam na 2 dpi (figuur 4B). Zij toonden ook toegenomen verspreiding na de tijd verstreek (figuur 4F). Zoals getoond in figuur 4C en 4G, M1 cellen onregelmatig verspreid in de zebravis verkeer en zelfs actieve lokale migratie binnen de perivitelline ruimte was onregelmatig tijdens de observatieperiode. De M1 celmassa werd vrijwel vastgehouden op de oorspronkelijke plaats van injectie. Als het definiëren van een positieve verspreiding of metastase> 5 cellen in de vis lichaamss = "xref"> 4, MDA-MB-231 en M2 metastase werd waargenomen bij 92% en 57% vis, respectievelijk 3 dpi (Figuur 4G). Daarentegen werd geen positieve verspreiding waargenomen met M1 cellen. Daarom is deze zebravis model van humane kankercel progressie getrouw de relatieve niveau van metastatisch potentieel van de verschillende cellen in muizen. Neovascularisatie (groen) die voortkwam uit de subintestinale plexus van de embryonale zebravis en doorgedrongen tot de MDA-MB-231 of M2 celmassa werd ook na de perivitelline ruimte injectie van tumorcellen gevolgd door 3 dagen incubatie (figuur 4A en 4B, links ). In overeenstemming met de beperking van verspreiding werd slechts geringe neovascularisatie gedetecteerd bij M1 celimplantatie (Figuur 4C).
In de embryonale xenograft zebravis model met mCherry-gelabelde MDA-MB-231 cellen en de Doc injectie, het labeLED kankercellen in de staartvin van de zebravis worden beschouwd als vertegenwoordiger van actieve extravasatie. De mCherry-gelabelde MDA-MB-231-cellen werden geïnjecteerd op 2 dpf. Bij 3 dpi, de cellen begonnen te migreren uit de vaten aan de staartvin, die is verrijkt met collageen. Single MDA-MB-231 cellen gemigreerd één voor één, onafhankelijk van de vaten naar het verre staartvin (Figuur 5A). 6 dpi, kan de invasie worden gekwantificeerd door het tellen van het aantal cellen dat gemigreerd naar de staartvin weefsel. In de mCherry gemerkte M2 cellen Doc injectiemodel, werd de injectie ook uitgevoerd bij 2 dpf. Er werd echter een geclusterde fenotype waargenomen tijdens de actieve extravasatie proces. Op 1 dpi, M2 cellen begon te migreren van de vaten in de CHT van de zebravis. 2 dpi, M2 gemigreerde cellen begonnen met een cluster tussen de schepen in de CHT (figuur 5B) te vormen. Kwantificering van de M2 invasieve cel cluster nummer in de regio CHT kan worden uitgevoerd op6 dpi.
Figuur 1: Belangrijkste stappen voor het onderzoeken van het invasief gedrag van borstkankercellen in embryonale zebravis. (A) Na overnacht kruising ouderlijke zebravis, Tg (fli1: EGFP) zebravis embryo's werden de volgende ochtend werden verzameld en bij 28 ° C gehouden. (B) De embryo's werden dechorionated met fijne pincet onder een stereomicroscoop 48 uur na de bevruchting (HPF). De gelabelde borstkankercellen werden verzameld en opnieuw gesuspendeerd in een kleine hoeveelheid PBS. Na goed bereiding gesuspendeerd cellen geladen in een naald. Ongeveer 400 cellen werden geïnjecteerd in het kanaal van Cuvier (Doc) van de perivitelline ruimte onder een stereomicroscoop. De geïnjecteerde embryo's werden bij 33 ° C gehouden. (C) 2 uur na injectie (p.i.) werden de embryo's die zijn cazorgvuldig en voorzichtig screening onder een fluorescentie stereomicroscoop. De embryo's werden bij 33 ° C gedurende 3 of 6 dagen gehandhaafd. Tijdens de pauze werden de embryo's die zijn gemaakt van de behandeling. (D) de verspreiding cel Kanker door perivitelline ruimte injectie of invasie door Doc injectie werd waargenomen, geteld en afgebeeld door confocale microscopie 3 of 6 dagen na de injectie (dpi). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: perivitelline ruimte injectieplaats en veel voorkomende fouten. (A) Ongeveer 400 mCherry-gemerkte cellen (MDA-MB-231) werden geïnjecteerd in de perivitelline ruimte. De helderveld (bovenste), groene vasculatuur (midden boven) en erytrocytenmassa (midden onder) van injected zebravis embryo's werden gevangen genomen door confocale microscoop. De samengevoegde afbeelding (onderste) van de drie kanalen toont de stereo locatie van de celmassa van het embryo. (B) De cellen niet op de juiste wijze richten op de perivitelline ruimte. De dooierzak was gescheurd. (C) geïnjecteerde cellen beneden niveau (minder dan 400). (D) geïnjecteerde cellen boven de drempelwaarde (meer dan 400). De celmassa te dicht bij het kanaal van Cuvier, die een breed bloedstroom heeft. Schaalstaaf = 50 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Overzicht van het kanaal van Cuvier (doe) injectie. (A) Schematische voorstelling van de doe injectie 2 dagen na de bevruchting (dpf) met borstkanker cellen in de zebravis embryo's. De pijl geeft het doe. (B) Als positieve injecties, met ongeveer 400 borstkankercellen; negatieve injecties, waaronder de dooier misinjection; en een onjuist aantal geïnjecteerde cellen bij 4 hpi. Pijlen en cirkels geven geïnjecteerde cellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Vergelijking van de verspreiding van het vermogen tussen de verschillende borst-cellijnen. Ongeveer 400 mCherry gemerkte MDA-MB-231, MCF10Aras (M2) of MCF10A (M1) cellen werden geïnjecteerd in de perivitelline ruimte van zebravisembryo's 48 HPF. De geïnjecteerde embryo's werden gedurende 3 dagen. (A, B, en C) High Resolutie microfoto toont representatieve migratie en verspreidingsproces MDA-MB-231 (A), M2 (B) en M1 (C) cellen in embryoethische lichamen 1, 2 en 3 dagen na injectie (dpi). Links, cel migratie in de perivitelline ruimte (rood) en de peritumorale en intratumorale vaatstelsel (groen). Geel signalen geven de overlap van microvaatjes en cellen. Midden, het gehele beeld van het embryo. Rechts, visualisatie van verspreide cellen in de achterkant van het embryo. Gele pijlpunten geven enkele uitgezaaide cellen. Schaalstaaf = 50 urn. (D, E en F) Kwantificering van het aantal verspreide cellen per embryo lichaam 1, 2 en 3 dpi. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SEM. Resultaten van één variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door post-hoc analyse worden getoond. P <0,05 werd aanvaard als statistisch significant (* 0,01 <p <0,05; ** 0.001 <P <0,01; *** P <0,001. (G) Vergelijking van de incidentie van intravasation voor MDA-MB-231, M2 en M1 cellen embryonale organen 1, 2 en 3 dpi. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Verschillend gedrag van MDA-MB-231 en M2 metastase in zebravis met duct van Cuvier injectie. (A) Vertegenwoordiger confocale beelden van zebravis gevolgd gedurende 3, 4 en 5 dpi de eencellige migratiegedrag van de MDA-MB-231-cellen in de zebravis vertonen. Pijlen geven invasieve MDA-MB-231-cellen die uit de vaten gemigreerd naar de staartvinnen. Schaal bar = 200 urn in de linkerkolom, 50 urn aan de rechterkant. (B) Vertegenwoordigerconfocale beelden van de zebravis gevolgd na 1, 2 en 3 dpi voor de cel cluster migratiegedrag van M2 cellen in de zebravis vertonen. Pijlen geven invasieve M2 cellen die uit de vaten gemigreerd naar de caudale hematopoietische weefsel (CHT) en vormden een cluster tussen de vaten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreven we twee methoden om de invasief gedrag van borstkankercellen in Tg (fli1: EGFP) onderzoeken zebravis embryo's, met perivitelline ruimte en Doc injecties. Door het injecteren van kankercellen gelabeld met chemische kleurstof of fluorescent eiwit in transgene zebravis embryo, kan de dynamische en ruimtelijke eigenschappen van invasie en metastase duidelijk worden bijgehouden in real time bij de enkele-cel of cluster niveau onder een fluorescentiemicroscoop. In de meeste gevallen, de snelle progressie van metastase in de zebravis, zodat de assay binnen 1 week kan worden uitgevoerd na transplantatie. Bovendien kan krachtige statistieken worden verkregen met grote cohorten van vis.
Vroege en late gebeurtenissen van de metastatische cascade kunnen worden gesimuleerd en recapituleerde door het injecteren van kankercellen in de perivitelline ruimte of doe resp. De perivitelline-ruimte is de beperkte ruimte tussen de periderm van de vis en de dooierzak die allows één van de verspreiding van enkele tumorcellen uit primaire locaties in het levende lichaam te controleren. Na implantatie van de kankercellen ondergaan lokale migratie en invasie in de perivitelline ruimte (als de primaire plaats) en vervolgens intravasate zij in bloedvaten en verspreiden samen met de circulatie. Aan het hoofd en de staartvin (beschouwd als verafgelegen doelwit sites), kankercellen zich ophopen in smalle capillaire bedden en extravasaat. Daarom is het aantal cellen die zijn gevonden op de afgelegen plaatsen in het vislichaam is een meting van metastatische vermogen. Bovendien kunnen meer geëxtravaseerd cellen worden waargenomen op latere tijdstippen, hetgeen ook geldt voor de doe injectie assay.
Doc is een vergrote ader voorkomende hoofd met een uitgebreide bloedstroom 24. Rechtstreeks gericht zijn op de Doc als injectieplaats introduceert kankercellen in de bloedsomloop. In de praktijk borstkankercellen te verspreiden door het hele embryonale lichaam via debloedstroom direct na Doc injectie. De cellen arrestatie vervolgens bij de staartader en de dorsale aorta. Extravasatie, invasie, en de vorming van micrometastasen kan achtereenvolgens worden waargenomen binnen 6 dagen. Zoals eerder 16 gemeld, metastatische MDA-MB-231 cellen en premaligne borstklier M2 cellen vertonen verschillende invasieve fenotypes. MDA-MB-231 cellen ondergaan eencellige invasie van de collageenmatrix-rijke staartvin. Aldus kan de invasie potentiaal van MDA-MB-231-cellen worden gemeten door tellen van het aantal cellen die extravasatie en invasie de staartvin weefsel. In tegenstelling M2 cellen vormen clusters van verschillende grootte en ondergaan collectieve invasie van de CHT. Kwantificeren van de mogelijke invasie van M2 cellen door telling van het aantal clusters in dit protocol is moeilijk en wordt bij voorkeur uitgevoerd door een 3D-beeld met behulp van confocale microscopie en het bepalen van het volume van geclusterde tumorcellen.
De technische uitdaging in kankercel microinjectie wordt met succes gericht op de perivitelline ruimte of doe. De micro-injectie van grote aantallen embryo's is een vervelende procedure die een zeer bekwame en patiënt operator. Factoren die bijdragen tot variaties in de resultaten in individuele vissen omvatten het ontwikkelingsstadium van het embryo bij het injecteren, verschillen in het aantal geïnjecteerde cellen, en de lekkage van cellen in de dooierzak. Hoewel zelden, kan de manipulatie onbedoeld doordringen in de vasculatuur en cellen introduceren in de bloedsomloop direct, vooral in de perivitelline ruimte injectie. Om verder te verminderen variatie en om de betrouwbaarheid van de analyses te waarborgen, microscopisch onderzoek is nodig om ongekwalificeerde vissen op tijdstippen gedurende het hele proces uit te sluiten. Bovendien, verblind analyse door een professionele zonder kennis van de instelling wordt sterk aangeraden om onpartijdige kwantificering bereiken.
Kortom, de twee modellen die we hier geïntroduceerd licht werpen opvisualiseren van de processen van de cel invasie en metastase in vivo zonder invasieve procedures. Hoewel we slechts bestudeerd borstkankercellen in twee modellen met betrekking tot metastatische potentieel, kunnen zij worden geëxtrapoleerd naar andere vormen van kanker. Bovendien kon de modellen bredere toepassing bij het bepalen van de mechanismen en nieuwe moleculaire doelwitten regelen kankercellen metastase gebruikt (epi) genetische manipulatie hebben. Door de hogere doordringbaarheid van zebravis embryo's kleinmoleculige verbindingen in vergelijking met het toevoeren of injecteren van knaagdieren 25, beide ingediend modellen hebben ook voordelen in termen van de high-throughput screening van potentiële anti-invasie / metastase drugs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Studies over TGF-β familieleden worden ondersteund door het Cancer Genomics Centre Nederland. Sijia Liu en Jiang Ren worden ondersteund door de China Scholarship Council voor 4 jaar van studie aan de Universiteit van Leiden. Wij danken Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) voor de MCF10A cellijnen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
- Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).
- Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).
- Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).
- Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, Suppl 1. 62-87 (2003).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).
- He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
