Summary
Burada, invaziv davranış araştırmak ve sırasıyla insan meme kanseri hücrelerinin içeri geçiş ve ekstravazasyondur potansiyelini değerlendirmek için, iki farklı enjeksiyon yerlerini, yani perivitelline alan ve Cuvier ait kanal kullanılarak ksenogreft Zebra balığı modellerini açıklar.
Abstract
Birçok durumda, kanser hastaları değil, çünkü metastaz, birincil tümörün ölme. Çok sayıda kemirgen modelleri, in vivo kanser metastazı araştırmak için kullanılabilir olsa da, diğer etkili, güvenilir ve düşük maliyetli bir model hızlı bir şekilde (epi) genetik değişiklikler veya farmakolojik bileşiklerin potansiyel etkilerini erişmek için ihtiyaç vardır. Bunun gibi, biz göstermek ve bu hedefi destekleyecek zebra balığı embriyolarının enjekte insan meme kanseri hücreleri kullanılarak ksenogreft modellerinde fizibilitesini açıklar. Mikroskop altında, floresan proteinleri veya kimyasal olarak etiketli insan meme kanseri hücreleri transgenik zebra balığı embriyolarının transplante edilir, Tg (fli: EGFP), 48 saat sonra, döllenme perivitelline boşluk veya Cuvier (DOC) kanalında. Kısa bir süre sonra, canlı balık vücudunda kanser hücresi invazyonu, yayılması ve metastaz zamansal-mekansal işlem bir floresan mikroskop altında görüntülenmiştir. Yani farklı enjeksiyon yerlerini kullanarak modelleri, başınaivitelline boşluk veya Doküman erken evre (içeri geçiş aşaması) ve geç evre olayları çok aşamalı metastatik kaskad (ekstravazasyon aşaması) yansıtan birbirine tamamlayıcıdır. Ayrıca, tümör çevresi ve tümör anjiyogenez perivitelline bir mekan içine enjekte ile gözlenebilir. Bütün deneysel dönem artık 8 günden daha olduğunu. Bu iki model, genetik ve farmakolojik manipülasyonlara yanıt olarak kanser metastazı hızla değerlendirilmesini sağlayan hücre etiketleme, mikro nakli ve fluoresans görüntü teknikleri birleştirir.
Introduction
Klinikte Aşikar kanser metastazı "metastatik kaskad" olarak bilinen karmaşık ve çok adımlı olaylar serisini içerir. Kaskad yoğun gözden geçirilmiş ve ardışık adımlarla içine disseke edilebilir: lokal invazyon, intravazasyonuna, yayılması, tutuklama, damar genişletme ve sömürgeleştirme 1, 2. Kanser metastazı patogenezinde ve in vivo potansiyel tedavi stratejilerinin geliştirilmesi daha iyi anlaşılması kanser hücresi yayılmasının sağlam konak modellerini gerektirir. Kemirgen modelleri iyi bilinmekte ve yaygın olarak metastaz 3 değerlendirmek için kullanılır, fakat bu yaklaşım, düşük verimlilik ve etik sınırlamaları vardır ve belirli bir manipülasyon metastatik fenotipi etkileyebilecek olup olmadığını belirlemek için, bir ön planda model olarak yüksek maliyetlidir. Diğer etkili, güvenilir ve düşük maliyetli bir model hızlı bir şekilde (epi) genetik değişiklikler veya Pharmacolog potansiyel etkilerini erişmek için gerekenik bileşimleri. Onların yüksek genetik insanlara homoloji ve onların embriyolar zebrabalıkları (Danio rerio) şeffaflığı önemli bir omurgalı modeli olarak ortaya çıkmıştır ve gittikçe gelişimsel süreçleri mikrop-konak etkileşimleri, insan hastalıkları, ilaç tarama, vb çalışmalarına uygulanıyor . 4. Zebrabalıkları kurulan kanser metastazı modelleri kemirgen modellerinde 5, 6 eksiklikleri bir cevap verebilir.
Spontan neoplazi güçlükle vahşi zebrabalıkları 7'de görüldüğü halde, zebrafish istenen kanserini tetiklediği birçok sürüncemeli teknikler vardır. Karsinojen indüklenen gen mutasyonu veya sinyal yolunun aktivasyonu histolojik ve moleküler modeli karsinogenez, zebra balığı 7, 8, 9, insan hastalığı taklit edebilir. tak byonkogen veya tümör bastırma genetik manipülasyonlar ileri çeşitli olanaklar ing ve ters (transjenik) zebra balığı, kanser gelişimi ve kuvvetli 6, 10 potansiyel çalışmaları sağlamıştır. Zebrabalıkları indüklenen kanser modelleri sindirim, üreme, kan, sinir sistemi ve 6 epitel dahil geniş bir yelpazede kapsar.
Kanser araştırmalarında zebrabalıkları kullanımı nedeniyle bu organizmada insan tümör hücre ksenogreft modellerinde kurulmasına son zamanlarda genişledi. Bu, ilk başarılı 2005 11 Blastula aşamasında zebra balığı embriyolarının engrafted edildi insan metastatik melanom hücreleri ile bildirilmiştir. Birkaç bağımsız laboratuarlar çeşitli siteler ve gelişim aşamalarında zebrafish içine memeli kanser hücresi hatlarının çok çeşitli tanıtarak bu öncü çalışmanın fizibilite valide var 5 </ Sup>. Örneğin, blastodisc ve Blastula aşamasının blastosist yakınındaki enjeksiyonu; 5-günlük embriyolar yolk kesesi, perivitelline alan, Cuvier'in (DOC) kanalı, ve 6-h arka ana damar içine enjeksiyonlar; 30 günlük bir bağışıklık larvalarının periton boşluğuna enjeksiyonu, 12 5 gerçekleştirilmiştir. Buna ek olarak, allojenik tümör nakilleri de zebrabalıkları 12, 13 bildirilmiştir. ksenogreftlerı kullanmanın büyük avantajlarından biri nakledilmiş kanser hücreleri kolayca floresan etiketli ve normal hücrelerden ayırt edilebilir olmasıdır. Bu nedenle, microtumor oluşumu 14, hücre istilası ve metastaz 15, 16, 17, tümör-indüklü anjiyogenezin 15, 1 dinamik davranışları ile ilgili araştırmalar8 ve kanser hücreleri ve ev sahibi arasındaki etkileşimler transgenik zebrabalıkları hatları 5 ürünler özellikle kullanım sırasında, 17 açık bir şekilde canlı balık vücutta görselleştirilebilir faktörleri.
Doktor enjeksiyonlar 16 vasıtasıyla zebra balığı embriyolar: metastaz değerlendirmek için zebra balığı ksenogreft modellerinde yüksek potansiyel esinlenerek, Tg (EGFP çekildiğinde) arasında tailfin alanında farklı meme kanseri hücre çizgilerinin transvasküler ekstravazasyon özellikleri göstermiştir. Dönüştürücü büyüme faktörü-P (TGF-β) 16 ve kemik morfojenik protein transforme rolü (BMP), pro- / anti göğüs kanseri hücre istilası ve metastazda 19 sinyal yolları da bu modelde incelenmiştir. Ayrıca, biz de perivitelline uzay enjeksiyonları ile ksenograft zebrabalıkları modeller kullanılarak tedavüle çeşitli meme kanseri hücre çizgilerinin intravazasyon yeteneğini değinmeyecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Transgenik floresan zebrabalıkları Tg (fli: EGFP) kullanan tüm araştırmalar EGFP'yi etti gerginlik, (EGFP) Uluslar arası kurallara göre gerçekleştirilmiştir, konut ve deneyler de dahil olmak üzere, damar sistemini 20 -etiketli ve yerel Kurumsal Komitesi tarafından onaylandı Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi Hayvan Refahı (Dier Ethische Commissie (DEC) için.
NOT: Embriyo toplanması (Şekil 1A), mikroenjeksiyon (Şekil 1B), tarama (Şekil 1C) ve analizi (Şekil 1D): Şekil 1 'de özetlendiği üzere, protokol kabaca dört adımda ayrılmıştır.
1. Enjeksiyon iğneler hazırlamak
- borosilikat cam mikrokapilerler ile enjeksiyon iğneleri hazırlayın. aşağıdaki ayarlarla bir mikropipet çektirmesi cihazı içine mikrokapiller koyun: hava basıncı, 500; Isı, 650; , 100 çekme; hız, 200; zaman,bunlar, enjeksiyon için kullanılana kadar 40. Bir iğne tutucu plaka enjeksiyon iğneleri tutun.
2. Enjeksiyon için Floresan, Genetiği Etiketli Meme Kanseri Hücreleri hazırlayın
- L-glutamin,% 10 fetal sığır serumu ve 1 içeren DMEM yüksek glikoz ortamında, 37 ° C'de kültür insan göğüs kanseri MDA-MB-231 hücreleri: 100 penisilin-streptomisin (LTR yükseltici) durumunda.
- Kültür,% 5 at serumu, 20 ng / ml EGF, 10 mg / ml L-glutamin içeren DMEM / F12 ortamında 37 ° C 'de, meme epitelyal hücre hatları, MCF10A (M-1) ve MCF10A-Ras (M2), insülin, 100 ng / ml, kolera enterotoksin, 0.5 mg / mL, hidrokortizon, ve 1: 100 pen-strep.
- Ko-transfekte HEK293T hücrelerine PLV-mCherry, pCMV-VSVG 21, pMDLg-RRE (gag / pol) 22 ve pRSV-REV 22 plazmid ile MCherry lentivirüs üretir. Hasat hücre süpernatanları -80 ° C'de transfeksiyon ve mağaza 48 saat sonra.
- ben5 ng / ml polibren varlığında normal kültür ortamı ile 1: nfect lentiviral süpernatanları ile 24 saat boyunca% 30 izdiham, MDA-MB-231, M1, M2 hücreleri 1 seyreltilmiştir.
- kararlı MCherry-ifade eden hücre çizgileri elde edilene kadar, izole edilmiş hücre klonlarının aşırı büyümesini sağlayan bir 96 oyuklu bir plaka, hücrelerin seyreltilmesiyle tek hücre klonları seçin.
- Enjeksiyon için hücre kültürü, bir T75 şişesi. % 0.5 tripsin-EDTA, tedaviden% 80 konflüense hücreleri hasat. 1x PBS 2-3 kez hücreleri yıkayın.
- PBS yaklaşık 200 mcL hücrelerin yeniden askıya. enjeksiyondan önce en az 5 saat boyunca bunları 4 ° C'de saklayın.
3. Enjeksiyonluk balığı Embriyolar hazırlayın
- Zebra balığı üreyen ayarlayın ve Rosen ve ark önceki jove makalesinde de gösterildiği gibi, embriyolar toplamak. 23.
- döllenmemiş ve anormal embriyolar kaldırarak 0-4 hpf olan embriyolar seçin. Petri dis embriyolar tutunYumurta, su (60 ug / ml, deniz tuzlan; ~ 60 embriyo / çanak) tam saat ve 28 ° C'de inkübe edin.
- 48 hpf ince cımbız ile embriyolar Dechorionate.
- 40 ug / ml tricaine (3-aminobenzoik asit) aşağı yukarı 2 dakika enjeksiyondan önce, ancak enjeksiyon için en fazla 2 den saat önce yumurta su ihtiva eden aktarılması embriyolar anestezisi.
Not: Tricaine stok çözeltisi (4 mg / ml, 100x), 7.4, pH değeri ile, iki kez damıtılmış suyun 97.9 mL 1 M Tris-baz (pH 9) 2.1 mL tricaine tozu 400 mg gibi hazırlanır. -20 ° C dondurucuda muhafaza edilmelidir.
Perivitelline Uzaya 4. enjekte İnsan Göğüs Kanseri Hücreleri
- bir enjeksiyon iğnesinin hücre süspansiyonu yükleme 15 uL. mikromanipülatör üzerine iğne monte edin ve 5-10 um bir uç açma çapı elde etmek için ince cımbız ile iğne ucu kopar.
- mikroenjeksiyon gerçekleştirmek için bir pnömatik picopump ve manipülatör kullanın. Adjust picopump 400 hücrelerini her zaman enjekte etmek. Enjeksiyondan önce,% 1 agaroz içeren bir Petri kutusu üst hücreleri enjekte ederek el ile hücre sayısını sayar.
- 10 embriyo her sefer hat kadar anestezi embriyolar, düz,% 1 agaroz enjekte plaka üzerinde (2-3 gün sonra döllenme (dpf)).
- Iğne (yani, çapraz) sokulması için tercih edilen bir pozisyonda embriyolar yerleştirmek için enjeksiyonlar sırasında elle enjeksiyon levhasını.
- Enjeksiyon bölgesinde iğne ucu Noktaya ve yavaşça yolk kesesi ve zebra balığı embriyo (Şekil 2A) periderm arasındaki perivitelline boşluk içine iğne ucu yerleştirin.
- yaklaşık 400 MCherry-etiketli tümör hücreleri enjekte edilir. yolk kesesi sarısı kesesinin içine implantasyonu önlemek için patlamış olmadığından emin olun.
5. Doc içine İnsan Göğüs Kanseri Hücreleri enjekte
- i tarif edildiği gibi bir iğne ve zebra balığı embriyolar hazırlanması n, protokol, 1, 2, ve 3. adımı.
- Doküman embriyonun sırt tarafında yaklaşılabilir böylece 45 ° iğne açı kullanın.
- Doktor (Şekil 3A) başlangıç noktası haline iğne, sadece kanal yolk kesesi üzerinden genişletilmesi başladığı dorsal ve yaklaşık 400 hücre enjekte yerleştirin; kanal içinde birim darbe yolk kesesi hemen sonra genleştiğinde enjeksiyon doğrudur.
Not: bazı ardışık enjeksiyonlar iğne ayıklanması olmadan gerçekleştirilebilir. - Yumurta suya enjekte Zebra balığı embriyolar aktarın.
Not: olarak önemli farklılıklar tek zebra balığı embriyolar arasında bulunur ve enjeksiyon oluşabilir sonra embriyo ölümü gibi, (100) etrafında zebra balığı embriyolarının nispeten büyük, kanser hücreleri enjekte edilmelidir. - balık ve memeli hücreleri için en uygun sıcaklık gereksinimlerini karşılamak için 33 ° C'de zebra balığı embriyolar koruyun.
- Perivitelline alanı enjeksiyon için 2 saat sonra enjeksiyon (HPI) (Şekil 2), flöresanlı bir stereomikroskop altında her bir balık ekran veya Doküman enjeksiyon (Şekil 2) için 2-24 hpi embriyoların hepsi enjekte edilir sağlamak için tümör hücrelerinin benzer sayısı. Bu tür yırtılmalar (Şekil 2B) ya da yumurta sarısının tekrar enjeksiyonları (Şekil 3B) enjeksiyon hataları, embriyo çıkarın ve enjekte aşağıdaki hücreleri (Şekil 2C ve 3B) veya (Şekil 2B ve 3B) eşik ile embriyolar ortaya çıkarmak. kültürde yaklaşık 400 hücrelerle sadece embriyolar tutun.
- Hücreler zaten dolaşımda hücrelerle embriyo kaldırarak enjeksiyon işlemi sırasında tedavüle doğrudan tanıtıldı ihtimalini ekarte etti. Ayrıca, Doc kütleli bir bir hücre (Şekil 2D ile herhangi bir embriyo kaldırmak
7. Görüntü ve Metastatik Süreci Analiz
- Geniş ucu Pasteur pipeti ile bir kaç anestezi embriyolar toplamak ve bir polistiren çanak cam alt aktarın.
- fazla suyu çıkarmak ve yumurta suyun sınırlı bir miktarda tutun. Bir saç döngü aracı ile pozisyona embriyo işleyin ve camın üstüne bir kapak yerleştirin.
- Su daldırma ya da uzun mesafeli kuru amaçları ile kombinasyon halinde bir ters konfokal mikroskop kullanarak. ilgi bölgesi mümkün olduğunca objektif olabildiğince yakın olacak şekilde embriyo yerleştirin.
- nedeniyle sıvı buharlaşma ölüm riskini azaltmak için anestezi hemen sonra görüntüleme gerçekleştirin.
- embriyo üzerinde aynı konumda EGFP-etiketli damar ve MCherry etiketli tümör hücrelerinden yakalama sinyalleri birlikte kaydedilmesi, iki görüntüleme birleştirme kanalını kan damarlarının hücreleri enjekte.
- Her Zebra balığı embriyo için, görüntülerin iki farklı setleri toplamakKafa bölgesi ile kuyruk bölgesinden.
- yaygın hücre sayısını ölçmek.
- Perivitelline alan enjeksiyonlar için, ön ve arka bölgeleri 4, 15 ile embriyonik balık gövdesine doğru hücre kütlesinden yaygın olan her bir balık hücrelerin sayısını; bölgeler yüzme kesesi dorsal üstüne, cepheden kalp boşluğuna sınırları dışındadır ve ürogenital açılış ötesinde kaudale.
- Doküman enjeksiyon için, tek tek dolaşım (MDA-MB-231), ile ilgili tailfin kollajen liflerini işgal hücreler veya kaudal hematopoetik doku (CHT) içinde hücrelerin birlikte (M2) tarafından oluşturulan küme sayısının sayısını her 19 zebra balığı.
- konfokal mikroskopi kullanılarak daha ayrıntılı olarak invazyonu ve metastazı Çalışma (tavsiye).
- Görüntünün tamamı düşük büyütme (4X objektif) kullanınVücut tümör hücre yayılması modelinin bir genel bakış için ve.
Not: Daha yüksek büyütme (20X ve 40X kazanım) intra ve peri-tümör anjiogenezini ve embriyo gövde dissemine hücrelerinin tam yerleşimini incelemek için uygundur. - kırmızı flüoresans ile işaretli implante tümör hücrelerinin taramak için zebra balığı embriyo damar sistemini ve bir 543 nm lazer tarama 488 nm lazer kullanır. Sekiz ila on adımda her embriyoyu tarayarak yüksek kalitede görüntü elde etmek. Tarama ve her adım altı kez ortalama.
- Görüntünün tamamı düşük büyütme (4X objektif) kullanınVücut tümör hücre yayılması modelinin bir genel bakış için ve.
- daha da deneyler için gerekli olup olmadığını dikkatlice yumurta suya geri embriyo yerleştirin.
8. Post Hoc Analizi Ardından Varyans (ANOVA) tek yönlü Analizi İstatistiki Analiz Gerçekleştirmek
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir perivitelline alanı enjeksiyonu ile embriyonik ksenograft zebra balığı modelinde, balık vücutta etiketli kanser hücrelerinin kan yoluyla yayılması etkin göç olarak kabul edilir. Bu işlem, tespit edilir ve yukarıdaki yöntemlerde tarif edildiği gibi, bir floresan mikroskobu altında ölçülebilir. Bu ksenograft modeli göstermek için, potansiyel (olmadan ya da C) bilinen invazyon / metastaz, HRAS transforme premalign in vitro ve iyi huylu, normal meme epitel hücreleri dahil olmak üzere, M1 in vivo fare deneylerinde, ya uygun farklı göğüs kanseri hücre çizgilerinin yayma işlemini takiben M2 hücreleri ve yüksek düzeyde metastatik, MDA-MB-231 hücreleri, ileriye 1 gün sonra enjeksiyon (dpi). Yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi görüntüsü, MDA-MB-231 hücreleri (kırmızı) perivitelline alan düzensiz sınırları ile birlikte, saldırgan bir fenotip sergilediğini göstermiştir. Yalancı ayak benzeri çıkıntılar ve invazif kapaklar aynı zamanda sık sık mevcuttu (Şekil 4A, sol). Birkaç hücreler (sağda, Şekil 4A) gibi erken 1 dpi olarak kan dolaşımı içine dissemine. 2 dpi de, açık bir yayma (sağ, Şekil 4A) balık uzak parça gözlemlendi. Yaygın hücre sayısı 3 dpi (Şekil 4A ve 4D) ile daha da artmıştır. M2 hücreleri zebrabalıkları aşılandığında aksine, bunlar 2 dpi (Şekil 4B) işleminden sonra balık vücutta mütevazı yayılmasını sergilemiştir. Süresi (Şekil 4F) geçirilir sonra aynı zamanda artan yayılması gösterdi. Şekil 4C ve 4G gösterildiği gibi, M1 hücreler nadiren zebra balığı dolaşıma yayılmış ve perivitelline alan içinde daha etkin bir yerel taşıma gözlem süresi boyunca sık değildi. M1 hücre kütlesi neredeyse orijinal Enjeksiyon yerinde gözaltına alındı. Balık vücutta> 5 hücreleri olarak pozitif yayılmasını veya metastaz tanımlayan varsap = "xref"> 4, MDA-MB-231 ve M2 hücre metastazı 3 dpi (Şekil 4G), sırasıyla% 92 ve balık% 57, içerisinde gözlenmiştir. Buna karşılık, hiçbir olumlu yayma M1 hücreleri ile gözlenmiştir. Bu nedenle, insan kanser hücre dizileri bu zebra balığı modeli doğru Farelerde farklı hücrelerin metastaz potansiyeli göreli düzeyini yansıtır. Embriyonik zebrabalıkları subintestinal pleksustan filizlenmiş ve MDA-MB-231 ya da M2 hücre kütlesi de inkübasyon (Şekil 4A ve 4B, 3 gün, ardından tümör hücrelerinin perivitelline alanı enjeksiyonundan sonra mevcut olan nüfuz neovaskülarizasyon (yeşil), sol ). Yayılmasına engelli ile uyumlu olarak, sadece hafif neovaskülarizasyon M1 hücre implantasyonu (Şekil 4C) üzerine tespit edilmiştir.
MCherry etiketli MDA-MB-231 hücreleri ile embriyonik ksenograft Zebra balığı modeli ve Doc enjeksiyonu, laboratuvar olarakzebrabalıkları tailfin içinde ELED kanser hücrelerinin aktif ekstravazasyon temsil olarak kabul edilir. MCherry etiketli MDA-MB-231 hücreleri 2 dpf'e enjekte edildi. 3 dpi hücreler kolajen ile zenginleştirilmiştir tailfin, gemilerin dışarı göç başladı. Tek, MDA-MB-231 hücreleri, uzak tailfin (Şekil 5A), bağımsız bir şekilde, damarlardan, tek tek geçirilir. 6 dpi de, istila tailfin dokuya göç eden hücrelerin sayısının sayılmasıyla nicelendirilebilir. MCherry etiketli M2 hücre Doküman enjeksiyon modeline, enjeksiyon da 2 dpf gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bir kümelenmiş fenotip aktif ekstravazasyon işlemi sırasında gözlenmemiştir. 1 dpi anda, M2 hücreleri zebrabalıkları CHT içine damarlarından dışarı göç etmeye başladı. 2 dpi olarak, geçirilmiş M2 hücreleri CHT (Şekil 5B) kaplar arasında bir küme oluşturmak için başladı. CHT bölgesinde M2 invaziv hücre kümesi sayısının nicelleştirilmesi ifa edilebilir6 dpi.
Şekil 1: embriyonik zebrabalıkları göğüs kanseri hücrelerinin invaziv davranışı incelemek için ana aşamaları göstermektedir. Gece boyunca ebeveyn zebrafish geçtikten sonra, (A), Tg (fli1: EGFP) zebra balığı embriyolar, ertesi sabah toplandı ve 28 ° C 'de muhafaza edilmiştir. (B), embriyolar stereomikroskop 48 saat sonra fertilizasyon (HPF) altında ince cımbız ile dechorionated edildi. etiketli göğüs kanseri hücreleri toplandı ve PBS az miktarda yeniden süspanse edildi. İyi hazırlandıktan sonra, süspansiyon hücreleri bir iğne içine yüklenmiştir. Yaklaşık 400 hücre bir stereo mikroskop altında perivitelline alanı Cuvier'in (DOC) kanal içine enjekte edilmiştir. Enjekte edilen embriyoların 33 ° C'de muhafaza edilmiştir. (C) 2 saat sonra, enjeksiyon (HPI), embriyolar ca tabi tutulduflöresanlı bir stereomikroskop altında reful taraması. Embriyolar 3 veya 6 gün süre ile 33 ° C'de muhafaza edilmiştir. aralığında, embriyolar tasarlanmış işlemine tabi tutulmuştur. Doküman enjeksiyonla perivitelline alan enjeksiyon ya da işgali ile (D) Kanser hücrelerinin yayılması, tespit sayılır ve konfokal mikroskopi 3 veya 6 gün sonra enjeksiyon (dpi) ile görüntülendi. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: Perivitelline uzay enjeksiyon yeri ve yaygın hatalar. (A), yaklaşık olarak 400 MCherry etiketli hücreler (MDA-MB-231) perivitelline boşluğa enjekte edildi. enjeksiyona ait aydınlık (en üst), yeşil damar (üst orta) ve kırmızı hücre kütlesi (alt orta)ed zebra balığı embriyolar konfokal mikroskop ile yakalandı. Üç kanal birleştirilmiş görüntü (en alt) embriyo hücre kütlesinin stereo konumunu gösterir. (B) hücreleri uygun perivitelline alanı hedef yoktu. yolk kesesi kırılmaya neden olmuştur. (C), eşik (çok az 400) altına Enjekte edilen hücreler. (D) Enjekte edilen hücreler eşik (çok fazla 400). Hücre kütlesi, geniş bir kan akışı olan Cuvier arasında kanal, çok yakındı. Ölçek çubuğu 50 um =. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: Cuvier (Doc) enjeksiyon kanalının genel bir bakış. Sonrası döllenme 2. günde Doküman enjeksiyonu (A) şematik (dzebra balığı embriyolar göğüs kanseri hücreleri ile pf). ok Doc gösterir. (B), yaklaşık 400 göğüs kanseri hücreleri pozitif enjeksiyonlar örnekleri; sarısı misinjection dahil, olumsuz enjeksiyonlar; ve hücrelerin, yanlış bir sayı 4 hpi enjekte edilmektedir. Oklar ve çevreler enjekte hücreleri gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4: Çeşitli göğüs hücre çizgileri arasında yayma kabiliyeti karşılaştırılması. Yaklaşık 400 MCherry etiketli, MDA-MB-231, MCF10Aras (M2), ya da MCF10A (M-1) hücreleri, zebra balığı embriyolar 48 HPF perivitelline boşluğa enjekte edildi. Enjekte edilen embriyoların 3 gün boyunca izlenmiştir. (A, B, ve C) Yüksek rezonansMDA-MB-231 (A), M2 (B) 'yi temsil göçü ve yayılması işlemini gösteren Devriminin mikrografları, ve tek tek embriyonik organları 1, 2 M1 (C) hücreleri ve enjeksiyon sonrası (dpi) 3 gün. Sol, perivitelline alanı (kırmızı) ve tümör çevresindeki ve tümör içi damar sistemine (yeşil) hücre göçü. Sarı sinyalleri mikro damarların ve hücrelerin üst üste göstermektedir. Orta, embriyonun bütün görüntüsü. Embriyonun posterior dissemine hücrelerin Sağ, görselleştirme. Sarı ok başları tek dissemine hücrelerini gösterir. Ölçek çubuğu 50 um =. (D, E ve F) 1, 2, ve 3 dpi'de her embriyonik gövde dissemine hücre sayısının belirlenmesi. Sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. post-hoc analizi ile takip varyans analizi (ANOVA) Tek yönlü analizi sonuçları gösterilmektedir. P <0.05 (istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir * P <0.01 <0.05; ** 0.001 <P <0.01; *** P <.001. (G) ile 1, 2 ve 3 dpi embriyonik organlarında, MDA-MB-231, M2 ve M1 hücreleri için intravasation sıklığının karşılaştırılması. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 5: Cuvier enjeksiyon kanalı ile zebrabalıkları MDA-MB-231 ve M2 hücre metastaz Farklı davranışlar. (A) 'zebrabalıkları Örnek konfokal görüntüleri zebrabalıkları, MDA-MB-231 hücreleri tek hücre migrasyon davranışı göstermek için 3, 4, ve 5 dpi'de izledi. Oklar tailfins içine damarlarının dışarı göç invaziv MDA-MB-231 hücreleri gösterir. Ölçek çubuğu sol sütunda = 200 um, sağ sütunda 50 um. (B) Örnekzebrabalıkları eş odaklı görüntü zebrabalıkları M2 hücrelerinin hücre kümesi migrasyon davranışı göstermek için, 1, 2, ve 3 dpi'de izledi. Oklar kaudal hematopoetik doku (CHT) gemilerin dışına göç ve kaplar arasındaki bir küme meydana invaziv M2 hücreleri gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Perivitelline alanı ve Doküman enjeksiyonları ile zebra balığı embriyolar: Burada, Tg (EGFP fli1), meme kanseri hücrelerinin invaziv davranışı incelemek için iki yöntem tarif. transgenik zebra balığı embriyolara kimyasal boya ya da floresan protein ile etiketlenmiş kanser hücreleri enjekte ederek, invazyon ve metastaz dinamik ve uzamsal özellikleri açık bir şekilde bir floresan mikroskobu altında tek hücre veya kümelenme seviyesinde gerçek zamanlı olarak izlenir. Bir çok durumda, zebra balığı metastaz hızlı ilerlemesi deney transplantasyondan sonra 1 hafta içinde gerçekleştirilebilir sağlar. Üstelik, güçlü istatistik balık büyük kohortlarda ile elde edilebilir.
metastatik kaskad erken ve geç olayların simüle sırasıyla perivitelline boşluk veya Doc, kanser hücreleri enjekte ederek değinmeyecek edilebilir. perivitelline alanı allo balık periderm yolk kesesi, arasında kalan alandırws bir canlı vücutta birincil sitelerden tek tümör hücrelerinin yayılmasını izlemek için. implantasyon sonrasında kanser hücreleri perivitelline alanı içinde yerel göç ve istila (kabul birincil site) geçmesi ve o zaman kan damarlarının içine intravasate ve dolaşım ile birlikte yaymak. Baş ve tailfin (kabul uzak hedef siteleri) ise kanser hücreleri dar kılcal yatak ve extravasate birikir. Bu nedenle, balık vücudunda uzak bölgelerde bulunan hücre sayısı metastatik yeteneğinin bir ölçüsüdür. Buna ek olarak, daha fazla damar dışına hücreler de Doküman enjeksiyon deneyi için de geçerlidir Daha sonraki zaman noktalarında gözlenebilir.
Doktor geniş bir kan akışı 24 ile büyütülmüş ortak ana damar. bir enjeksiyon sitesi dolaşım sistemi içine kanser hücrelerini tanıtır olarak Doğrudan Doc hedeflemesi. Uygulamada, meme kanseri hücrelerinin aracılığıyla embriyonik vücuda yayılmasıDoküman enjeksiyondan sonra hemen kan akışı. Hücreler daha sonra kaudal ven ve dorsal aorta de tutuklama. Ekstravazasyonu, yayılması ve mikrometastaz oluşumu 6 gün içinde ardışık olarak gözlenebilir. Daha önce, 16 bildirildiği gibi, metastatik, MDA-MB-231 hücreleri ve habis öncesi meme M2 hücrelerin farklı invaziv fenotipler sergiler. MDA-MB-231 hücreleri kollajen matriks zengini tailfin tek hücreli işgali uğrarlar. Bu nedenle, MDA-MB-231 hücrelerinin invazyonu potansiyeli damar dışına ve tailfin doku işgal hücre sayısının sayılması ile ölçülebilir. Bunun aksine, M2, hücreler farklı boyutlarda kümeler oluştururlar ve CHT kolektif işgali tabi tutulur. Bu protokolde kümelerinin sayısını sayarak M2 hücrelerinin invazyonu potansiyeli miktarının belirlenmesi zordur ve tercihen eş odaklı mikroskopi kullanılarak bir 3D görüntüsü alma ve kümelenmiş tümör hücrelerinin hacminin belirlenmesi ile gerçekleştirilir.
Kanser hücresi mikro teknik zorlukEnjeksiyon başarıyla perivitelline boşluk veya Doc hedefliyor. embriyolarının büyük sayılar mikroenjeksiyon yüksek nitelikli hasta gerekli kılar sıkıcı bir işlemdir. Enjekte enjekte edilen hücrelerin sayısı farklılıklar ve yumurta sarısı kesesinin içine hücrelerin sızıntı tek tek balık sonuçları varyasyonlara katkıda bulunan faktörler embriyonun gelişim aşaması içerir. Nadir olsa da, manipülasyon istemeden damar sistemini delemeyeceğine ve özellikle perivitelline uzay enjeksiyon halinde, doğrudan dolaşım sistemi içine hücreleri tanıtmak. başka varyasyonu azaltmak için ve analizlerin güvenilirliğini sağlamak için, mikroskobik inceleme süreci boyunca zaman noktalarında niteliksiz balık dışlamak için gereklidir. Buna ek olarak, ayar bilgisi dışında bir profesyonel tarafından analiz kör kuvvetle tarafsız kantifikasyonunu ulaşmak için önerilir.
Özetle, burada tanıtılan iki model ışık tutacakinvazif prosedürler olmaksızın, in vivo olarak, hücre istilası ve metastaz süreçlerinin görselleştirme. biz sadece metastatik potansiyeli ile ilgili iki model meme kanseri hücrelerini okudu rağmen, diğer kanser türlerine tahmin edilebilir. Ayrıca, model mekanizmaları ve (epi) genetik manipülasyonu kullanarak kanser hücresi metastazının kontrol yeni moleküler hedeflerin belirlenmesi daha geniş uygulamalara sahip olabilir. Nedeniyle besleme veya kemirgenler 25 enjeksiyonuna kıyasla küçük moleküllü bileşikler ile zebra balığı embriyoların yüksek geçirgenliğiyle, sunulan iki model aynı zamanda, potansiyel anti-invazyon / metastaz ilaçların yüksek verimli tarama yönünden avantajlara sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
TGF-β aile üyeleri üzerinde çalışmalar Kanser Genomik Merkezi Hollanda tarafından desteklenmektedir. Sijia Liu ve Jiang Ren Leiden Üniversitesi'nde çalışmanın 4 yıldır Çin Burs Konseyi tarafından desteklenmektedir. Biz MCF10A hücre hatları için Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Kanser Enstitüsü, Detroit, MI, ABD) teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
- Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).
- Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).
- Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).
- Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, Suppl 1. 62-87 (2003).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).
- He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
