Summary
A continuación, describimos los modelos de pez cebra de xenoinjerto utilizando dos sitios de inyección diferentes, es decir, espacio perivitelino y el conducto de Cuvier, para investigar el comportamiento invasivo y para evaluar el potencial intravasación y la extravasación de células de cáncer de mama humano, respectivamente.
Abstract
En muchos casos, los pacientes con cáncer no mueren de un tumor primario, sino más bien debido a la metástasis. Aunque numerosos modelos de roedores están disponibles para el estudio de la metástasis del cáncer in vivo, se necesitan otros, modelos de bajo costo eficientes y fiables para acceder rápidamente a los efectos potenciales de (epi) cambios genéticos o compuestos farmacológicos. Como tal, ilustrar y explicar la viabilidad de modelos de xenoinjertos utilizando células de cáncer de mama humanas inyectadas en embriones de pez cebra para apoyar este objetivo. Bajo el microscopio, proteínas fluorescentes o células de cáncer de mama humano marcado químicamente se trasplantan en embriones de pez cebra transgénico, Tg (fli: EGFP), en el espacio perivitelino o conducto de Cuvier (Doc) 48 h después de la fertilización. Poco después, el proceso temporal-espacial de la invasión de células cancerosas, la difusión y la metástasis en el cuerpo de los peces que viven se visualizó en un microscopio fluorescente. Los modelos usando diferentes sitios de inyección, es decir, porespacio ivitelline o Doc son complementarios entre sí, lo que refleja la etapa temprana (etapa intravasación) y la etapa tardía (etapa extravasación) de la cascada metastásica de múltiples etapas de los acontecimientos. Por otra parte, la angiogénesis peritumoral y intratumoral se puede observar con la inyección en el espacio perivitelino. todo el período experimental no más de 8 días es. Estos dos modelos combinan el etiquetado celular, micro-trasplante, y las técnicas de imagen de fluorescencia, lo que permite la rápida evaluación de la metástasis del cáncer en respuesta a las manipulaciones genéticas y farmacológicas.
Introduction
metástasis del cáncer Overt en la clínica comprende una serie de eventos complejos y de múltiples pasos conocidos como la "cascada metastásica". La cascada ha sido extensamente revisada y puede ser diseccionada en etapas sucesivas: la invasión local, intravasación, la difusión, la detención, la extravasación y la colonización 1, 2. Una mejor comprensión de la patogénesis de la metástasis del cáncer y el desarrollo de estrategias potenciales de tratamiento in vivo requieren robustos modelos de acogida de la propagación de las células cancerosas. Modelos de roedores están bien establecidos y son ampliamente utilizados para evaluar la metástasis 3, pero estos enfoques tienen una baja eficacia y limitaciones éticas y son costosos como un modelo de vanguardia para determinar si una manipulación particular podría afectar el fenotipo metastásico. Se necesitan otros modelos eficientes, y de bajo costo confiable para acceder rápidamente a los posibles efectos de (epi) cambios genéticos o Pharmacologcompuestos iCal. Debido a su alta homología genética para los seres humanos y la transparencia de su embriones de pez cebra (Danio rerio) han surgido como un modelo vertebrado importante y se están aplicando cada vez más para el estudio de los procesos de desarrollo, interacciones microbio-huésped, enfermedades humanas, la detección de drogas, etc . 4. Los modelos de metástasis de cáncer establecidas en el pez cebra puede proporcionar una respuesta a las deficiencias de los modelos de roedores 5, 6.
Aunque neoplasia espontánea apenas se ve en el pez cebra salvaje 7, hay varias técnicas de larga data para inducir el cáncer deseada en el pez cebra. Mutaciones de genes inducidos por carcinógenos o señalización activación de la vía pueden histológicamente y modelo de carcinogénesis molecularmente, imitando la enfermedad humana en el pez cebra 7, 8, 9. por taking ventaja de diversa avance y retroceso manipulaciones genéticas de oncogenes o supresores tumorales, (transgénicos) pez cebra también han permitido estudios potenciales de la formación de cáncer y de mantenimiento 6, 10. Los modelos de cáncer inducidos en el pez cebra cubren un amplio espectro, incluyendo digestivo, reproductivo, sangre, sistema nervioso y epitelial 6.
La utilización del pez cebra en la investigación del cáncer se ha expandido recientemente debido a la creación de modelos de xenoinjertos de células tumorales humanas en este organismo. Esto fue informado primero con células de melanoma metastásicos humanos que fueron arraigado con éxito en embriones de pez cebra en la etapa de blástula en 2005 11. Varios laboratorios independientes han validado la viabilidad de este trabajo pionero mediante la introducción de una amplia gama de mamíferos líneas de células cancerosas en el pez cebra en diversos sitios y etapas de desarrollo 5 </ Sup>. Por ejemplo, las inyecciones de cerca el blastodisco y blastocisto de la blástula; inyecciones en el saco vitelino, el espacio perivitelino, conducto de Cuvier (Doc), y la vena cardinal posterior de 6-h- a los embriones 5 días de edad; y las inyecciones en la cavidad peritoneal de larvas inmunosuprimidos 30 días de edad, se han realizado 5, 12. Además, también se informó de trasplantes tumorales alogénicas en el pez cebra 12, 13. Una de las grandes ventajas del uso de xenoinjertos es que las células de cáncer de injertado pueden ser fácilmente marcadas fluorescentemente y se distinguen de las células normales. Por lo tanto, las investigaciones sobre los comportamientos dinámicos de formación microtumor 14, la invasión de células y la metástasis 15, 16, 17, la angiogénesis inducida por el tumor 15, 18, y las interacciones entre las células cancerosas y factores del huésped 17 puede visualizarse claramente en el cuerpo de pescado vivo, especialmente cuando se aplican líneas de pez cebra transgénico 5.
Inspirado por el alto potencial de modelos de xenoinjerto de pez cebra para evaluar la metástasis, hemos demostrado las propiedades de extravasación transvascular de diferentes líneas celulares de cáncer de mama en la zona tailfin de Tg (fli: EGFP) embriones de pez cebra a través de inyecciones Doc 16. El papel de factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) proteína 16 y morfogenética ósea (BMP) 19 vías de señalización en la invasión de células del cáncer de pro- / anti-mama y la metástasis se investigó también en este modelo. Por otra parte, también recapitulado la capacidad intravasación de diversas líneas celulares de cáncer de mama en circulación utilizando modelos de pez cebra de xenoinjerto con inyecciones espacio perivitelino.
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Protocol
Toda la investigación usando el transgénico fluorescente Tg pez cebra (fli: EGFP) cepa, que ha mejorado la proteína verde fluorescente (EGFP) marcado con vasculatura 20, incluida la vivienda y los experimentos, se llevó a cabo de acuerdo con las directrices internacionales y fue aprobado por el Comité institucional local para el Bienestar Animal (de Dier ethische Commissie (DEC) del Centro Médico de la Universidad de Leiden.
NOTA: Tal como se resume en la Figura 1, el protocolo se divide aproximadamente en cuatro pasos: recogida de embriones (Figura 1A), la microinyección (Figura 1B), de detección (Figura 1C), y el análisis (Figura 1D).
1. Preparar las agujas de inyección
- Preparar agujas de inyección con microcapillaries de vidrio de borosilicato. Ponga un microcapilar en un dispositivo de micropipeta extractor con los ajustes siguientes: presión del aire, 500; calor, 650; tirar, 100; velocidad, 200; hora,40. Mantener las agujas de inyección en una placa de soporte de la aguja hasta que se utilizan para la inyección.
2. preparar las células de cáncer de mama fluorescentes, genéticamente etiquetados para Inyección
- cáncer de mama humano MDA-MB-231 células de cultivo a 37 ° C en medio DMEM de alta glucosa que contenía L-glutamina, suero bovino fetal al 10%, y 1: 100 de penicilina-estreptomicina (pen-strep).
- Cultura las líneas epiteliales de mama de células, MCF10A (M1) y MCF10A-Ras (M2), a 37 ° C en medio DMEM / F12 que contienen L-glutamina con 5% de suero de caballo, 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico, 10 mg / mL insulina, 100 ng / ml de la enterotoxina del cólera, 0,5 mg / ml de hidrocortisona, y 1: 100 pen-strep.
- Producir mCherry lentivirus por co-transfección de PLV-mCherry, pCMV-VSVG 21, pMDLg-RRE (gag / pol) 22, y pRSV-REV 22 plásmido en células HEK293T. sobrenadantes de células Cosecha 48 h después de la transfección y se almacena a -80 ° C.
- yonfect células MDA-MB-231, M1, y M2 en 30% de confluencia durante 24 h con sobrenadantes lentivirales diluyeron 1: 1 con medio de cultivo normal en presencia de 5 ng / ml de polibreno.
- Seleccionar clones de una sola célula mediante la dilución de las células en una placa de 96 pocillos, que permite la derivación de clones de células aisladas, hasta la obtención de las líneas celulares que expresan mCherry estables.
- Cultura matraz de un T75 de células para inyección. Recoger las células en 80% de confluencia con un tratamiento de tripsina-EDTA 0,5%. Se lavan las células con PBS 1x 2-3 veces.
- Resuspender las células en aproximadamente 200 l de PBS. Almacenar a ellos 4 ° C durante menos de 5 h antes de la inyección.
3. Preparar embriones de pez cebra para Inyección
- Configurar parejas reproductoras de pez cebra y recoger los embriones, como se muestra en un artículo JoVE anterior por Rosen et al. 23.
- Seleccionar los embriones que se encuentran en 0-4 HPF mediante la eliminación de los embriones fertilizados y anormales. Mantener los embriones en un dis Petrih lleno de agua de huevo (sales marinas 60 g / ml; ~ 60 embriones / placa) y se incuba a 28 ° C.
- Dechorionate los embriones con pinzas finas en 48 hpf.
- Anestesie los embriones mediante la transferencia de ellos a 40 mg / ml tricaína (ácido 3-aminobenzoico) que contiene agua de huevo aproximadamente 2 min antes de la inyección, pero no más de 2 h antes de la inyección.
NOTA: tricaína solución madre (4 mg / ml, 100x) se prepara como 400 mg de polvo de tricaína en 97,9 ml de agua doblemente destilada y 2,1 ml de 1 M Tris-base (pH 9), con el pH ajustado a 7,4. Conservar en el congelador a -20ºC.
4. Las células de cáncer de mama Inyectar Humanos en el espacio perivitelino
- Cargar 15 l de la suspensión celular en una aguja de inyección. Montar la aguja en el micromanipulador y romper la punta de la aguja con unas pinzas finas para obtener un diámetro abertura de la punta de 5-10 m.
- Use un picopump neumática y un manipulador para realizar la microinyección. ajust la picopump para inyectar 400 células cada vez. Antes de la inyección, contar el número de células manualmente mediante la inyección de las células en la parte superior de una placa de Petri que contiene 1% de agarosa.
- Alineación anestesiados embriones (2-3 días después de la fertilización (dpf)) en una placa de agarosa inyectar plana 1%, alrededor de 10 embriones cada vez.
- Orientar la placa de inyección con la mano durante las inyecciones para colocar los embriones en la posición preferida para la inserción de la aguja (es decir, diagonal).
- Punto de la punta de la aguja en el sitio de inyección e insertar suavemente la punta de la aguja en el espacio perivitelino entre el saco vitelino y la peridermis del embrión de pez cebra (Figura 2A).
- Inyectar aproximadamente 400 células tumorales mCherry marcado. Asegúrese de que el saco vitelino no se rompe para evitar la implantación en el saco vitelino.
5. Inyectar células de cáncer de mama humano en el Doc
- Preparar la aguja de inyección y embriones de pez cebra como se describe i n protocolo de los pasos 1, 2 y 3.
- Utilice un ángulo de aguja 45 ° de modo que el Doc puede abordarse desde el lado dorsal del embrión.
- Insertar la aguja en el punto de partida de la Doc (Figura 3A), justo dorsal a donde el conducto se inicia la ampliación sobre el saco vitelino, e inyectar aproximadamente 400 células; la inyección es correcta si el volumen dentro del conducto se expande directamente después del pulso y el saco vitelino.
NOTA: Varias inyecciones consecutivas se puede realizar sin necesidad de extraer la aguja. - La transferencia de los embriones de pez cebra inyectados al agua de huevo.
existe como una variación considerable entre embriones de pez cebra individuales, y como la muerte de los embriones después puede ocurrir inyección, un número relativamente grande de embriones de pez cebra (alrededor de 100) debe ser inyectado con células de cáncer: NOTA. - Mantener los embriones de pez cebra en 33 ° C para dar cabida a los requisitos óptimos de temperatura para peces y células de mamífero.
- Pantalla Cada pescado bajo un estereomicroscopio de fluorescencia a las 2 h después de la inyección (hpi) para la inyección espacio perivitelino (Figura 2) o al 2-24 hpi para la inyección Doc (Figura 2) para asegurar que todos los embriones son inyectadas con una número similar de células tumorales. Eliminar los embriones con errores de inyección, tales como rupturas (Figura 2B) o inyecciones (Figura 3B) del saco vitelino, y seleccionar embriones con células inyectadas a continuación (Figuras 2C y 3B) o por encima (figuras 2D y 3B) de umbral. Mantener sólo los embriones con aproximadamente 400 células en cultivo.
- Descartar la posibilidad de que las células se introducen directamente en la circulación durante el proceso de inyección mediante la eliminación de los embriones con células ya en circulación. También, eliminar cualquier embrión con una célula de masa cerca de la Doc (Figura 2D
7. Imagen y analizar el proceso metastásico
- Recoger varios embriones anestesiados con una pipeta Pasteur-punta ancha y transferirlos a la parte inferior de vidrio de un plato de poliestireno.
- Eliminar el exceso de agua y mantener una cantidad limitada de agua de huevo. Manipular el embrión en su posición con una herramienta de bucle de pelo y colocar una tapa en la parte superior de la copa.
- Utilice un microscopio confocal invertido en combinación con agua de inmersión o los objetivos secos de larga distancia. Coloque el embrión de tal manera que la región de interés es tan cerca del objetivo como sea posible.
- Realizar las imágenes inmediatamente después de la anestesia para reducir el riesgo de muerte debido a la evaporación del líquido.
- señales de captura de vasculatura marcado con EGFP y células tumorales marcadas con mCherry en la misma posición en los embriones para co-registrar células con vasos sanguíneos inyectados mediante la fusión de los dos canales de formación de imágenes.
- Para cada embrión de pez cebra, recoger dos conjuntos diferentes de imágenesde la región de la cabeza y la región de la cola.
- Cuantificar el número de células diseminadas.
- Para las inyecciones espacio perivitelino, contar el número de células en cada peces que han difundido de la masa celular hacia el cuerpo de los peces embrionaria dentro de las regiones de cabeza y cola 4, 15; las regiones están más allá de los límites de la cavidad del corazón frontalmente, en la parte superior de la dorsalmente vejiga natatoria, y más allá de la abertura urogenital caudalmente.
- Para la inyección Doc, contar el número de células individuales que han invadido las fibras de colágeno de la aleta de cola de la circulación (MDA-MB-231) o el número de grupos formados por células colectivamente (M2) en el tejido hematopoyético caudal (CHT) de cada pez cebra 19.
- Estudiar invasión y metástasis en más detalle mediante el uso de microscopía confocal (muy recomendable).
- Utilizar bajo aumento (objetivo 4X) a la imagen de todacuerpo y para obtener una visión general del modelo de difusión de células tumorales.
NOTA: aumento mayor (20X y 40X) es adecuado para el estudio de la angiogénesis intra- y peri-tumoral y la localización precisa de las células diseminadas en el cuerpo del embrión. - Usa un láser de 488 nm para escanear la vasculatura embrión de pez cebra y un láser de 543 nm para escanear las células tumorales implantadas marcadas con fluorescencia roja. Obtener una imagen de alta calidad mediante el escaneo de cada embrión de ocho a diez pasos. Escanear y un promedio de cada paso seis veces.
- Utilizar bajo aumento (objetivo 4X) a la imagen de todacuerpo y para obtener una visión general del modelo de difusión de células tumorales.
- Con cuidado, coloque el embrión de nuevo al agua de huevo si es necesario para experimentos adicionales.
8. Realizar un análisis estadístico mediante análisis unidireccional de varianza (ANOVA) seguido de análisis post hoc
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Representative Results
En el modelo de pez cebra xenoinjerto embrionario con una inyección espacio perivitelino, la diseminación hematógena de células cancerosas marcadas en el cuerpo de pescado se considera como la migración activa. Este proceso puede ser detectado y cuantificado en un microscopio fluorescente, como se describe en los métodos anteriores. Para ilustrar este modelo de xenoinjerto, seguimos el proceso de difusión de diferentes líneas celulares de cáncer de mama con conocida (o sin) invasión / metástasis potencial según in vitro y los estudios del ratón in vivo, incluyendo las células M1 benigna epiteliales normales de mama en, premaligna transformado-HRAS células M2, y células altamente metastásicas MDA-MB-231, después de la inyección 1 día (dpi) en adelante. Una imagen de microscopía confocal de alta resolución mostró que la MDA-MB-231 células (rojo) exhiben un fenotipo agresivo, con bordes irregulares en el espacio perivitelino. protuberancias pseudópodos-como y frentes invasivos eran también frecuentemente presentes (Figura 4A, izquierda). Unas pocas células diseminadas en la circulación de sangre tan pronto como 1 dpi (Figura 4A, derecha). En 2 dpi, se observó clara de difusión en las partes distales de los peces (Figura 4A, derecha). El número de células diseminadas aumentó aún más a 3 dpi (Figura 4A y 4D). Por el contrario, cuando las células M2 fueron desafiados en el pez cebra, exhibieron modesto propagación en el cuerpo de los peces después de 2 dpi (Figura 4B). También mostraron una mayor difusión después de que pasaba el tiempo (Figura 4F). Como se muestra en la Figura 4C y 4G, las células M1 con poca frecuencia difunden en circulación pez cebra, e incluso la migración local activa dentro del espacio perivitelino fue poco frecuente durante el período de observación. La masa de células M1 fue prácticamente detenida en el lugar de la inyección inicial. Si la definición de difusión positivo o metástasis,> 5 células en el cuerpo de los pecesss = "xref"> 4, se observó MDA-MB-231 y M2 metástasis de las células en el 92% y el 57% de los peces, respectivamente, a 3 dpi (Figura 4G). En contraste, no se observó la difusión positiva con las células M1. Por lo tanto, este modelo de pez cebra de la progresión de células de cáncer humano refleja con precisión el nivel relativo de potencial metastásico de las diferentes células en ratones. La neovascularización (verde) que brotó del plexo subintestinal del pez cebra embrionario y penetró en la masa de células MDA-MB-231 o M2 también estaba presente después de la inyección espacio perivitelino de las células tumorales, seguido de 3 días de incubación (Figura 4A y 4B, izquierda ). En consonancia con la discapacidad en la difusión, sólo se detectó una ligera neovascularización tras la implantación de células M1 (Figura 4C).
En el modelo de xenoinjerto de embriones de pez cebra con células MDA-MB-231-etiquetados mCherry y la inyección Doc, el laboratoriocélulas de cáncer de ELED en la aleta de cola del pez cebra se consideran representativos de la extravasación activa. Las células fueron inyectadas MDA-MB-231-etiquetados mCherry en 2 dpf. A los 3 dpi, las células comenzaron a migrar fuera de los vasos a la aleta de cola, que está enriquecido con colágeno. Las células individuales MDA-MB-231 migraron uno por uno, independientemente de los vasos, a la tailfin distante (Figura 5A). A los 6 dpi, la invasión podría cuantificó contando el número de células que migraron en el tejido tailfin. En el modelo de la inyección de células Doc M2 marcado con mCherry, la inyección también se realizó a 2 dpf. Sin embargo, se observó un fenotipo agrupado durante el proceso de extravasación activa. En dpi 1, las células M2 comenzaron a migrar hacia fuera de los vasos en la CHT del pez cebra. En 2 dpi, las células M2 migrados comenzaron a formar un clúster entre los vasos en el CHT (Figura 5B). La cuantificación del número de clúster de células invasoras M2 en la región de CHT podría llevarse a cabo a6 dpi.
Figura 1: Principales pasos para investigar el comportamiento invasivo de células de cáncer de mama en embriones de pez cebra. (A) Después de cruzar el pez cebra parental durante la noche, Tg (FLI1: EGFP) embriones de pez cebra se recogieron la mañana siguiente y se mantuvieron a 28 ° C. (B) Los embriones fueron dechorionated con pinzas finas bajo un estereomicroscopio 48 h después de la fecundación (HPF). Se recogieron las células de cáncer de mama etiquetados y re-suspendieron en una pequeña cantidad de PBS. Después de bien la preparación, las células suspendidas se cargaron en una aguja. Se inyectaron aproximadamente 400 células en el conducto de Cuvier (Doc) del espacio perivitelino bajo un estereomicroscopio. Los embriones inyectados se mantuvieron a 33 ° C. (C) 2 h después de la inyección (hpi), los embriones fueron sometidos a cacribado REFUL bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia. Los embriones se mantuvieron a 33 ° C durante 3 ó 6 días. Durante el intervalo, los embriones se sometieron al tratamiento diseñado. Se detectó (D) la difusión de células del cáncer por inyección espacio perivitelino o invasión por inyección Doc, se contaron y imágenes de microscopía confocal 3 o 6 días después de la inyección (dpi). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: sitio de la inyección espacio perivitelino y errores comunes. (A) Se inyectaron aproximadamente 400 células marcadas con mCherry (MDA-MB-231) en el espacio perivitelino. El campo claro (la más superior), vasculatura verde masa celular (media alta), y rojo (media baja) de injectembriones de pez cebra ed fueron capturados por microscopio confocal. La imagen resultante de la fusión (más bajo) de los tres canales muestra la posición estéreo de la masa celular en el embrión. (B) Las células no dirigen el espacio perivitelino apropiadamente. El saco vitelino se rompió. (C) células inyectadas por debajo del umbral (mucho menos que 400). (D) células inyectadas umbral por encima (mucho más que 400). La masa celular era demasiado cerca del conducto de Cuvier, que tiene una corriente de la sangre amplio. Barra de escala = 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Vista general del conducto de inyección Cuvier (Doc). (A) Representación esquemática de la inyección Doc a los 2 días después de la fertilización (dpf) con células de cáncer de mama en embriones de pez cebra. La flecha indica el doc. (B) Los ejemplos de inyecciones positivos, con alrededor de 400 células de cáncer de mama; inyecciones negativos, incluyendo la misinjection yema; y un número incorrecto de células inyectadas en 4 hpi. Las flechas y los círculos indican las células inyectadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación de la capacidad de difusión entre diversas líneas de células de mama. Se inyectaron Aproximadamente marcado con mCherry 400 MDA-MB-231, MCF10Aras (M2), o MCF10A (M1) las células en el espacio perivitelino de embriones de pez cebra 48 HPF. Los embriones inyectados fueron seguidos durante 3 días. (A, B, y C) de alta resomicrografías Lution que muestran el proceso de migración y difusión representante de MDA-MB-231 (A), M2 (B), y células M1 (C) en cuerpos de embriones individuales 1, 2, y 3 días después de la inyección (dpi). Izquierda, la migración celular en el espacio perivitelino (rojo) y la vasculatura intratumoral y peritumoral (verde). señales amarillas indican la superposición de microvasos y células. Media, toda la imagen del embrión. Derecho, la visualización de las células diseminadas en la parte posterior del embrión. puntas de flecha amarillas indican células diseminadas individuales. Barra de escala = 50 m. (D, E, y F) La cuantificación del número de células diseminadas en cada cuerpo embrionario en 1, 2, y 3 dpi. Los resultados se expresan como la media ± SEM. Los resultados de análisis de una vía de la varianza (ANOVA) seguido por el análisis post-hoc se muestran. P <0,05 fue aceptado como estadísticamente significativo (* 0,01 <p <0,05; ** 0.001 <p <0,01; *** P <0,001. (G) La comparación de las incidencias de intravasación para las células MDA-MB-231, M2 y M1 en los órganos embrionarios en 1, 2, y 3 dpi. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: diferentes comportamientos de MDA-MB-231 y M2 metástasis de las células en el pez cebra con el conducto de inyección Cuvier. (A) Imágenes confocales representativos de la pez cebra siguieron a los 3, 4, y 5 dpi para mostrar el comportamiento de migración de una sola célula de las células MDA-MB-231 en el pez cebra. Las flechas indican las células MDA-MB-231 invasivos que emigraron de los vasos en las aletas traseras. Barra de escala = 200 m en la columna de la izquierda, 50 micras en la columna de la derecha. (B) Representanteimágenes confocales del pez cebra siguieron a los 1, 2, y 3 dpi para mostrar el comportamiento de la migración grupo de células de las células M2 en el pez cebra. Las flechas indican células M2 invasivos que migraron fuera de los vasos en el tejido hematopoyético caudal (CHT) y se formó un grupo entre los vasos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, describimos dos métodos para investigar el comportamiento invasivo de las células de cáncer de mama en Tg (FLI1: EGFP) embriones de pez cebra, con el espacio perivitelino y Doc inyecciones. Mediante la inyección de células cancerosas marcadas con colorante químico o proteína fluorescente en embriones de pez cebra transgénico, las características dinámicas y espaciales de la invasión y la metástasis pueden ser claramente un seguimiento en tiempo real en el de una sola célula o nivel de clúster bajo un microscopio de fluorescencia. En la mayoría de los casos, la rápida progresión de la metástasis en el pez cebra se asegura de que el ensayo se puede realizar dentro de 1 semana después del trasplante. Por otra parte, las estadísticas de gran alcance se pueden obtener con grandes cohortes de peces.
Principios y finales de acontecimientos de la cascada metastásica podrían ser simulados y recapitulan mediante la inyección de las células cancerosas en el espacio perivitelino o Doc, respectivamente. El espacio perivitelino es el espacio confinado entre la peridermis de los peces y el saco vitelino, que allows uno para supervisar la difusión de células tumorales individuales desde sitios primarios en el cuerpo vivo. Después de la implantación, las células cancerosas se someten a la migración local y la invasión dentro del espacio perivitelino (considerado el sitio primario) y luego se intravasate en los vasos sanguíneos y difunden junto con la circulación. A la cabeza y tailfin (considerado sitios diana distantes), las células cancerosas se acumulan en los lechos capilares estrechos y extravasate. Por lo tanto, el número de células que se encuentran en los sitios distantes en el cuerpo de los peces es una medida de la capacidad metastásica. Además, las células más extravasación pueden ser observados en puntos de tiempo posteriores, que también es cierto para el ensayo de inyección Doc.
El Doc es una vena cardinal común ampliada con una amplia corriente de la sangre 24. Directamente dirigidas a la Doc como un sitio de inyección introduce las células de cáncer en el sistema circulatorio. En la práctica, las células de cáncer de mama se difunden por todo el cuerpo a través de la embrionariatorrente sanguíneo inmediatamente después de la inyección Doc. Las células entonces arresto en la vena y dorsal caudal aorta. La extravasación, la invasión y la formación de micrometástasis pueden ser observados sucesivamente dentro de los 6 días. Como se informó anteriormente 16, metastásicas MDA-MB-231 células y células M2 mamarias premalignas presentan diferentes fenotipos invasivos. MDA-MB-231 células se someten a la invasión de una sola célula de la tailfin matriz rica en colágeno. Por lo tanto, el potencial de invasión de las células MDA-MB-231 se puede medir mediante el recuento del número de células que han extravasación e invadido el tejido aleta caudal. En contraste, las células M2 forman grupos de diferentes tamaños y se someten a la invasión colectiva de la CHT. Cuantificar el potencial de invasión de las células M2 contando el número de grupos en este protocolo es difícil y se lleva a cabo preferiblemente haciendo una imagen en 3D usando microscopía confocal y la determinación del volumen de las células tumorales agrupadas.
El desafío técnico en micro célula de cáncerla inyección se dirige con éxito el espacio perivitelino o Doc. La microinyección de un gran número de embriones es un procedimiento tedioso que requiere un operador altamente experto y paciente. Los factores que contribuyen a las variaciones en los resultados en peces individuales incluyen la etapa de desarrollo del embrión durante la inyección, las diferencias en el número de células inyectadas, y la fuga de las células en el saco vitelino. Aunque es raro, la manipulación podría penetrar involuntariamente la vasculatura e introducir las células en el sistema circulatorio directamente, especialmente en la inyección espacio perivitelino. Para reducir aún más la variación y para asegurar la fiabilidad de los análisis, el examen microscópico es necesario excluir los peces no calificada en puntos de tiempo a lo largo del proceso. Además, el análisis cegado por un profesional sin el conocimiento del entorno se sugiere fuertemente para lograr la cuantificación objetiva.
En resumen, los dos modelos que presentamos aquí arrojan luz sobrela visualización de los procesos de invasión celular y la metástasis in vivo sin procedimientos invasivos. Aunque sólo estudiamos las células del cáncer de mama en dos modelos con respecto al potencial metastásico, que podrían ser extrapolados a otros tipos de cáncer. Por otra parte, los modelos podrían tener aplicaciones más amplias en la determinación de los mecanismos y nuevos objetivos moleculares que controlan la metástasis de células de cáncer usando (epi) manipulación genética. Debido a la mayor penetrabilidad de embriones de pez cebra por compuestos de molécula pequeña en comparación con la alimentación o inyección de roedores 25, los dos modelos presentados también tienen ventajas en términos de la selección de alto rendimiento de nuevos fármacos potenciales anti-invasión / metástasis.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los estudios sobre miembros de la familia TGF-β son apoyados por el Centro de Genómica del Cáncer Países Bajos. Sijia Liu y Jiang Ren son apoyados por el Consejo de Becas de China durante 4 años de estudio en la Universidad de Leiden. Agradecemos al Dr. Fred Miller (Ann Instituto del Cáncer Karmanos Bárbara, Detroit, MI, EE.UU.) para las líneas de células MCF10A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
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