Summary
Her beskriver vi xenograft sebrafisk modeller ved hjelp av to forskjellige injeksjonssteder, dvs. perivitelline plass og kanal av Cuvier, for å undersøke invasive atferd og å vurdere intravasation og bloduttredelse potensialet av menneskelige brystkreft celler, henholdsvis.
Abstract
I mange tilfeller trenger kreftpasienter dør ikke av en primær svulst, men snarere på grunn av metastaser. Selv om tallrike gnagermodeller er tilgjengelige for å studere cancer metastaser in vivo, er andre effektive, pålitelige, rimelige modeller som trengs for å få rask tilgang til potensielle virkninger av (epi) genetiske endringer eller farmakologiske forbindelser. Som sådan, illustrerer vi og forklare mulighetene for xenograftmodeller med humane brystkreftceller injiseres i sebrafisk embryo for å støtte dette målet. Under mikroskopet er fluorescerende proteiner eller kjemisk merkede humane brystcancerceller transplantert inn i transgene embryoer sebrafisk, Tg (FLI: EGFP), ved perivitelline plass eller kanal av Cuvier (DOC) 48 timer etter befruktning. Kort tid etter, er den tids romlige prosess av kreftcelle-invasjon, spredning, og metastase i den levende fiskelegemet visualisert under et fluorescerende mikroskop. Modellene bruker ulike injeksjonssteder, dvs. privitelline plass eller Doc er komplementære til hverandre, noe som reflekterer den tidlige fasen (intravasation trinn) og sent stadium (ekstravasasjon trinn) av det flertrinns metastatisk kaskade av hendelser. Videre kan peritumoral og intratumoral angiogenese observeres med innsprøyting i perivitelline plass. Hele forsøksperioden er ikke mer enn 8 dager. Disse to modellene kombinerer cellemerking, mikro-transplantasjon, og fluorescens bildeteknikker, slik at den hurtig evaluering av cancermetastase i respons til genetiske og farmakologiske manipulasjoner.
Introduction
Overt cancermetastase i klinikken omfatter en rekke kompliserte og flertrinns hendelser som er kjent som "metastatic cascade". Kaskade har blitt grundig gjennomgått og kan deles opp i påfølgende trinn: lokal invasjon, intravasation, formidling, arrest, bloduttredelser og kolonisering 1, 2. En bedre forståelse av patogenesen av kreft-metastase og utvikling av mulige behandlingsstrategier in vivo krever robuste verts modeller av kreftcelle spredning. Gnagermodeller er godt etablert, og er mye brukt for å evaluere metastaser 3, men disse metodene har lav virkningsgrad og etiske begrensninger, og er kostbare som en forkant modell for å bestemme hvorvidt en spesiell manipulasjon kan påvirke den metastatiske fenotype. Andre effektiv, pålitelig, lavkostmodeller er nødvendig for å få rask tilgang til potensielle virkninger av (epi) genetiske endringer eller Pharmacological forbindelser. På grunn av deres høye genetisk homologi til mennesker og gjennomsiktigheten av deres embryoer sebrafisk (Danio rerio) har oppstått som en viktig virveldyr modell og blir i økende grad anvendes i studiet av utviklingsprosesser, mikrobe-vert interaksjoner, menneskelige sykdommer, legemiddelscreening, etc . 4. De kreft metastasemodeller som er etablert i sebrafisk kan gi et svar på manglene i gnagermodeller 5, 6.
Selv om spontan neoplasi er knapt sett i vill sebrafisk 7, er det flere langvarige teknikker for å indusere ønsket kreft hos sebrafisk. Carcinogen-induserte mutasjoner eller signalveien aktivering kan histologisk og molekylært modell karsinogenese, etterligne human sykdom i sebrafisk 7, 8, 9. ved taking fordel av diverse forover og revers genetiske manipulasjoner av onkogener eller tumor-undertrykkere, (transgene) sebrafisk har også muliggjort potensielle studier av kreft dannelse og vedlikehold 6, 10. De induserte kreft modellene i sebrafisk dekker et bredt spekter, inkludert fordøyelsesenzymer, reproduktive, blod, nervesystemet, og epitelial 6.
Utnyttelsen av sebrafisk i kreftforskning har utvidet nylig på grunn av etableringen av humane tumorcelle xenograftmodeller i denne organisme. Dette ble først rapportert med menneske metastatisk melanom celler som ble vellykket innpodet i sebrafisk embryoer ved blastula scenen i 2005 11. Flere uavhengige laboratorier har bekreftet gjennomførbarheten av dette banebrytende arbeid ved å innføre et variert utvalg av pattedyrcancercellelinjer inn i zebrafisk på forskjellige steder og utviklingsstadier 5 </ Sup>. For eksempel, injeksjoner nær blastodisc og blastocyst av blastula trinnet; injeksjoner i plommesekken, perivitelline plass, kanal Cuvier (DOC), og bakre kardinalvene av 6-H- til 5 dager gamle embryoer; og injeksjoner i bukhulen til 30 dager gamle larver immunoundertrykket er utført 5, 12. I tillegg allogene tumor transplantasjoner ble også rapportert i sebrafisk 12, 13. En av de store fordelene ved bruk av transplantater er at det podede kreftceller kan være enkelt fluorescerende merket og skilles fra normale celler. Derfor undersøkelser av den dynamiske oppførsel av microtumor formasjonen 14, celleinvasjon og metastase 15, 16, 17, tumorindusert angiogenese 15, 18, og interaksjonene mellom kreftceller og vertsfaktorer 17 kan tydelig visualisert i den levende fiskekroppen, spesielt når transgene sebrafisk linjer er påført 5.
Inspirert av den høye potensialet av sebrafisk xenograft-modeller for å evaluere metastase, demonstrerte vi at ende trans ekstravasasjon på egenskapene til ulike brystcancercellelinjer i halefinnen område av Tg (FLI: EGFP) sebrafisk embryoer gjennom Doc injeksjoner 16. Rollen av transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) 16 og benmorfogenetisk protein (BMP) 19 signalveier i pro- / anti-brystkreftcelleinvasjon og metastase ble også undersøkt i denne modell. Videre har vi også rekapitulert den intravasation egenskaper av mange forskjellige brystcancer cellelinjer i sirkulasjon ved hjelp av xenograft-modeller sebrafisk med perivitelline plass injeksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning ved hjelp av transgene fluorescerende sebrafisk Tg (FLI: EGFP) belastning, noe som har forbedret grønt fluoriserende protein (EGFP) -merket blodkar 20, inkludert boliger og eksperimenter ble utført i henhold til internasjonale retningslinjer og ble godkjent av den lokale Institutional komiteen for Animal Welfare (Dier Ethische Commissie (DEC) i Leiden University Medical Center.
MERK: Som oppsummert i figur 1, er den protokoll grovt deles inn i fire trinn: embryoinnsamlings (figur 1A), mikro-injeksjon (figur 1B), screening (figur 1C), og analyse (figur 1D).
1. Klargjør injeksjonsnåler
- Forbered injeksjonskanyler med borsilikatglass mikrokapillærer. Sett en microcapillary inn i en mikropipette avtrekker enhet med følgende innstillinger: lufttrykk, 500; varme, 650; trekke, 100; hastighet, 200; tid,40. Hold injeksjonsnåler i en nålholder platen inntil de brukes for injeksjon.
2. Preparer Fluorescent, Genetisk merkede brystkreftceller for Injeksjon
- Kultur humane brystcancer MDA-MB-231 celler ved 37 ° C i DMEM-høyt glukosemedium inneholdende L-glutamin, 10% føtalt bovint serum og 1: 100 penicillin-streptomycin (pen-strep).
- Culture bryst epiteliale cellelinjer, MCF10A (M1) og MCF10A-Ras (M2), ved 37 ° C i DMEM / F12 medium inneholdende L-glutamin med 5% hesteserum 20 ng / ml epidermal vekstfaktor, 10 mg / mL insulin, 100 ng / mL kolera enterotoxin, 0,5 mg / ml hydrokortison, og 1: 100 pen-strep.
- Produsere mCherry lentivirus ved ko-transfeksjon av PLV-mCherry, pCMV-VSVG 21, pMDLg-RRE (gag / pol) 22, og pRSV-REV 22 plasmidet i HEK293T celler. Feie cellesupernatanter 48 timer etter transfeksjon og oppbevar ved -80 ° C.
- Jegnfect MDA-MB-231, M1, M2 og cellene ved 30% konfluens i 24 timer med lentivirale supernatanter fortynnet 1: 1 med normal kulturmedium i nærvær av 5 ng / ml polybren.
- Velge enkeltcellekloner ved fortynning av celler i en 96-brønns plate, som tillater utveksten av isolerte cellekloner, inntil det oppnås stabile mCherry-uttrykkende cellelinjer.
- Kultur en T75-kolbe av celler for injeksjon. Høste cellene ved 80% konfluens med en 0,5% trypsin-EDTA-behandling. Vask cellene med 1 x PBS 2-3 ganger.
- Resuspendere cellene i 200 ul PBS. Oppbevares ved dem 4 ° C i mindre enn 5 timer før injeksjon.
3. Fremstill Sebrafisk embryoer for Injection
- Sett opp sebrafisk som hekker og samle embryoer, som er vist i en tidligere Jove artikkel av Rosen et al. 23.
- Velg embryoene som er 0-4 HPF ved å fjerne ubefruktede og unormale embryoer. Hold embryoene i en petri dish full av egg vann (60 ug / ml sjøsalter; ~ 60 embryoer / skål) og inkuber ved 28 ° C.
- Dechorionate embryoene med fin pinsett på 48 HPF.
- Bedøve embryoene ved å overføre dem til 40 pg / ml trikain (3-aminobenzosyre) inneholdende egg vann omtrent 2 min før injeksjon, men ikke lenger enn 2 timer før injeksjon.
MERK: Tricaine stamløsning (4 mg / ml, 100 x) ble fremstilt som 400 mg av trikain pulver i 97,9 ml dobbeltdestillert vann og 2,1 ml 1 M Tris-base (pH 9), med pH justert til 7,4. Oppbevares i -20 ° C fryser.
4. Innfør humane brystcancerceller inn i Perivitelline Space
- Belastning 15 ul av cellesuspensjonen til en injeksjonsnål. Montere nålen på mikromanipluatoren og bryte av nålespissen med fine pinsetter for å oppnå en spiss åpningsdiameter på 5-10 um.
- Bruk en pneumatisk picopump og en manipulator å utføre mikroinjeksjon. just picopump å injisere 400 celler hver gang. Før injeksjon telle celleantallene manuelt ved å injisere cellene på toppen av en petriskål inneholdende 1% agarose.
- Linje opp bedøvet embryoer (2-3 dager etter befruktning (dpf)) på en flat, 1% agarose injisere platen, rundt 10 embryoer hver gang.
- Orientere injeksjonsplaten for hånd i løpet av injeksjoner for å plassere embryoene i den foretrukne stilling for innsetting av nålen (dvs. diagonalt).
- Peke nålespissen på injeksjonsstedet og forsiktig inn nålespissen inn i perivitelline rommet mellom plommesekken og den periderm av sebrafisk embryo (figur 2A).
- Injiser ca 400 mCherry-merkede tumorceller. Kontroller at plommesekken er ikke sprukket å unngå implantering i plommesekken.
5. Injiser humane brystcancerceller inn i Doc
- Forbered injeksjonsnålen og sebrafisk embryoer, som beskrevet i n-protokollen trinn 1, 2 og 3.
- Bruker en 45 ° vinkel nål, slik at Doc kan angripes fra den dorsale side av embryoet.
- Sett nålen inn i startpunktet for den Doc (figur 3A), bare for å dorsal hvor kanalen begynner å utvide over plommesekken, og injisere ca. 400 celler; injeksjon er riktig hvis volumet inne i kanalen utvider seg direkte etter pulsen og plommesekken.
MERK: Flere påfølgende injeksjoner kan utføres uten å trekke ut nålen. - Overfør de injiserte sebrafisk embryoene som egg vann.
eksisterer som betydelig variasjon mellom individuelle sebrafisk embryoer, og som død av embryoer etter injeksjon kan forekomme, må et relativt stort antall av sebrafisk embryoer (rundt 100) injiseres med kreftceller: NB. - Opprettsebrafisk embryoer ved 33 ° C for å få plass til den optimale temperatur for fisk og pattedyrceller.
- Screen hver fisk under et stereomikroskop fluorescens ved 2 timer etter injeksjon (hpi) for den perivitelline plass injeksjon (figur 2) eller ved 2-24 hpi for Doc injeksjon (figur 2) for å sikre at alle embryoene blir injisert med en tilsvarende antall av tumorceller. Fjern embryoene med injeksjonsfeil, slik som sprekker (figur 2B) eller injeksjoner (figur 3B) i plommesekken, og plukke ut embryoer med injiserte celler under (figurene 2C og 3B) eller høyere (figur 2D og 3B) terskel. Hold bare embryoene med ca 400 celler i kultur.
- Utelukke muligheten for at cellene er innført direkte i omløp under injeksjonsprosessen ved å fjerne fostrene med celler som allerede er i omløp. Også fjerne embryo med en cellemasse nær Doc (figur 2D
7. Bilde og analysere den metastatisk prosess
- Samle flere bedøvede embryoer med et bred-Pasteur-pipette tupp og overføre dem til glass bunnen av en polystyrenskål.
- Fjern overflødig vann og holde en begrenset mengde egg vann. Manipulere embryo på plass med et hår løkke verktøy og plassere et deksel på toppen av glasset.
- Bruke en invertert konfokalt mikroskop i kombinasjon med vann-nedsenking eller fjern tørre mål. Plasser embryo, slik at området av interesse er så nær målsetningen som mulig.
- Utføre avbildning umiddelbart etter anestesi for å redusere risikoen for å dø på grunn av fordampningen av flytende.
- Capture signaler fra EGFP-merkede blodårer og mCherry-merkede tumorceller på den samme posisjon på embryoene som co-registrere injiserte celler med blodårer ved å slå sammen de to avbildningskanaler.
- For hver sebrafisk embryo, samle to forskjellige sett med bilderfra hodeområdet og haleområdet.
- Kvantifisere antallet spres celler.
- For perivitelline plass injeksjoner, telle antallet celler i hver fisk som har spres fra cellemassen mot den embryoniske fiskelegemet i den fremre og bakre områder 4, 15; områdene er utenfor grensene for den hjertehulen forfra, på toppen av svømmeblæren dorsalt, og utenfor det urogenitale åpning kaudalt.
- For Doc injeksjon, telle antall enkeltceller som har invadert kollagenfibrene av halefinnen fra sirkulasjonen (MDA-MB-231) eller antall grupper som er dannet av celler som kollektivt (M2) i den caudale hematopoietisk vev (CHT) av hver sebrafisk 19.
- Studere invasjon og metastasering i mer detalj ved hjelp konfokalmikroskopi (anbefales).
- Bruk lav forstørrelse (4x objektiv) for å avbilde helelegeme og for å få en oversikt over tumorcellen formidling mønster.
MERK: Høyere forstørrelse (20X og 40X mål) er egnet for å studere intra- og peri-tumoral angiogenese og den nøyaktige lokalisering av disseminerte celler i embryo kroppen. - Bruke en 488 nm laser for å skanne den sebrafisk embryo vaskulaturen og en 543 nm laser for å skanne implanterte tumorceller merket med rød fluorescens. Få tak i en høykvalitets bilde ved å skanne hver embryo i åtte til ti trinn. Skann og gjennomsnittlig hvert trinn seks ganger.
- Bruk lav forstørrelse (4x objektiv) for å avbilde helelegeme og for å få en oversikt over tumorcellen formidling mønster.
- Plasser forsiktig embryoet tilbake i egg vann hvis det er nødvendig for videre eksperimenter.
8. utføre statistisk analyse ved hjelp av én-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av post hoc-analyse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den embryoniske xenograft modell sebrafisk med en perivitelline plass injeksjon, blir den hematogenous formidling av merkede kreftceller i fiskekroppen betraktet som aktiv migrasjon. Denne prosessen kan påvises og kvantifiseres under et fluorescerende mikroskop, som beskrevet i fremgangsmåtene ovenfor. For å illustrere dette xenograft modell, fulgte formidling prosessen med forskjellige brystcancer cellelinjer med kjent (eller uten) invasjon / metastasepotensiale i henhold til in vitro og in vivo musestudier, inkludert benign normalt bryst epiteliale M1 celler, HRAS-transform premaligne M2-celler, og høyt metastatiske MDA-MB-231-celler, en dag etter injeksjon (ppt) framover. En høy oppløsning konfokal mikroskopi bilde viser at MDA-MB-231 celler (røde) oppviser en aggressiv fenotype, med uregelmessige kanter i perivitelline plass. Pseudopodia lignende fremspring og invasive fronter var ofte til stede (Figur 4A, til venstre). Noen få celler spres inn i blodsirkulasjonen så tidlig som 1 oppløsning (figur 4A, til høyre). Ved 2 ppt ble klar formidling observert i de distale deler av fisken (figur 4A, til høyre). Antallet disseminerte celler økes ytterligere ved 3 dpi (figur 4A og 4D). I motsetning til dette, når M2-celler ble utfordret i sebrafisk, oppviste de beskjedne spredning i fiskekroppen etter 2 dpi (figur 4B). De viste også økt formidling etter tiden gikk (figur 4F). Som vist på figur 4C og 4G, M1 celler sjelden spres inn i sebrafisk sirkulasjon, og til og med aktiv lokal migrering innenfor perivitelline plass var sjelden i løpet av observasjonsperioden. M1 cellemasse ble nesten arrestert på den opprinnelige injeksjonsstedet. Hvis definerer positiv spredning eller metastase som> 5 cellene i fiskelegemetss = "ekstern referanse"> 4, MDA-MB-231 og M2 cellemetastase ble iakttatt i 92% og 57% av fisken, henholdsvis på 3 dpi (figur 4G). I motsetning til dette ble ingen positiv formidling observert med M1-celler. Derfor denne sebrafisk modell av human kreftcelle progresjon nøyaktig gjenspeiler den relative nivået av metastatisk potensiale av de forskjellige celler i mus. Neovaskularisering (grønn) som spiret fra subintestinal plexus av den embryoniske sebrafisk og gjennomtrengt celle MDA-MB-231 eller M2 massen var også til stede etter perivitelline plass injeksjon av tumorceller, fulgt av 3 dager med inkubasjon (figur 4A og 4B, venstre ). I samsvar med den uførhet i formidling, ble bare en liten neovaskularisering detektert ved M1 celle implantasjon (figur 4C).
I den embryoniske xenograft modell sebrafisk med mCherry-merkede MDA-MB-231 celler og Doc injeksjon, labeLED kreftceller i halefinnen av sebrafisk anses representativt for aktiv ekstravasasjon. De mCherry-merkede MDA-MB-231 celler ble injisert ved to dpf. Ved 3 ppt, cellene begynte å migrere ut av skipene til halefinnen, som er anriket med kollagen. Enkelt MDA-MB-231 celler overført en etter en, uavhengig av hverandre fra fartøyene, til den fjerne halefinnen (figur 5A). Ved 6 ppt, kan invasjonen bli kvantifisert ved telling av antall celler som vandret inn i halefinnen vev. I mCherry-merkede M2 celle Doc injeksjon modell, ble injeksjonen også utført ved 2 dpf. Men en gruppert fenotype ble observert i løpet av den aktive bloduttredelse prosessen. Ved 1 ppt, M2 cellene begynte å migrere ut fra fartøyene inn i CHT av sebrafisk. Ved to ppt, de migrerte M2 cellene begynte å danne en klynge mellom fartøyene i CHT (figur 5B). Kvantifisering av M2 invasiv celle områdenummer i CHT regionen kan bli utført ved6 dpi.
Figur 1: Hoved skritt for å undersøke det invasiv oppførsel av brystkreft celler i embryonale sebrafisk. (A) Etter å ha krysset foreldresebrafisk over natten, Tg (fli1: EGFP) sebrafisk embryoer ble samlet opp følgende morgen og ble opprettholdt ved 28 ° C. (B) Embryoene ble dechorionated med fine pinsetter i henhold til et stereomikroskop 48 timer etter befruktning (HPF). De merkede brystkreftceller ble oppsamlet og re-suspenderes i en liten mengde PBS. Etter at brønn-preparat, ble det suspenderte celler lastet inn i en nål. Omtrent 400 celler ble injisert inn i kanalen fra Cuvier (Doc) av perivitelline plass under et stereomikroskop. De injiserte embryoer ble holdt ved 33 ° C. (C) 2 timer etter injeksjon (HPI), ble embryoene underkastet ca.reful screening under et fluorescens stereomikroskop. Embryoene ble holdt ved 33 ° C i 3 eller 6 dager. Under intervallet, ble embryoene kastet den utformet behandling. (D) Cancer celle spredning av perivitelline plass injeksjon eller invasjon av Doc injeksjon ble påvist, og telles, og avbildes ved hjelp av konfokal mikroskopi 3 eller 6 dager etter injeksjon (ppt). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Perivitelline plass injeksjonsstedet og vanlige feil. (A) ca. 400 mCherry-merkede celler (MDA-MB-231) ble injisert i perivitelline plass. Den lysfelt (øverste), grønn vaskulaturen (midtre øvre), og røde cellemasse (midten nedre) av injekteted sebrafisk embryo ble tatt til fange av konfokal mikroskop. Den flettede bildet (nederste) av de tre kanalene viser stereo plassering av cellemassen i embryo. (B) at cellene ikke være rettet mot perivitelline plass på riktig måte. Plommesekken ble sprengt. (C) Injiserte celler under terskelen (mye mindre enn 400). (D) Injiserte celler over terskel (mer enn 400). Cellemassen var for nær kanalen av Cuvier, som har en bred blodstrømmen. Skala bar = 50 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Oversikt over kanalen av Cuvier (DOC) injeksjon. (A) Skjematisk av Doc injeksjon ved 2 dager etter befruktning (dpf) med brystcancerceller i sebrafisk embryoer. Pilen angir Doc. (B) Eksempler på positive injeksjoner, med rundt 400 brystkreftceller; negative injeksjoner, inkludert eggeplomme misinjection; og et uriktig antall celler injisert ved 4 hpi. Piler og sirkler angir injiserte celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Sammenligning av spredning evne blant forskjellige brystcellelinjer. Omtrent 400 mCherry-merket MDA-MB-231, MCF10Aras (M2), eller MCF10A (M1) celler ble injisert i perivitelline plass av sebrafisk embryoer 48 HPF. De injiserte embryoer ble fulgt i 3 dager. (A, B, og C) Høy-resofortynningssonen mikrografer som viser representative migrasjon og spredning prosess av MDA-MB-231 (A), M2 (B), og M1 (C) celler i enkelte embryoniske legemene 1, 2 og 3 dager etter injeksjonen (ppt). Venstre, cellemigrasjon i perivitelline plass (rød) og peritumoral og intratumoral blodkar (grønn). Gule signalene indikerer overlappingen av mikrokar og celler. Middle, hele bildet av embryo. Høyre, visualisering av spres celler i bakre av embryoet. Gule pilspisser indikerer enkelt spres celler. Skala bar = 50 um. (D, E og F) Kvantifisering av antall disseminerte celler i hver embryoniske legeme ved 1, 2, og 3 dpi. Resultater er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Resultater fra én-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av post-hoc-analyse er vist. P <0,05 ble akseptert som signifikant (* 0,01 <P <0,05, ** 0.001 <P <0,01; *** p <0,001. (G) Sammenligning av forekomst av intravasation for MDA-MB-231, M2 og M1 cellene i embryonale legemer ved 1, 2, og 3 dpi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: ulike virkemåter for MDA-MB-231 og M2 cellemetastasering i zebrafisk med kanal Cuvier injeksjon. (A) Representative konfokale bilder av sebrafisk fulgt ved 3, 4, og 5 dpi for å vise enkeltcellevandringsadferd av MDA-MB-231 celler i sebrafisk. Pilene viser invasive MDA-MB-231 celler som vandret ut av skipene inn i halefinner. Skala bar = 200 pm i venstre kolonne, 50 mikrometer i den høyre kolonne. (B) Representativekonfokale bilder av sebrafisk fulgt ved 1, 2, og 3 dpi for å vise celleklase vandringsadferd av M2-celler i sebrafisk. Piler indikerer invasive M2-celler som vandret ut av fartøyene til den caudale hematopoietisk vev (CHT) og dannet en klynge mellom fartøyene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi to metoder for å undersøke invasiv oppførsel av brystkreft celler i Tg (fli1: EGFP) sebrafisk embryo, med perivitelline plass og Doc injeksjoner. Ved å injisere kreftceller merket med kjemisk fargestoff eller fluorescerende protein i transgene embryoer sebrafisk, kan de dynamiske og romlige karakteristika for invasjon og metastase være klart spores i sanntid på enkelt-celle eller klynge nivået i tanken under et fluorescens mikroskop. I de fleste tilfeller er den raske utviklingen av metastaser i sebrafisk sikrer at analysen kan utføres i løpet av en uke etter transplantasjon. Videre kan kraftige statistikk oppnås med store årskull av fisk.
Tidlige og sene hendelser av metastatisk kaskade kunne simuleres og rekapitulert ved injisering av kreftceller i perivitelline plass eller Doc, henholdsvis. Den perivitelline plass er det avgrensede rom mellom periderm av fisken og plommesekken, som allows man for å overvåke spredning av enkelttumorceller fra primærstedene i den levende kropp. Etter implantering, kreftcellene gjennomgår lokal migrering og invasjon i perivitelline plass (ansett primærsetet) og deretter de intravasate inn i blodkarene og spre sammen med sirkulasjon. Ved hodet og halefinnen (betraktet fjerntmålse), kreftceller akkumulerer i smale kapillærsjikt og ekstravasere. Derfor er antallet av celler som er funnet ved den fjerne steder i fiskekroppen er en måling av metastatisk evne. I tillegg kan flere ekstravaserte celler observeres ved senere tidspunkt, noe som også gjelder for den Doc injeksjon analysen.
Den Doc er et forstørret vanlig kardinalvene med en omfattende blodstrøm 24. Direkte rettet mot det Doc som injeksjonssted innfører cancerceller inn i sirkulasjonssystemet. I praksis brystkreftceller spres over hele embryonale kroppen viablodet umiddelbart etter Doc injeksjon. Cellene deretter arrestere på halevenen og dorsal aorta. Ekstravasasjon, invasjon, og micrometastasis dannelse kan iakttas suksessivt i løpet av 6 dager. Som rapportert tidligere 16, metastatisk MDA-MB-231 celler og premaligne mammary M2-celler som utviser forskjellige invasive fenotyper. MDA-MB-231 celler gjennomgår enkelt-celle invasjon av kollagenmatriksen rike halefinnen. Således kan invasjonen potensialet i MDA-MB-231 celler måles ved å telle antallet celler som har ekstravaserte og invadert halefinnen vev. I motsetning til M2-cellene danner klynger av forskjellige størrelser og gjennomgår kollektiv invasjon av CHT. Kvantifisering av invasjonen potensialet av M2-celler ved å telle antallet av klynger i denne protokollen er vanskelig og utføres fortrinnsvis ved å lage et 3D-bilde ved hjelp av konfokal mikroskopi og bestemme volumet av grupperte tumorceller.
Den tekniske utfordring i cancercelledød mikroinjeksjon er vellykket rettet mot perivitelline plass eller Doc. Den mikroinjeksjon av et stort antall embryoer er en omstendelig prosedyre som krever en meget dyktig og pasient operatør. Faktorer som bidrar til variasjoner i resultatene i enkeltfisk omfatter utviklingsstadiet av embryoet ved injisering, forskjeller i antallet av celler injisert, og den lekkasje av celler inn i plommesekken. Selv om det sjeldent, kan manipulering utilsiktet trenge inn i vaskulaturen og innføre cellene i sirkulasjonssystemet direkte, særlig i den perivitelline plass injeksjon. For ytterligere å redusere variasjon og for å sikre påliteligheten av analysene, er mikroskopisk undersøkelse nødvendig for å utelukke ukvalifisert fisk på tidspunkter gjennom hele prosessen. I tillegg blindet analyse av en profesjonell uten kunnskap om innstillingen er sterkt anbefalt for å oppnå objektiv kvantifisering.
I sammendraget, de to modellene vi introdusert her belysevisualisere prosesser av celleinvasjon og metastaser in vivo uten invasive prosedyrer. Selv om vi bare studert brystkreftceller i to modeller angående metastatisk potensial, kunne de ekstrapoleres til andre typer kreft. Videre kan modellene har en bredere anvendelse ved bestemmelse av mekanismene og de nye molekylære mål som kontrollerer cancercellemetastase ved hjelp av (epi) genetisk manipulering. På grunn av den høyere penetrerbarhet sebrafisk embryoer ved lavmolekylære forbindelser i forhold til foring eller injeksjon av gnagere 25, de to presenteres modellene har også fordeler med hensyn på den high-throughput screening av potensielle nye anti-invasjons / metastase medikamenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Studier på TGF-β familiemedlemmer er støttet av Kreft Genomics Centre Nederland. Sijia Liu og Jiang Ren støttes av China Scholarship Council for 4 år med studier ved Universitetet i Leiden. Vi takker Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, Michigan, USA) for MCF10A cellelinjer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
- Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).
- Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).
- Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).
- Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, Suppl 1. 62-87 (2003).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).
- He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
