Summary
Här beskriver vi xenograft zebrafisk modeller med hjälp av två olika injektionsställen, dvs perivitellina utrymme och kanal Cuvier, för att undersöka invasiva beteende och för att bedöma intravasering och extravasering potential av mänskliga bröstcancerceller, respektive.
Abstract
I många fall gör cancerpatienter inte dö av en primärtumör, utan snarare på grund av metastaser. Trots att många gnagare modeller finns för att studera cancermetastaser in vivo behövs andra effektiva, tillförlitliga, modeller låg kostnad för att snabbt få tillgång till de potentiella effekterna av (EPI) genetiska förändringar eller farmakologiska föreningar. Som sådan, vi belysa och förklara möjligheten att xenograft modeller med hjälp av humana bröstcancerceller injiceras i zebrafisk embryon för att stödja detta mål. Under mikroskop, är fluorescerande proteiner eller kemiskt märkta humana bröstcancerceller transplanteras in i transgena zebrafiskembryon, Tg (fli: EGFP), vid perivitellina utrymme eller kanal av Cuvier (Doc) 48 h efter befruktning. Kort därefter, den temporala-spatial process av cancer cellinvasion, spridning och metastaser i den levande fiskkroppen visualiseras under ett fluorescerande mikroskop. Modellerna använder olika injektionsställen, dvs perivitelline utrymme eller Dok är komplementära till varandra, vilket återspeglar den tidigt stadium (intravasering steg) och sent stadium (extravasering steg) av flerstegs metastaserad kaskad av händelser. Vidare kan observeras peritumoral och intratumoral angiogenes med injektion i perivitellina rymden. Hela försöksperioden är inte mer än 8 dagar. Dessa två modeller kombinera cellmärkning, mikro-transplantation, och fluorescens avbildningstekniker, som möjliggör snabb utvärdering av cancermetastaser som svar på genetiska och farmakologiska manipulationer.
Introduction
Overt cancermetastas i kliniken innefattar en serie av komplexa och flera steg händelser känd som "metastaserande kaskad". Kaskaden har i stor utsträckning granskats och kan dissekeras in successiva steg: lokal invasion, intravasering, spridning, gripande, extravasering och kolonisering 1, 2. En bättre förståelse av patogenesen av cancermetastaser och utveckling av potentiella behandlingsstrategier in vivo kräver robusta värd modeller av cancer cell spridning. Gnagarmodeller är väletablerade och används i stor utsträckning för att utvärdera metastas 3, men dessa tillvägagångssätt har låg verkningsgrad och etiska begränsningar och är kostsamma som en framkant modell för att bestämma huruvida en speciell manipulation kan påverka den metastatiska fenotypen. Det behövs andra effektiva, tillförlitliga, billiga modeller för att snabbt komma åt de potentiella effekterna av (EPI) genetiska förändringar eller Pharmacological föreningar. På grund av deras höga genetiska homologi till människor och insyn i deras embryon zebrafisk (Danio rerio) har dykt upp som en viktig ryggradsdjur modell och tillämpas i allt högre grad till studiet av utvecklingsprocesser, mikrob-värd-interaktioner, mänskliga sjukdomar, läkemedelsscreening, etc . 4. De cancermetastas modeller är etablerade i zebrafisk kan ge ett svar på bristerna i gnagarmodeller 5, 6.
Även om spontan neoplasi knappast ses i vildzebrafisk 7, finns det flera långvariga tekniker för att framkalla den önskade cancer hos zebrafisk. Karcinogen-inducerade genmutationer eller signaleringsvägen aktivering kan histologiskt och molekylärt modell karcinogenes, imitera human sjukdom i zebrafisk 7, 8, 9. Med taking fördel av olika framåt- och bakåt genetiska manipulationer av onkogener eller tumörsuppressorer, (transgena) zebrafisk har också gjort det möjligt potentiella studier av cancerbildning och underhåll 6, 10. De inducerade cancermodeller i zebrafisk täcka ett brett spektrum, inklusive matsmältnings, reproduktiva, blod, nervsystemet, och epitelial 6.
Utnyttjandet av zebrafisk inom cancerforskningen har expanderat nyligen på grund av etableringen av humana tumörcells xenograft-modeller i denna organism. Detta rapporterades först med humana metastaserande melanomceller som framgångsrikt inympade i zebrafisk embryon vid blastula skede 2005 11. Flera oberoende laboratorier har validerat genomförbarheten av detta banbrytande arbete genom att införa en mängd olika däggdjurscancercellinjer i zebrafisk vid olika platser och utvecklingsstadier 5 </ Sup>. Till exempel injektioner nära blastocysten och blastocyst av blastula skede; injektioner i gulesäcken, perivitellina utrymme, kanalen hos Cuvier (Doc), och posterior kardinal åder av 6-h- till 5 dygn gamla embryon; och injektioner i bukhålan av 30 dagar gamla immunsupprimerade larver har utförts 5, 12. Dessutom var allogen tumörtransplantationer rapporterades också i zebrafisk 12, 13. En av de stora fördelarna med att använda xenotransplantat är att transplanterade cancerceller kan enkelt fluorescensmärkt och särskiljas från normala celler. Hence, undersökningar av de dynamiska beteenden av microtumor bildning 14, cellinvasion och metastas 15, 16, 17, tumörinducerad angiogenes 15, en8, och interaktionerna mellan cancerceller och värdfaktorer 17 kan tydligt visualiseras i levande fisk kroppen, speciellt när transgena zebrafisklinjer appliceras 5.
Inspirerad av den höga potentialen för zebrafisk xenograft-modeller för att utvärdera metastas, vi visat de transvaskulär extravasation egenskaper hos olika bröstcancercellinjer i stjärtfenan området för Tg (fli: EGFP) zebrafisk embryon genom Doc injektioner 16. Rollen av transformerande tillväxtfaktor-β (TGF-β) 16 och benmorfogenetiskt protein (BMP) 19 signalvägar i pro- / anti-bröstcancercellinvasion och metastas undersöktes också i denna modell. Dessutom rekapituleras vi också intravasering förmågan hos olika bröstcancercellinjer i omlopp med hjälp av xenograft zebrafisk modeller med perivitellina utrymme injektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning med den transgena fluorescerande zebrafisk Tg (fli: EGFP) stam, som har förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP) -märkt vaskulatur 20, inklusive bostäder och experiment genomfördes i enlighet med de internationella riktlinjer och godkändes av den lokala Institutional kommittén for Animal Welfare (Dier Ethische Commissie (DEC) i Leiden University Medical Center.
OBS: Som sammanfattas i figur 1, är det protokoll som grovt delas upp i fyra steg: embryosamlings (Figur 1A), mikroinjektion (figur 1B), screening (Figur 1C), och analys (figur 1D).
1. Förbered injektionsnålarna
- Förbereda injektionsnålar med borsilikatglas mikrokapillärer. Sätta en microcapillary in i en mikropipett avdragare enhet med följande inställningar: lufttryck, 500; värme, 650; dra, 100; hastighet, 200; tid,40. Förvara injektionsnålar i en nålhållare plattan tills de används för injektion.
2. Förbered Fluorescerande genetiskt Märkta bröstcancerceller för injektion
- Kultur humana bröstcancer MDA-MB-231-celler vid 37 ° C i DMEM-hög glukos-medium innehållande L-glutamin, 10% fetalt bovint serum, och 1: 100 penicillin-streptomycin (pen-strep).
- Kultur de bröst epitelcellinjer, MCF10A (M1) och MCF10A-Ras (M2), vid 37 ° C i DMEM / F12-media innehållande L-glutamin med 5% hästserum, 20 ng / ml epidermal tillväxtfaktor, 10 mg / ml insulin, 100 ng / ml kolera enterotoxin, 0,5 mg / ml hydrokortison och 1: 100 pen-strep.
- Producera mCherry lentivirus genom samtransfektering PLV-mCherry, pCMV-VSVG 21, pMDLg-RRE (gag / pol) 22, och pRSV-REV 22 plasmiden i HEK293T celler. Skörd cellsupernatanter 48 h efter transfektion och förvara vid -80 ° C.
- jagnfect MDA-MB-231, M1 och M2-celler vid 30% konfluens i 24 h med lentivirala supernatanter späddes 1: 1 med normalt odlingsmedium i närvaro av 5 ng / ml polybren.
- Välja enkel-cellkloner genom utspädning celler i en 96-brunnars platta, som tillåter utväxt av isolerade cellkloner, tills man erhåller de stabila mCherry-uttryckande cellinjer.
- Kultur en T75-kolv av celler för injektion. Skörda cellerna vid 80% konfluens med en 0,5% trypsin-EDTA-behandling. Tvätta cellerna med 1 x PBS 2-3 gånger.
- Återsuspendera cellerna i ungefär 200 mikroliter av PBS. Lagra vid dem 4 ° C under mindre än 5 h före injektion.
3. Förbered Zebrafish embryon för injektion
- Inrätta zebrafisk avelspar och samla embryon, såsom visas i en tidigare JUPITER artikel av Rosen et al. 23.
- Välj de embryon som vid 0-4 HPF genom att ta bort obefruktade och onormala embryon. Håll embryon i en petri dish full av ägg vatten (60 | ig / ml havet salter; ~ 60 embryon / skål) och inkubera vid 28 ° C.
- Dechorionate embryon med fin pincett vid 48 HPF.
- Söva embryona genom att överföra dem till 40 | ig / ml tricaine (3-aminobensoesyra) innehållande ägg vatten ca 2 min före injektion, men inte längre än 2 h före injektion.
OBS: Tricaine stamlösning (4 mg / ml, 100x) framställs som 400 mg tricaine pulver i 97,9 ml dubbeldestillerat vatten och 2,1 ml 1 M Tris-bas (pH 9), med pH justerat till 7,4. Butik i -20 ° C frys.
4. Injicera humana bröstcancerceller in i perivitellina Space
- Belastning 15 mikroliter av cellsuspensionen in i en injektionsnål. Montera nålen på mikromanipulator och bryts av nålspetsen med fin pincett för att erhålla en spetsöppningsdiameter av 5-10 um.
- Använd en pneumatisk picopump och en manipulator för att utföra mikroinjektion. Adjust den picopump att injicera 400 celler varje gång. Före injektion, räkna cellnumren manuellt genom att injicera cellerna på toppen av en petriskål med en% agaros.
- Line up sövda embryon (2-3 dagar efter befruktning (dpf)) på en plan, en% agaros injicera platta, cirka 10 embryon varje gång.
- Orientera insprutningsplattan för hand under injektioner för att placera embryon i det föredragna läget för införing av nålen (dvs diagonalt).
- Peka nålspetsen vid injektionsstället och försiktigt in nålspetsen in i perivitellina utrymmet mellan gulesäcken och periderm av zebrafisk embryot (Figur 2A).
- Injicera cirka 400 mCherry-märkta tumörceller. Se till att gulesäcken inte bryts för att undvika implantering i gulesäcken.
5. Injicera humana bröstcancerceller in i Doc
- Förbereda injektionsnålen och zebrafiskembryon, såsom beskrivs i n-protokollet steg 1, 2, och 3.
- Använda en 45 ° nål vinkel så att Doc kan närma sig från den dorsala sidan av embryot.
- För in nålen i startpunkten för Doc (figur 3A), precis dorsal till där kanalen börjar bredda över gulesäcken, och injicera ca 400 celler; injektionen är riktig om volymen i kanalen expanderar direkt efter pulsen och gulesäcken.
OBS: flera på varandra följande injektioner kan utföras utan att extrahera nålen. - Överför injicerade zebrafisk embryon till ägg vatten.
OBS: Som betydande variation existerar bland individuella zebrafisk embryon, och som döds av embryon efter injektion kan förekomma, bör ett relativt stort antal av zebrafiskembryon (cirka 100) injiceras med cancerceller. - Bibehålla de zebrafisk embryon vid 33 ° C för att rymma de optimala temperaturkraven för fisk och däggdjursceller.
- Screena varje fisk under ett fluorescensstereomikroskop vid två timmar efter injektion (hpi) för perivitellina utrymmet injektion (Figur 2) eller vid 2-24 hpi för Dok injektion (figur 2) för att säkerställa att alla de embryon injiceras med en liknande antal tumörceller. Ta bort embryona med injektions fel, såsom brott (fig 2b) eller injektioner (Figur 3B) av gulesäcken, och plocka ut embryon med injicerade cellerna nedan (figurerna 2C och 3B) eller högre (fig 2D och 3B) tröskel. Håll bara embryon med cirka 400 celler i odling.
- Utesluta att cellerna införs direkt i omlopp under injektionsprocessen genom att ta bort embryon med celler som redan är i omlopp. Också, avlägsna varje embryo med en cellmassa nära Doc (figur 2D
7. Bild och Analysera metastatiska processen
- Samla flera sövda embryon med en bred-tip pasteurpipett och överföra dem till glas botten av en polystyren maträtt.
- Ta bort överflödigt vatten och hålla en begränsad mängd ägg vatten. Manipulera embryot på plats med ett hårstrå loop verktyg och placera ett lock ovanpå glaset.
- Använda ett inverterat konfokalmikroskop i kombination med vatten-immersion eller långväga torra mål. Placera embryot så att regionen av intresse är så nära målet som möjligt.
- Utföra avbildning omedelbart efter anestesi för att minska risken för dödsfall på grund av vätskeavdunstning.
- Fånga signaler från EGFP-märkt vaskulatur och mCherry-märkta tumörceller vid samma position på de embryon som co-registrera injicerade celler med blodkärl genom att slå samman de två avbildningskanalerna.
- För varje zebrafisk embryo, samla två olika uppsättningar av bilderfrån huvudet regionen och svansregionen.
- Kvantifiera antalet av spridda celler.
- För perivitellina rymd injektioner, räkna antalet celler i varje fisk som har spridits från cellmassan mot den embryonala fiskkroppen inom huvud- och svansområdena 4, 15; regionerna är bortom gränserna för hjärt hålighet frontalt, ovanpå simblåsan dorsalt, och bortom det urogenitala öppningen kaudalt.
- För Doc injektion, räkna antalet enskilda celler som har invaderat kollagenfibrer av stjärtfenan från cirkulationen (MDA-MB-231) eller det antal kluster som bildas av celler kollektivt (M2) i den kaudala hematopoetisk vävnad (CHT) av varje zebrafisk 19.
- Studera invasion och metastaser i mer detalj med hjälp av konfokalmikroskopi (rekommenderas).
- Använd låg förstoring (4X mål) för att avbilda helakropp och att få en överblick av tumörcellspridning mönstret.
OBS: Högre förstoring (20X och 40X mål) är lämplig för att studera inträ- och peri-tumoral angiogenes och den exakta lokaliseringen av disseminerade celler i embryot kroppen. - Använda en 488 nm laser för att skanna zebrafisk embryot vaskulaturen och en 543 nm laser för att skanna implanterade tumörceller märkta med röd fluorescens. Få en hög bildkvalitet genom att skanna varje embryo i åtta till tio steg. Scan och genomsnitt varje steg sex gånger.
- Använd låg förstoring (4X mål) för att avbilda helakropp och att få en överblick av tumörcellspridning mönstret.
- Placera försiktigt embryot tillbaka till ägget vatten om det behövs för ytterligare experiment.
8. Utför Statistisk analys Använda envägs variansanalys (ANOVA) följt av post hoc-analys
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den embryonala xenograft zebrafisk modell med en perivitellina utrymme injektion, är hematogen spridning av märkta cancerceller i fiskkroppen betraktas som aktiv migration. Denna process kan detekteras och kvantifieras under ett fluorescerande mikroskop, såsom beskrivits i metoderna ovan. För att illustrera denna xenotransplantatmodell följde vi spridningsprocessen av olika bröstcancercellinjer med känd (eller utan) invasion / metastas potential enligt in vitro och in vivo mus studier, inklusive de godartad normal bröst epiteliala M1-celler, Hras-transformerad premaligna M2-celler, och i hög grad metastatiska MDA-MB-231-celler, en dag efter injektion (dpi) och framåt. En högupplöst konfokalmikroskopi bilden visade att MDA-MB-231-celler (röda) uppvisar en aggressiv fenotyp, med oregelbundna gränser i perivitellina utrymme. Pseudopodia liknande utsprång och invasiva fronterna var också vanligt förekommande (Figur 4A, vänster). Några celler sprids in i blodcirkulationen så tidigt som 1 dpi (Figur 4A, höger). Vid 2 dpi, ades tydlig spridning observerades i de distala delarna av fisk (figur 4A, höger). Antalet disseminerade celler ökade ytterligare vid 3 dpi (Figur 4A och 4D). I motsats härtill, när M2-celler utmanades i zebrafisk, uppvisade de blygsam spridning i fiskkroppen efter 2 dpi (Figur 4B). De visade också ökad spridning efter tiden gick (Figur 4F). Såsom visas i figur 4C och 4G, M1-celler sällan spridas in i zebrafisk cirkulation, och även aktiv lokal migration inom perivitellina utrymmet var sällan under observationsperioden. M1 cellmassan var nästan fängslad på den ursprungliga injektionsstället. Om definiera positiv spridning eller metastaser som> 5 celler i fiskkroppenss = "xref"> 4, MDA-MB-231 och M2-cell metastas observerades hos 92% och 57% av fisken, respektive, vid 3 dpi (Figur 4G). Däremot kunde ingen positiv spridning observerades med M1 celler. Därför denna zebrafisk modell av human cancercell progression speglar noggrant den relativa nivån för metastatiska potentialen för de olika cellerna i möss. Neovaskularisation (grön) som grodda från subintestinal plexus av den embryonala zebrafisk och penetrerade MDA-MB-231 eller M2 cellmassan var också närvarande efter perivitellina utrymmet injektion av tumörceller följt av 3 dagars inkubation (Figur 4A och 4B, vänster ). Överensstämmer med den funktionsnedsättning i spridning, var endast ringa neovaskularisation detekteras vid M1 cellimplantation (Figur 4C).
I den embryonala xenograft zebrafisk modell med mCherry-märkta MDA-MB-231-celler och Dok injektion, labbetELED cancerceller i tailfin av zebrafisk anses vara representativa för aktiv extravasering. De mCherry-märkta MDA-MB-231-celler injicerades vid 2 dpf. Vid 3 dpi cellerna började att migrera ut ur fartyg till stjärtfenan, som är berikad med kollagen. Enkel MDA-MB-231-celler migrerade en efter en, oberoende från kärlen, till den avlägsna tailfin (figur 5A). Vid 6 dpi, kan invasionen kvantifieras genom att räkna antalet celler som migrerade in i tailfin vävnaden. I mCherry-märkt M2 cell Dok injektionsmodell, var injektionen också utförs vid 2 dpf. Dock en klustrade fenotyp observerades under den aktiva extravasering processen. Vid en dpi, M2 celler började att migrera ut från kärlen in i CHT av zebrafisk. Vid 2 dpi, de migrerade M2-celler börjat bilda ett kluster mellan kärlen i CHT (figur 5B). Kvantifiering av M2 invasiv cellkluster nummer i CHT-regionen kunde utföras vid6 dpi.
Figur 1: Huvudsakliga steg för att undersöka den invasiva beteendet av bröstcancerceller i embryonal zebrafisk. (A) Efter att ha korsat föräldrazebrafisk över natten, Tg (FLI1: EGFP) zebrafisk embryon uppsamlades följande morgon och hölls vid 28 ° C. (B) Embryona dechorionated med fin pincett under ett stereomikroskop 48 h efter befruktning (HPF). De märkta bröstcancerceller uppsamlades och återsuspenderades i en liten mängd PBS. Efter väl-beredning, suspenderades celler laddas i en nål. Cirka 400 celler injicerades i kanalen hos Cuvier (Doc) av perivitellina utrymmet under ett stereomikroskop. De injicerade embryona bibehölls vid 33 ° C. (C) 2 h efter injektion (hpi) överfördes embryona utsätts för careful screening under ett fluorescensstereomikroskop. Embryona bibehölls vid 33 ° C under 3 eller 6 dagar. Under pausen var embryona utsätts för utformade behandlingen. (D) Cancer cellspridning genom perivitellina utrymme injektion eller invasion av Doc injektion detekterades, räknades och avbildas av konfokalmikroskopi 3 eller 6 dagar efter injektion (dpi). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: perivitellina utrymme vid injektionsstället och vanliga fel. (A) Cirka 400 mCherry-märkta celler (MDA-MB-231) sprutades in i perivitellina rymden. Bright (översta), grön vaskulaturen (mitten övre), och röd cellmassa (mitten lägre) av injektEd zebrafisk embryon fångades av konfokalmikroskop. Den sammanslagna bilden (understa) av de tre kanalerna visar stereo placering av cellmassan i embryot. (B) Cellerna inte rikta perivitellina utrymmet på lämpligt sätt. Gulesäcken har spruckit. (C) Injicerade celler nedan tröskeln (mycket mindre än 400). (D) Injicerade celler ovanför tröskelvärdet (mycket mer än 400). Cellmassan var för nära kanalen hos Cuvier, som har en bred blodströmmen. Scale bar = 50 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Översikt över kanalen hos Cuvier (Doc) injektion. (A) Schematisk av Dok injektion vid 2 dagar efter befruktning (dpf) med bröstcancerceller i zebrafiskembryon. Pilen indikerar Doc. (B) Exempel på positiva injektioner, med cirka 400 bröstcancerceller; negativa injektioner, inklusive äggulan misinjection; och ett felaktigt antal celler injiceras vid 4 hpi. Pilar och cirklar indikerar injicerade cellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Jämförelse av spridning förmåga mellan olika bröstcellinjer. 400 mCherry-märkt approximativt MDA-MB-231, MCF10Aras (M2), eller MCF10A (M1) celler injicerades i perivitellina utrymmet av zebrafiskembryon 48 HPF. De injicerade embryona följdes under 3 dagar. (A, B, och C) Hög-resolution mikrofotografier som visar den representativa migration och spridningsprocessen av MDA-MB-231 (A), M2 (B), och M1 (C) celler i enskilda embryonala kroppar 1, 2, och 3 dagar efter injektion (dpi). Vänster, cellmigration i perivitellina utrymmet (röd) och peritumoral och intratumoral vaskulatur (grön). Gula signaler anger överlappningen av mikrokärl och celler. Middle, hela bilden av embryot. Höger, visualisering av sprids celler i den bakre delen av embryot. Gula pilspetsar indikerar enstaka disseminerade celler. Scale bar = 50 | im. (D, E, och F) Kvantifiering av antalet spridda celler i varje embryonala kroppen vid en, två och tre dpi. Resultaten uttrycks som medelvärdet ± SEM. Resultat från envägs variansanalys (ANOVA) följt av post-hoc analys visas. P <0,05 accepterades som statistiskt signifikant (* 0,01 <P <0,05; ** 0.001 <P <0,01; *** P <0,001. (G) Jämförelse av incidensen av intravasering för MDA-MB-231, M2, och M1-celler i embryonala organ på ett, två och tre dpi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Olika beteenden av MDA-MB-231 och M2-cellmetastasis i zebrafisk med kanalen hos Cuvier injektion. (A) Representativa konfokala bilder av zebrafisk följt vid 3, 4, och 5 dpi att visa enkelcellmigration beteendet hos MDA-MB-231-celler i zebrafisk. Pilar indikerar invasiva MDA-MB-231-celler som migrerade ut ur kärlen i tailfins. Scale bar = 200 | am i den vänstra kolumnen, 50 pm i den högra kolumnen. (B) Representativekonfokala bilder av zebrafisk följt vid en, två och tre dpi att visa cellkluster vandringsbeteende M2-celler i zebrafisk. Pilar indikerar invasiva M2-celler som migrerade ut ur kärlen till den kaudala hematopoetisk vävnad (CHT) och bildade ett kluster mellan kärlen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här, beskrev vi två metoder för att undersöka det invasiva beteendet hos bröstcancerceller i Tg (FLI1: EGFP) zebrafisk embryon, med perivitellina utrymmes- och Doc injektioner. Genom att injicera cancerceller märkta med kemisk färgämne eller fluorescerande protein i transgena zebrafisk embryon, kan de dynamiska och rumsliga egenskaper invasion och metastas tydligt spåras i realtid vid encelliga eller klusternivå under ett fluorescensmikroskop. I de flesta fall, säkerställer den snabba utvecklingen av metastaser i zebrafisk att analysen kan utföras inom en vecka efter transplantation. Dessutom kan kraftfulla statistik erhållas med stora grupper av fisk.
Tidiga och sena händelser av metastaserande kaskad kan simuleras och rekapituleras genom att injicera cancerceller i perivitellina utrymme eller Doc, respektive. Den perivitellina utrymmet är det begränsade utrymmet mellan periderm av fisken och gulesäcken, som allows en för att övervaka spridningen av enskilda tumörceller från primära ställen i den levande kroppen. Efter implantation, cancerceller genomgår lokal migration och invasion i perivitellina utrymmet (anses vara den primära platsen) och sedan de intravasate i blodkärlen och sprida tillsammans med cirkulationen. I spetsen och tailfin (anses avlägsna målplatser), cancerceller ackumuleras i smala kapillär sängar och extravasera. Därför, är antalet celler som finns vid de avlägsna platserna i fiskkroppen en mätning av metastatisk förmåga. Dessutom kan observeras mer extravaserat celler vid senare tidpunkter, vilket också gäller för Dok injektionsanalys.
Doc är en förstorad gemensam kardinal ven med en omfattande blodet 24. Direkt inriktning på Dok som ett injektionsställe introducerar cancerceller i cirkulationssystemet. I praktiken bröstcancerceller diffusa hela embryonala kroppen viablodströmmen omedelbart efter Doc injektion. Cellerna gripa sedan i svansvenen och dorsal aorta. Extravasering, invasion och mikrometastas bildning kan observeras successivt inom 6 dagar. Såsom tidigare 16 rapporterats, metastatiska MDA-MB-231-celler och premaligna bröst M2-celler uppvisar olika invasiva fenotyper. MDA-MB-231-celler undergår encelliga invasion av kollagenmatrisen rika tailfin. Sålunda kan invasionen potentialen hos MDA-MB-231-celler mätas genom att räkna antalet celler som har extravaserat och invaderade stjärtfenan vävnaden. I kontrast, M2-celler bildar kluster av olika storlekar och genomgå kollektiva invasion av CHT. Kvantifiering invasionen potentialen hos M2-celler genom att räkna antalet grupper i detta protokoll är svårt och utförs företrädesvis genom att göra en 3D-bild med hjälp av konfokal mikroskopi och bestämma volymen hos klustrade tumörceller.
Den tekniska utmaningen i cancercellen microinjektion är framgångsrikt targeting den perivitellina utrymme eller Doc. Mikroinjektion av stora antal embryon är en omständlig procedur som kräver en mycket skicklig och patient operatör. Faktorer som bidrar till variationer i resultaten i individuella fiskar innefattar utvecklingsstadiet av embryot vid injektion, skillnader i antalet celler som injicerats, och läckaget av celler in i gulesäcken. Men sällsynt, kan manipuleringen oavsiktligt penetrera kärlsystemet och införa celler i cirkulationssystemet direkt, särskilt i den perivitellina utrymmet injektion. För att ytterligare minska variation och att säkerställa tillförlitligheten av analyserna är nödvändigt mikroskopisk undersökning för att utesluta okvalificerade fisk vid tidpunkter under hela processen. Dessutom förblindade analys av en professionell utan kunskap om inställningen är starkt föreslås för att uppnå objektiv kvantifiering.
Sammanfattningsvis, de två modellerna vi införde här belysavisualisera processerna för cellinvasion och metastas in vivo utan invasiva procedurer. Även om vi studerade bara bröst cancerceller i två modeller när det gäller metastatisk potential, kan de extrapoleras till andra typer av cancer. Dessutom kunde de modeller har bredare tillämpningar i att bestämma de mekanismer och nya molekylära mål som styr cancercellmetastaser med användning av (epi) genetisk manipulation. På grund av den högre penetrerbarhet zebrafiskembryon efter småmolekylära föreningar jämfört med matning eller injektion av gnagare 25, de två presenterade modeller har även fördelar i termer av high-throughput screening av potentiella nya anti-invasion / metastas droger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Studier av TGF-β familjemedlemmar stöds av Cancer Genomics Center Nederländerna. Sijia Liu och Jiang Ren stöds av Kina stipendium rådet för 4 års studier vid universitetet i Leiden. Vi tackar Dr Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) för cellinjerna MCF10A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
- Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).
- Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).
- Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).
- Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, Suppl 1. 62-87 (2003).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).
- He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
