Summary
Здесь мы опишем ксенотрансплантаты данио модели , используя два различных места инъекций, то есть, перивителлиновое пространство и протоки Кювья, исследовать инвазивное поведение и оценить intravasation и экстравазационный потенциал клеток рака молочной железы человека, соответственно.
Abstract
Во многих случаях, больной раком не умирают от первичной опухоли, а скорее из-за метастаз. Несмотря на многочисленные модели на грызунах доступны для изучения метастазирования рака в естественных условиях, другие эффективные, надежные, недорогие модели необходимы для быстрого доступа потенциальных последствий (эпите) генетических изменения или фармакологических соединений. Таким образом, мы проиллюстрируем и объяснить целесообразность моделей ксенотрансплантата с использованием клеток рака молочной железы человека инжектированной в данио эмбрионов для поддержки этой цели. Под микроскопом, флуоресцентные белки или химически меченые клетки рака молочной железы человека пересаживают в трансгенных эмбрионов данио, Тд (FLI: EGFP), в пространстве или перивителлинового канале Cuvier (Doc) 48 ч после оплодотворения. Вскоре после этого, височно-пространственного процесс инвазии раковых клеток, распространения и метастаза в живом организме рыбы визуализируется под флуоресцентным микроскопом. Модели , использующие различные инъекции сайты, то есть, вivitelline пространство или док дополняют друг друга, что отражает раннюю стадию (intravasation шаг) и поздней стадии (этап экстравазации) в многостадийной метастатического каскада событий. Кроме того, перитуморальный и внутриопухолевый ангиогенез может наблюдаться при инъекции в перивителлиновом пространство. не весь экспериментальный период составляет не более 8 дней. Эти две модели сочетают маркировки клеток, микро-трансплантации, а также методы флуоресцентной визуализации, что позволяет быструю оценку метастазов рака в ответ на генетических и фармакологических манипуляций.
Introduction
Явная метастазы рака в клинике включает в себя ряд сложных и многоступенчатых событий, известных как «метастатического каскада». Каскада была широко рассмотрена и может быть разрезана на последовательные этапы: локальную инвазию, intravasation, распространение, арест, транссудацию и колонизацию 1, 2. Лучшее понимание патогенеза метастазирования рака и развития потенциальных стратегий лечения в естественных условиях необходимы надежные модели , принимающие распространения раковых клеток. Модели грызунов хорошо известны и широко используются для оценки метастаза 3, но эти подходы имеют низкую эффективность и этические ограничения и являются дорогостоящими в качестве модели первого плана , чтобы определить , может ли та или иная манипуляция влияет на метастатический фенотип. Другие модели эффективной, надежной, недорогой, необходимы для быстрого доступа потенциальных последствий (эпи) генетических изменений или pharmacologские соединения. Из - за их высокой генетической гомологии для человека и прозрачности их эмбрионов данио (Danio rerio) возникли в качестве важной модели позвоночных , и все чаще применяются для изучения процессов развития, микроб-хозяин взаимодействий, заболеваний человека, скрининга лекарственных средств и т.д. . 4. Модели метастазирования рака , установленные в данио могут дать ответ на недостатки моделей на грызунах 5, 6.
Хотя спонтанная неоплазия едва видел в дикой данио 7, есть несколько давнишних методы , чтобы вызвать требуемый рак в данио. Вызванного канцероген генных мутации или сигнализация активация пути могут гистологический и молекулярно модель канцерогенез, имитируя заболевание человека в данио 7, 8, 9. По TakING преимущества разнообразно прямые и обратное генетические манипуляции онкогенов или опухолевых супрессоров, (трансгенный) данио также позволил потенциальным исследования формирования и поддержания 6, 10 рака. Индуцированные модели рака в данио охватывают широкий спектр, в том числе пищеварительной, репродуктивной, крови, нервной системы, и эпителиальной 6.
Использование данио в исследовании рака расширилась в последнее время в связи с созданием моделей опухолевых клеток ксенотрансплантата человека в этом организме. Это было впервые сообщено с метастатическими клетками меланомы человека , которые были успешно прижились в данио эмбрионов на стадии бластулы в 2005 году 11. Несколько независимых лаборатории подтверждена целесообразность этой новаторской работы путем введения широкого спектра млекопитающих раковые клеточных линий в данио на различных участках и стадиях развития 5 </ SUP>. Так, например, инъекции вблизи бластодиска и бластоцисты стадии бластулы; инъекции в желточный мешок, перивителлиновое пространства, протоков Кювье (Doc), и задней кардинальной вены 6-H- до 5-дневных эмбрионов; и инъекция в брюшную полость 30-дневных личинок иммуносупрессии была проведена 5, 12. Кроме того, аллогенных трансплантаций опухоли также были представлены в данио 12, 13. Одно из самых больших преимуществ использования ксенотрансплантатов является то, что привиты раковые клетки могут быть легко флуоресцентно меченных и отличаются от нормальных клеток. Следовательно, расследование динамических поведения формирования microtumor 14, инвазию и метастазирование клеток 15, 16, 17, 15 ангиогенез , индуцированный опухолью, 18, а также взаимодействие между раковыми клетками и хозяином факторами 17 могут быть четко визуализируются в живом организме рыбы, особенно , когда трансгенные линии данио применяется 5.
Вдохновленный высоким потенциалом данио моделей ксенотрансплантатов оценить метастазирование, мы продемонстрировали transvascular Экстравазационным свойства различных клеточных линий рака молочной железы в области tailfin от Tg (FLI: EGFP) эмбрионов данио рерио через Doc инъекций 16. Роль трансформирующий фактор роста-бета (TGF-бета) 16 и костного морфогенетического белка (BMP) 19 сигнальных путей в про- / анти-молочной инвазии и метастазирование раковых клеток также были исследованы в этой модели. Кроме того, мы также перечислил основные направления intravasation способность различных клеток рака молочной железы линий в обращении с использованием ксенотрансплантатов данио модели с перивителлиновом космических инъекций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования с использованием трансгенных данио флуоресцентного Tg (FLI: EGFP) штамм, который обладает повышенными зеленым флуоресцентным белком (EGFP) меченных сосудистыми 20, в то числе жилья и экспериментов, были проведено в соответствии с международными руководящими принципами и были одобрены местным комитет по институциональному для защиты животных (Дьер Ethische Commissie (DEC) в Leiden University Medical Center.
Примечание: Как показано на рисунке 1, протокол грубо разделить на четыре стадии: сбор эмбрионов (рис 1А), микроинъекции (рис 1б), скрининг (рис 1C), а также анализ (рис 1D).
1. Подготовьте Инъекционные иглы
- Подготовка иглы для инъекций с боросиликатного стекла микрокапиллярах. Поместите микрокапилл в микропипетках съемник устройство со следующими параметрами: давление воздуха, 500; тепла, 650; тянуть, 100; скорость, 200; время,40. Держите иглы для инъекций в держателе иглы пластине, пока они не используются для инъекций.
2. Подготовьте Флуоресцентные, Генетически меченые клетки рака молочной железы для инъекций
- рак молочной железы человека Культуры клеток MDA-MB-231 при 37 ° С в среде DMEM-среде высокой глюкозы, содержащие L-глютамина, 10% фетальной телячьей сыворотки и 1: 100 пенициллин-стрептомицина (ручка-стрептококковые).
- Культура линии груди эпителиальные клетки, MCF10A (М1) и MCF10A-Ras (М2), при 37 ° С в среде DMEM / F12 среде, содержащей L-глютамин с 5% лошадиной сыворотки, 20 нг / мл эпидермального фактора роста, 10 мг / мл инсулин, 100 нг / мл холерного энтеротоксина, 0,5 мг / мл гидрокортизона и 1: 100 ручка-стрептококк.
- Производит mCherry лентивирус путем совместной трансфекции PLV-mCherry, PCMV-VSVG 21, pMDLg-RRE (ГАГИ / POL) 22 и ВКППЫ-REV 22 плазмиды в клетки HEK293T. Супернатанты клеток урожая 48 ч после трансфекции и хранят при -80 ° С.
- яnfect клетки MDA-MB-231, M1 и M2 на 30% слияния в течение 24 ч с лентивирусов супернатантов разводили 1: 1 с нормальной культуральной среде в присутствии 5 нг / мл полибрена.
- Выберите одноклеточные клоны путем разбавления не клеток в 96-луночный планшет, который позволяет разрастание изолированных клеточных клонов, до получения стабильных mCherry-экспрессирующих клеточных линий.
- Культура один T75 колбу клеток для инъекций. Урожай клеток при 80% слияния с 0,5% в лечении трипсина-ЭДТА. Вымойте клетки с 1x PBS в 2-3 раза.
- Повторное приостановить клетки в 200 мкл PBS. Хранить при которых 4 ° С в течение менее чем 5 ч до инъекции.
3. Подготовка эмбрионов данио рерио для инъекций
- Настройка пары разведения данио и собирать эмбрионов, как показано в предыдущей статье JOVE Розен и соавт. 23.
- Выберите эмбрионы, которые в 0-4 HPF, удалив неоплодотворенные и аномальных эмбрионов. Держите эмбрионов в течение дис чашкахч полна яичного воды (60 мкг морской соли / мл; ~ 60 эмбрионов / блюдо) и инкубируют при 28 ° C.
- Dechorionate эмбрионов с мелким пинцетом на 48 часов после оплодотворения.
- Обезболить эмбрионов путем переноса их до 40 мкг / мл Tricaine (3-аминобензойной кислоты), содержащей воду, яичный приблизительно 2 мин до инъекции, но не больше, чем 2 ч до инъекции.
Примечание: Tricaine исходного раствора (4 мг / мл, 100x) получают в виде 400 мг Tricaine порошка в 97,9 мл дважды дистиллированной воды и 2,1 мл 1 М Трис-основание (рН 9), с рН, доведенным до 7,4. Хранить в -20 ° C морозильнике.
4. Клетки рака молочной железы человека Вводят в перивителлиновое пространства
- Нагрузка 15 мкл суспензии клеток в инъекционной иглы. Установите иглу на микроманипулятор и разорвать кончик иглы с тонким пинцетом, чтобы получить диаметр отверстия наконечника 5-10 мкм.
- Используйте пневматический picopump и манипулятор для выполнения микроинъекции. Adjuй picopump впрыснуть 400 клеток каждый раз. До инъекции, подсчета числа клеток вручную путем инъекции клеток на верхней чашке Петри, содержащей 1% агарозы.
- Линия до наркозом эмбрионов (2-3 дня после оплодотворения (DPF)) на плоской 1% агарозном инъекционных пластины, около 10 эмбрионов каждый раз.
- Сориентируйте инъекции пластины вручную во время инъекции поместить эмбрионов в предпочтительном положении дл вставки иглы (то есть, по диагонали).
- Точка кончика иглы в месте инъекции и осторожно вставьте кончик иглы в перивителлиновом пространство между желтком и перидермами из данио эмбриона (рис 2А).
- Вводят приблизительно 400 mCherry-меченых опухолевых клеток. Убедитесь, что желточный мешок не разорван, чтобы избежать имплантаций в желток.
5. Вводят клетки рака молочной железы человека в Doc
- Подготовьте иглу для инъекций и данио эмбрионов, как описано I п протокола шаги 1, 2 и 3.
- С помощью иглы под углом 45 °, так что Док можно подойти с дорсальной стороны эмбриона.
- Вставьте иглу в начальную точку (Doc фиг.3А), просто дорсальной, где канал начинает расширение над желточного мешка, и вводят приблизительно 400 клеток; инъекция является правильной, если объем внутри канала расширяется непосредственно после импульса и желточного мешка.
Примечание: Несколько последовательных инъекций могут быть выполнены без извлечения иглы. - Передача инжектированных эмбрионов данио в яйцо воды.
Примечание: Поскольку существует значительная разница между отдельными эмбрионами данио рерио, и как смерть эмбрионов после инъекции может произойти, относительно большое количество эмбрионов данио (около 100), следует вводить с раковыми клетками. - Поддерживать эмбрионы данио при 33 ° C, чтобы удовлетворять требования оптимальной температуры для рыб и клеток млекопитающих.
- Экран каждой рыбы под флуоресцентным стереомикроскопом при 2 ч после инъекции (HPI) для перивителлинового пространства инъекции (рисунок 2) или на 2-24 HPI для инъекций Doc (рисунок 2) , чтобы гарантировать , что все эмбрионы вводят с такое же количество опухолевых клеток. Удалить эмбрионы с ошибками инъекций, такие как разрывы (фигура 2В) или инъекции (рис 3b) желточный мешка, и выбрать эмбрионы с инжектированными клетками ниже (Фигуры 2СА и 3B) или выше (фиг 2D и 3B) порогом. Хранить только эмбрионы с приблизительно 400 клеток в культуре.
- Исключите возможность того, что клетки вводятся непосредственно в обращение во время процесса впрыска путем удаления эмбрионов с клетками уже находящимся в обращении. Кроме того , удалить любой эмбрион с клеточной массой , близкой к Doc (рис 2D
7. Изображение и анализ метастатического процесса
- Собрать несколько наркоза эмбрионов с широким наконечником пипеткой Пастера и передавать их к стеклянному дну из полистирола блюда.
- Удалите излишки воды и держать ограниченное количество яичной воды. Манипулирование эмбриона в положение с помощью инструмента петли волос и поместите крышку на верхней части стекла.
- Используйте перевернутую конфокальной микроскопии в сочетании с водной или погружением на большие расстояния сухих целей. Расположите эмбрион таким образом, что область интереса находится как можно ближе к цели, как это возможно.
- Выполните визуализацию сразу после анестезии, чтобы уменьшить риск смерти из-за испарения жидкости.
- Захват сигналы от EGFP-меченого сосудистую и mCherry-меченых опухолевых клеток в том же самом положении на эмбрионах, чтобы зарегистрировать совместно вводили клетки с кровеносными сосудами путем объединения двух каналов формирования изображения.
- Для каждого данио эмбриона, собирать два различных набора изображенийиз области головы и хвоста области.
- Количественно количество распространяемых клеток.
- Для перивителлиновых космических инъекций, подсчитывает количество клеток в каждых рыбах , которые распространены от клеточной массы к эмбриональному телу рыбы в регионах головы и хвоста 4, 15; регионы находятся за пределы полости сердца фронтальны, в верхней части дорсального мочевого пузыря плавать, а за мочеполовые открытия каудально.
- Для инъекции Doc, подсчитать число отдельных клеток, которые вторглись коллагеновые волокна tailfin из обращения (MDA-MB-231) или количества кластеров, образованных клетками коллективно (М2) в хвостовом гемопоэтической ткани (CHT) из каждый данио рерио 19.
- Исследование инвазии и метастазирования более подробно с использованием конфокальной микроскопии (настоятельно рекомендуется).
- Использование низкой кратности (объективный 4X) для изображения в целомтела и получить общее представление о шаблоне распространения опухолевых клеток.
Примечание: более высокое увеличение (20й и 40й) подходит для изучения внутри- и пери-опухолевого ангиогенеза и точной локализации диссеминированный клеток в организме эмбриона. - Использование 488 нм лазер для сканирования данио эмбриона и сосудистую 543 нм лазер для сканирования имплантированных опухолевых клеток, меченных красной флуоресценции. Получить высококачественное изображение при сканировании каждого эмбриона в восемь-десять шагов. Сканирование и в среднем каждый шаг в шесть раз.
- Использование низкой кратности (объективный 4X) для изображения в целомтела и получить общее представление о шаблоне распространения опухолевых клеток.
- Аккуратно поместите эмбрионы обратно в яичную воду, если она необходима для дальнейших экспериментов.
8. Провести статистический анализ с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим анализом постфактум
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В эмбриональном ксенотрансплантате данио модели с перивителлиновым пространством инъекцией гематогенной диссеминация меченых раковых клеток в организме рыбы считаются активной миграцией. Этот процесс может быть обнаружен и количественно под флуоресцентным микроскопом, как описано в способах выше. Чтобы проиллюстрировать эту ксенотрансплантату модель, мы следовали процессу распространения различных клеточных линий рака молочной железы с известным (или без него ) инвазии / метастазирования потенциала в соответствии с ин витро и исследований на мышь естественных условий, включая доброкачественные нормальные эпителиальные груди M1 клетки, HRAS-трансформированные предраков клетки м2, и высоко метастатические клетки MDA-MB-231, после инъекции 1 день (точек на дюйм) и далее. С высокой разрешающей способностью конфокальной микроскопии изображений показал, что MDA-MB-231 клетки (красные) демонстрируют агрессивный фенотип, с неправильными границами в перивителлиновое пространстве. Псевдоподии подобные выступы и инвазивные фронты также часто присутствует (Рисунок 4A, слева). Несколько клеток распространяются в кровоток уже в 1 дюйм (фиг.4О, справа). В 2 точек на дюйм, ясно , распространение наблюдалась в дистальной части рыбы (рис 4A, справа). Количество диссеминированных клеток дополнительно увеличена в 3 точек на дюйм (фиг 4A и 4D). В противоположность этому , когда клетки заражали М2 в данио, они проявляли умеренное распространение в теле рыбы после 2 точек на дюйм (фиг.4В). Они также показали увеличение распространение после того, как прошло время (рис 4F). Как показано на фиг.4Се и 4G, M1 клетка часто распространяется в данио циркуляции, и даже активная локальная миграция в перивителлиновом пространстве была нечастой в течение периода наблюдения. Клетка масса М1 была фактически задержана в первоначальном месте инъекции. Если определение положительного распространения или метастаза как> 5 клеток в организме рыбсс = "Xref"> 4, MDA-MB-231 и М2 клеток метастазов наблюдалось у 92% и 57% рыбы, соответственно, в 3 точек на дюйм (4G) Рис. В противоположность этому, никакого положительного распространения не наблюдалось с клетками M1. Таким образом, эта модель данио прогрессии раковых клеток человека точно отражает относительный уровень метастатического потенциала различных клеток у мышей. Неоваскуляризация (зеленый) , которые проросли из subintestinal сплетения эмбрионального данио и проникли клеточную масса MDA-MB-231 или М2 также присутствовала после перивителлинового пространства инъекции опухолевых клеток с последующей 3 -х днями инкубации (фиг 4A и 4B, слева ). В соответствии с инвалидностью в распространении, только небольшая неоваскуляризация была обнаружена на клеточной имплантации М1 (рис 4C).
В эмбриональном ксенотрансплантате данио модели с mCherry-мечеными клетками MDA-MB-231 и инъекция Doc, лабораторияeled раковые клетки в tailfin в данио считается представителем активного кровоподтека. В mCherry-меченые клетки MDA-MB-231 вводили в 2 денье. В 3-х точках на дюйм, клетки начали мигрировать из сосудов в tailfin, которая обогащена коллагеном. Отдельные клетки MDA-MB-231 мигрировали один за другим, независимо от сосудов, к отдаленному tailfin (фиг.5А). В 6 точек на дюйм, вторжение может быть количественно определена путем подсчета количества клеток, которые мигрировали в tailfin ткани. В mCherry-меченого M2 клеток Doc модели инъекции, инъекции также была проведена в 2 денье. Тем не менее, наблюдались кластерный фенотип во время активного процесса транссудации. На 1 дюйм, клетки M2 начали мигрировать из сосудов в СНТ в данио. В 2 точек на дюйм, то мигрировавших клеток М2 начала формирования кластера между судами в СНТ (фигура 5В). Количественное М2 инвазивного числа клеток кластера в СНТЕ области может быть проведена при6 точек на дюйм.
Рисунок 1: Основные этапы исследования инвазивного поведения клеток рака молочной железы в эмбриональном данио. (А) После пересечения родительского данио в течение ночи, Тд (FLI1: EGFP) , данио эмбрионы были собраны на следующее утро , и поддерживали при 28 ° С. (B) Эмбрионы dechorionated с мелким пинцетом под стереомикроскопом 48 ч после оплодотворения (HPF). Меченые клетки рака молочной железы были собраны и повторно суспендируют в небольшом количестве PBS. После хорошего препарата, подвешенные клетки были загружены в одну иглу. Приблизительно 400 клеток вводили в канал Кювья (Doc) из перивителлинового пространства под стереомикроскопом. Инъецированные эмбрионы поддерживали при 33 ° С. (С) 2 ч после инъекции (HPI), эмбрионы были подвергнуты саreful скрининг под флуоресцентным стереомикроскопом. Эмбрионы выдерживали при 33 ° С в течение 3 или 6 дней. В течение интервала, эмбрионы были подвергнуты проектируемой обработке. (D) распространение раковых клеток за счет перивителлинового пространства инъекции или путем инъекции вторжения Doc был обнаружен, подсчитывали и визуализировали с помощью конфокальной микроскопии 3 или 6 дней после инъекции (точек на дюйм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: перивителлиновое место укола пространства и общие ошибки. (А) около 400 mCherry-меченые клетки (MDA-MB-231) были введены в перивителлиновое пространство. Светлый (верхний), зеленый васкулатура (средняя верхняя), и красная клеточная масса (средний нижний) Injectред данио эмбрионы были захвачены с помощью конфокальной микроскопии. Объединенное изображение (нижний) из трех каналов показывает стерео расположения массы клеток в эмбрионе. (В) Клетки не нацелены перивителлиновое пространство соответствующим образом . Желточный мешок был разорван. (С) Введенные клетки ниже порога (намного меньше , чем 400). (D) Введенные клетки выше порога (намного больше , чем 400). Клеточная масса была слишком близко к воздуховоду Кювье, который имеет широкий поток крови. Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Обзор протока Кювье (Doc) инъекции. (А) Схема инъекции Doc через 2 дня после оплодотворения (дпф) с клетками рака молочной железы в данио эмбрионов. Стрелка указывает на док. (В) Примеры положительных инъекций, с около 400 клеток рака молочной железы; отрицательные инъекции, в том числе желточного misinjection; и неправильное число клеток вводили в 4 HPI. Стрелки и кружки указывают вводили клетки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Сравнение способности распространения среди различных клеточных линий рака молочной. Приблизительно 400 mCherry меченного MDA-MB-231, MCF10Aras (М2), или MCF10A (М1) клетки вводили в перивителлиновом пространство эмбрионов данио 48 HPF. Инъецированные эмбрионы наблюдались в течение 3-х дней. (А, В, и С) высокого Ресоlution микрофотография , показывающая репрезентативные миграции и распространения процесс MDA-MB-231 (A), M2 (B) и (C M1) клетки в отдельных эмбриональных телах 1, 2 и 3 дня после инъекции (точек на дюйм). Левый, миграция клеток в перивителлиновом пространстве (красный) и перитуморальном и внутриопухолевых сосудистой система (зеленый). Желтые сигналы указывают на перекрытие микрососудов и клеток. Средний, весь образ зародыша. Право, визуализация диссеминированных клеток в задней части эмбриона. Желтые стрелки указывают на одиночные диссеминированного клетки. Шкала бар = 50 мкм. (D, E и F) Количественное числа диссеминированных клеток в каждой эмбрионального тела в 1, 2 и 3 точек на дюйм. Результаты выражены в виде среднего значения ± SEM. Результаты односторонней дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим пост-специального анализа показаны. Р <0,05 была принята в качестве статистически значимой (* 0,01 <p <0,05; ** 0.001 <P <0,01; *** P <0,001. (G) Сравнение числа случаев intravasation для клеток MDA-MB-231, М2 и М1 в эмбриональных органов на 1, 2 и 3 точек на дюйм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Различное поведение клеток метастазов MDA-MB-231 и М2 в данио с каналом Cuvier инъекции. (А) Представитель конфокальной изображения данио с последующим через 3, 4 и 5 точек на дюйм , чтобы показать миграции поведение одноклеточных клеток MDA-MB-231 в данио. Стрелки указывают на инвазивные клетки MDA-MB-231, которые мигрировали из сосудов в плавники. Шкала бар = 200 мкм в левой колонке, 50 мкм в правой колонке. (B) , представительконфокальные изображения данио с последующими через 1, 2 и 3 точек на дюйм, чтобы показать ячейки кластера миграции поведение клеток М2 в данио. Стрелки указывают на инвазивные клетки М2, которые мигрировали из сосудов в хвостовом гемопоэтической ткани (СНТ) и сформировали кластер между судами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали два метода для исследования инвазивного поведения клеток рака молочной железы в Tg (FLI1: EGFP) эмбрионы данио, с перивителлиновым пространства и Doc инъекциями. Вводя раковые клетки, меченные химическим красителем или флуоресцентного белка в трансгенных эмбрионов данио, динамические и пространственные характеристики инвазии и метастазирования может быть четко отслеживается в режиме реального времени на одноклеточных или уровне кластера под флуоресцентным микроскопом. В большинстве случаев, быстрое прогрессирование метастазов в данио гарантирует, что анализ может быть выполнен в течение 1 недели после трансплантации. Кроме того, мощные статистические данные могут быть получены при больших когорт рыб.
Ранние и поздние события метастатического каскада могут быть смоделированы и воспроизводятся путем введения раковых клеток в перивителлиновом пространство или Док, соответственно. Перивителлиновое пространство является ограниченным пространством между перидермой рыбы и желточным мешком, который аллоWS один для мониторинга распространения отдельных опухолевых клеток из основных сайтов в живом организме. После имплантации, раковые клетки подвергаются локальной миграции и инвазии в пределах перивителлинового пространства (считаются основным сайтом), а затем они intravasate в кровеносные сосуды и распространять вместе с циркуляцией. На голове и tailfin (считаются дальними целевыми сайтами), раковые клетки накапливаются в узкой капиллярной кровати и узловом. Таким образом, количество клеток, которые находятся в отдаленных местах в теле рыбы является измерением метастатического потенциала. Кроме того, более вырожденные клетки могут наблюдаться в более поздние моменты времени, что также верно для анализа впрыска дока.
Док представляет собой увеличенная общие кардинальная вену с обширным потоком 24 в крови. Непосредственно ориентация на доке как место инъекции вводит раковые клетки в кровеносную систему. На практике, клетки рака молочной железы диффузных по всей эмбриональному организму черезпоток крови мгновенно после инъекции Doc. Клетки затем арестовывают в хвостовую вену и спинной аорты. Экстравазационный, вторжение, и формирование микрометастазов можно наблюдать последовательно в течение 6 дней. Как сообщалось ранее 16, метастатические клетки MDA-MB-231 и предраковые клетки молочных желез М2 имеют различные инвазивные фенотипы. Клетки MDA-MB-231 подвергаются нашествию одноклеточных коллагена матрицы богатых tailfin. Таким образом, вторжение потенциал клеток MDA-MB-231 может быть измерен путем подсчета количества клеток, которые излившиеся и вторглись в tailfin ткань. В противоположность этому, клетки М2 образуют кластеры различных размеров и пройти коллективное вторжение в СНТ. Количественные вторжения потенциала клеток М2 путем подсчета количества кластеров в этом протоколе является трудным и предпочтительно осуществляют путем создания 3D изображений с помощью конфокальной микроскопии и определения объема сгруппированных опухолевых клеток.
Техническая проблема в раковых клетках микро-инъекции успешно нацеливание перивителлинового пространства или дока. Микроинъекции большого числа зародышей является утомительной процедурой, требующей высококвалифицированного и пациента оператора. Факторы, способствующие вариации результатов в отдельных рыб включают в себя стадию развития эмбриона при введении, различия в количестве клеток, инъецированных и утечка клеток в желточный мешок. Хотя редко, манипуляция может непреднамеренно проникать в сосудистую систему и ввести клетки в кровеносную систему непосредственно, особенно в перивителлиновом пространстве инъекции. Для дальнейшего снижения вариации и обеспечение достоверности анализов, микроскопическое исследование необходимо исключить безоговорочную рыбу в моменты времени на протяжении всего процесса. Кроме того, ослепленный анализ профессионал без знания установки настоятельно советуют добиться непредвзятых количественным.
Таким образом, эти две модели, которые мы ввели здесь пролить свет навизуализации процессов вторжения клеток и метастазирование в естественных условиях без инвазивных процедур. Хотя мы изучали только раковые клетки молочной железы в двух моделях относительно метастатического потенциала, они могут быть экстраполированы на другие виды рака. Кроме того, эти модели могут иметь более широкое применение при определении механизмов и новые молекулярные мишени, контролирующие метастазирование раковых клеток с помощью (эпи) генетических манипуляций. Из - за более высокой проницаемости эмбрионов данио по низкомолекулярных соединений по сравнению с кормлением или инъекции грызунов 25, обе представленные модели также имеют преимущества с точки зрения высокопроизводительного скрининга потенциальных новых лекарственных средств против вторжения / метастазирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Исследования членов семьи TGF-β поддерживаются Cancer Genomics центр Нидерландов. Сиджия Лиу и Цзян Ren поддержаны Советом Стипендии Китая в течение 4 лет обучения в университете Лейдена. Мы благодарим доктора Фред Миллер (Барбара Энн Karmanos институт рака, Детройт, Мичиган, США) для клеточных линий MCF10A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
- Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).
- Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).
- Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).
- Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, Suppl 1. 62-87 (2003).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).
- He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
