Summary
Een procedure voor het maken van een gezichtspreparatie van de muizencarotisarterie en aorta wordt beschreven. Dergelijke preparaten, wanneer immunofluorescent gekleurd met specifieke antilichamen, ons in staat stellen om lokalisatie van eiwitten en identificatie van celtypen in de gehele vaatwand door confocale microscopie te bestuderen.
Abstract
Afdelingen van paraffine ingebedde weefsels worden routinematig gebruikt voor het bestuderen van weefselhistologie en histopathologie. Het is echter moeilijk om te bepalen wat de driedimensionale weefselmorfologie uit dergelijke secties is. Daarnaast kunnen de onderzochte secties van de weefsels niet het gebied bevatten in het weefsel dat nodig is voor het lopende onderzoek. Deze laatste beperking belemmert histopathologische studies van bloedvaten, aangezien vasculaire laesies op een gefocuste manier ontwikkelen. Dit vereist een methode waarmee we een breed gebied van de bloedvatmuur kunnen onderzoeken, van het oppervlak naar de diepe gebieden. Een volledige voorbereiding van de bloedvaten voldoet aan deze eis. In dit artikel zullen we aantonen hoe u een gezichtspreparatie van de muis aorta en halsslagader maakt en immunofluorescente ze voor confocale microscopie en andere soorten fluorescentie gebaseerde beeldvorming kunt vinken.
Introduction
Voor histopathologische studies door middel van lichtmicroscopie worden drie-dimensionale stukjes biologische weefsels routinematig verwerkt voor paraffine-inbedding, gevolgd door doorsneden en kleuring. Een weefselmonster die paraffine-ingebed is, kan in alle drie de afmetingen meerdere millimeter zijn. Voor de lichtmicroscopie moet het eerst eerst worden gesneden zodat het licht door kan gaan en vervolgens wordt gekleurd zodat het dunne gedeelte voldoende contrast biedt voor afbeelden. Omdat gesneden specimens meestal 5-10 μm dik zijn, ziet men slechts een kleine deel van het hele monster in twee dimensies tegelijk. Het is mogelijk om opeenvolgende secties te verzamelen en, na het afbeelden van elke sectie afzonderlijk, computerondersteunde reconstructie van de 3D-beelden uit te voeren, maar dit is inderdaad een vervelende baan. Histopathologie van bloedvaten, vooral voor het bestuderen van de pathogenese van atherosclerose, biedt unieke problemen. Atherosclerose is een geconcentreerde ziekte die zich ontwikkeltLokaal in gebieden waar verstoorde bloedstroom optreedt. Bovendien wordt de ziekte geïnitieerd binnen de intima, een dun weefsel dat bestaat uit een monolaag van endotheelcellen en extracellulaire matrix, van grote slagaders. Om deze redenen is het een uitdaging om vroege letsels te lokaliseren en te bestuderen met behulp van doorsnede bloedvaten, omdat men de lesion gemakkelijk kan missen. Zelfs als een sectie een ziek gebied omvat, ziet men slechts een 5-10 μm portie dat endotheelcellen en andere vaatwandcellen bevat in de media en adventitia.
Met complete voorbereiding van een gezicht (uitgesproken en fäs) kunnen we een breed oppervlak van het bloedvatoppervlak onderzoeken, zoals de hele aorta van de aortische wortel helemaal naar beneden naar de gewone hartslagaders. Door gebruik te maken van een dergelijk specimen gebleekt met specifieke antilichamen en andere specifieke probes, kan men de locatie van letsels bepalen en ook waar verschillende moleculaire gebeurtenissen zich voordoen in endotheelcellen in combinatie met wiDe atherogenese zoals veranderingen in de expressie, lokalisatie en posttranslational modificaties van eiwitten. Naast het bestuderen van atherogenese wordt de endotheliale celvorm waargenomen in een gezichtspreparatie gebruikt als een indicator van het regionale tijdgemiddelde bloedstroompatroon. Dergelijke gegevens zijn belangrijk voor het bestuderen van mechanische signalering van endotheelcellen in situ. Voor dit doel zijn routine histologische dwarsdoorsnede bloedvaten niet bruikbaar. Zo is het voor vasculaire geneeskunde en biologie bijzonder belangrijk om een techniek te verkrijgen voor het maken van een gezichtspreparatie van bloedvaten waarmee men een breed gebied van het vaatoppervlak evenals de diepere ondergronds van het vat kan waarnemen.
Zoals door Jelev en Surchev 1 beoordeeld, hebben vasculaire biologen verschillende methoden ontwikkeld om de voering van bloedvaten en gezicht te waarnemen. Enkele ingenieuze methoden werden ontwikkeld in de jaren 1940 en 1950. Met behulp van deze methoden waren ze In staat zijn om de fundamentele organisatie van endotheelcellen die het inwendige oppervlak van de bloedvaten regelen te bestuderen. Vanwege de wijze waarop deze en-gezichtspreparaten worden voorbereid (de zogenaamde Hautchen methode 2 , 3 , 4 of afscheiding van het vaatoppervlak 5 ) en de manier waarop het monster werd gekleurd, was het niet altijd mogelijk om ononderbroken morfologische Informatie van het vaartuigoppervlak in de dieper gebieden van de bloedvatmuur. Voorbereiding van de volledige berg- en gezichtsbehandeling gecombineerd met immunofluorescentievervuiling liet ons toe om niet alleen de endotheliale celmorfologie en eiwituitdrukking en lokalisatie in deze cellen te bestuderen, maar ook dergelijke studies uit te breiden naar het subendotheliale gebied van de vatwand. Vroege studies met behulp van bloedvaten en gezichtspreparaten werden in de jaren '80 van 6 tot en met 19 gebleken immunoflures verschenen .F "> 7. Met de komst van laserscanning-confocale microscopie en recentere multiphoton-microscopie, kan men nu in-focusbeelden van de bloedvatwandstructuur verkrijgen in immunofluorescent gekleurde en gezichtsvatenmonsters, evenals het vaatnetwerk in levende dieren 8 , 9 , 10 , 11. Deze computergebaseerde beeldtechnieken creëren optische doorsnedebeelden in focus, en bij het opmaken van dergelijke beelden kan men gereconstrueerde 3D-beelden van de vaatwand en het vaatnetwerk in weefsels verkrijgen. Kan beelden genereren van een sectie die langs de Z-as van de gereconstrueerde afbeelding 12 , 13 is gemaakt .
In dit artikel zullen we een methode illustreren voor het voorbereiden van gezichtspreparaten van de muis aorta en de halsslagader voor immunofluorescente kleuring. En gezichtspreparatenKan worden gemaakt, zelfs nadat deze vaten experimenteel zijn gemanipuleerd. Bijvoorbeeld kan een carotis-arterie gedeeltelijk geligeerd worden en dan een een-gezichtsbereiding gemaakt na een dergelijke operatie. Om deze reden zullen we in dit artikel ook beschrijven hoe we een gedeeltelijke ligatie op de halsslagader doen. Vergeleken met het maken van soortgelijke preparaten van grotere dieren, zoals ratten, konijnen en mensen, zijn muisvaten klein van grootte en fragiel, waardoor er extra zorg nodig is om te behandelen tijdens chirurgische isolatie van vaten en ze voor te bereiden op antilichamen kleuring en microscopie. Omdat het meest gebruikte diermodel voor genetische modificatie de muis is, wordt het van groot belang dat veel onderzoekers muisvaten hanteren zonder ze te beschadigen. In dit manuscript beschrijven we hoe u de bloedvaten van de muis moet behandelen bij het maken van een gezichtspreparatie van de aorta en de hartslagader. Voor de demonstratie zullen we wildtype C57 / b6 muizen gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De protocollen voor de muizen gedeeltelijke halsslagaderatie en isolatie van de muis aorta en halsslagader voor gezicht immunostaining worden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IBT 2014-9231).
1. Linker Partieel Carotide Arterie Ligging
- Bereid de chirurgische ruimte door een 12 inch x 14 inch verwarmingsblok op de tafel te plaatsen en bedek het paneel en de tafelblad met een grote schone chirurgische drape. Stel de arm van de boomstand aan, zodat het stereomicroscoop zichtbaar is in het midden van het verwarmingspaneel.
- Zet het verwarmingspaneel op de tafel aan en stel de 3-instelknop in op het gemiddelde warmtepeil. Bij deze temperatuurinstelling zal het oppervlak van de chirurgische plank (zie 1.6.1) 38-40 ° C zijn.
- Plaats een schone kooi op een ander verwarmingskussen. Zet het verwarmingspaneel aan zoals hierboven aangegeven. Deze kooi wordt gebruikt voor herstel na de operatie (zie 1.16) en huisvesting.
- Weeg een muis. Het lichaamsgewicht is nodig om de juiste hoeveelheid analgesie te bepalen, die direct voor de operatie wordt toegediend.
- Plaats een muis in de inductiekamer.
- Zet de zuurstoftank en de verdovingsverstuiver in om de muis in de inductiekamer te verdoving. Behoud het isofluraan niveau bij 2%. Het duurt 3-5 minuten voordat de muis stilstaat.
- Terwijl de muis anestheertGemonteerd, plaats een kleinere steriele chirurgische draperie (24 inch x 24 inch) onder de stereomicroscoop om een chirurgisch oppervlak te creëren. Plaats dan een acrylchirurgisch bord (dat met 70% alcohol is gereinigd) op het gedrapeerde oppervlak. De chirurgische raad moet daarom op het verwarmingspaneel zijn, maar gescheiden door twee lagen chirurgische gordijnen.
- Wanneer de muis in de inductiekamer gaat verhuizen, overstappen de muis naar een pre-chirurgische voorbereidingsruimte en zet de neus in de neuskegel die verbonden is met de verdamper (2% isofluraan). Verwijder het haar rond het cervicale gebied met behulp van een elektrische trimmer of haarverwijderingslotion. We raden aan het verwijderen van lotion, omdat deze methode geen losse haarstukken produceert, die moeilijk uit het chirurgische gebied kunnen worden verwijderd.
- Met de neuskegel op zijn plaats, beweeg de muis naar het chirurgische bord.
- Tape de rechter en linker voorpoten naar de chirurgische raad. Tape aan beide achterpoten touwtDaar aan de rechterkant van de muis. Dit veroorzaakt een lichte rotatie van het muislichaam, zodat de linkerzijde van het nekgebied van de muis beter wordt geplaatst voor de operatie.
- Desinfecteer het snijgebied met 70% alcohol, chloorhexidine chirurgische scrub, en opnieuw met 70% alcohol. Bedek de muis met een gesteriliseerde chirurgische drape, behalve het cervicale snijgebied.
- Bevestig met de toon dat de muis volledig verdoofd is en analgesie (Caprofen 3-5 mg / kg) via intraperitoneale of subcutane injectie geeft.
- Onder de dissectiemicroscoop maakt u een ventrale middenlijn incisie rondom het baarmoederhalsgebied met behulp van een scalpel of iris schaar.
OPMERKING: we gebruiken een schaar omdat de werkafstand van de stereomicroscoop beperkt is, waardoor het moeilijk is om een scalpel te gebruiken. - Ontsteek de linker gemeenschappelijke halsslagader (LCCA) door opzij te drukken en de speekselklieren die de bloedvaten aan de linkerkant van denimal.
- Identificeer alle bloedvaten in het chirurgische veld ( Figuur 1 ). De LCCA bifurcates in de linker interne halsslagader (ICA) en de linker externe halsslagader (ECA). De oppervlakkige schildklierslagader (STA) komt voort uit de ECA aan de mediale kant. De oksipitale arterie (OA) komt meestal voort uit de ECA, maar bij sommige muizen komt het uit het ICA.
- Lig alle arterie takken behalve de OA met behulp van gesteriliseerde 6-0 zijden hechting. Om dit te bereiken, maak de volgende twee ligaties.
- Verwijder het bindweefsel voor en onder de linker interne halsslagader (ICA) voorzichtig. Pak een stuk van precieze 6-0 zijden hechting (~ 2,5 cm) met tang en passeer het onder de slagader. Gebruik nog een paar tangjes, trek de hechting ongeveer 1/3 van de lengte en lig de slagader.
- Verwijder het bindweefsel rond de linker externe halsslagader (ECA) op dezelfde manier als hierboven beschreven en maak een ligatie proximaal aan de linker superieure thyroïD slagader (STA) ( Figuur 1 ). Wees voorzichtig om geen zenuwvezels te beschadigen die binnen het chirurgische veld lopen.
- Wanneer deze ligaties zijn gemaakt, ga de speekselklieren terug naar de oorspronkelijke positie en hydrateer het chirurgische veld door 2-3 druppels steriele zoutoplossing te plaatsen. Sluit de huid met 6-0 gecoate vicryl suturen.
- Plaats na de operatie de muis in de voorverwarmde kooi (zie 1.2.1). De muis moet binnen 5 minuten wakker worden en beginnen rond te lopen. Zodra bevestigd dat de muis normaal gesproken optreedt, breng de kooi naar de dierenhuis.
- Let op de muis dagelijks voor de eerste 3 dagen van herstel. De muis kan worden gehouden zolang het experiment vereist onder de verschillende omstandigheden waarvoor het experimentele protocol vereist is. Een gezichtspreparaat kan op elk moment na de operatie worden gemaakt.
2. En Face Immunostaining Face
- Euthaniseer een muis met CO 2 door inademing overdosis.
- Tape de muis in een rugkant (buikzijde omhoog) positie op een dissectenbord.
- Ontsteek de buikholte door middel van een middelste snede met behulp van een iris schaar.
- Ontsteek de thoracale holte door de ribben lateraal in de sternum te snijden.
- Maak een nick in de vena cava of snijd een van de femorale slagaders voor het aftappen van bloed.
- Voeg een 26 G-naald in aan de zwaartekracht van de zwaartekracht (120 cm waterdruk) in de top van de linker ventrikel en vul het circulatiesysteem met zoutoplossing met heparine (40 U / mL) in. Ga door met de perfusie totdat de zout die uit de snede stroomt, wordt duidelijk.
- Schakel het perfusiesysteem van zoutoplossing over naar de fixatieoplossing die 4% paraformaldehyde bevat in PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) en vervolg nog 5 minuten meer perfusie.
- Oog de aorta en beide linker en rechter halsslagaders door middel van stompe scharen en tangjes, en plaats in een 50 ml conische buis die het fixatief op ijs bevat.
- Verplaats elk vaartuig afzonderlijk naar een putje van een 12-putjesplaat die 0,5 ml van een permeabiliserende oplossing (0,1% Triton X-100 in PBS) per put bevat. Permeabiliseer de bloedvaten gedurende 10 minuten met roeren bij kamertemperatuur (RT).
- Wassen kort met PBS.
- Om niet-specifieke antilichaambindingsplaatsen te blokkeren, incubatie bloedvaten in 10% normaal serum uit de diersoorten waarin de secundaire antilichamen zijn gemaakt, gedurende 30 minuten in TTBS (Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 2,5% Tween 20) Rocking bij RT.
- Incubeer vaten met de primaire antilichamen die geschikt zijn in TTBS met 10% normaal serum (zoals hierboven beschreven), gedurende de nacht, met een schommeling bij 4 ° C. Het niveauVerdunning moet worden bepaald voor elk antilichaam.
- Voer de volgende controle-kleuring uit.
- Incubeer vaten met TTBS in plaats van een primair antilichaam gevolgd door incubatie met een secundair antilichaam.
- Incubeer vaten met TTBS die niet-immuunsysteem (of voorimmuun) serum of Ig van hetzelfde dier (soorten) bevatten waarin primaire antilichamen zijn gemaakt, gevolgd door incubatie met een secundair antilichaam.
- Verwijder de incubatie met een secundair antilichaam. Deze controle-monsters moeten op dezelfde manier worden behandeld en tegelijkertijd wanneer het vlek met specifieke antilichamen wordt uitgevoerd.
- Was de bloedvaten 3 keer met TTBS gedurende 10 minuten elk met rocking bij RT.
- Incuberen met fluorescent gelabelde secundaire antilichamen die geschikt zijn in TTBS met 10% normaal serum (zoals hierboven beschreven) gedurende 1 uur bij roeren bij RT. Nucleaire kleuring met DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool) kan tegelijkertijd eenT in dit stadium door 1/5000 volumes van een DAPI voorraadoplossing toe te voegen die 5 mg / ml DAPI in H20 bevat.
- Was 10 keer met TTBS gedurende 10 minuten elk met rocking bij RT.
- Spoel kort in PBS.
- Plaats een druppel van het anti-vervagen reagens op een afdekglas (22 mm x 50 mm) en plaats een bloedvat op het afdekglas met het endotheel naar beneden gericht.
- Plaats een glijglas (22 mm x 75 mm) op het bloedvat terwijl er geen bubbels worden gevangen.
- Plaats de glijbaan op een schoon laboratoriumdoekje ( bijv. Kimwipe) en bedek de glijbaan met twee stukken laboratoriumafval. Plaats voorzichtig 3,5 kg gewicht ( bv. Gebruik een fles water op een dik boek.) Op de glijbaan voor maximaal 5 minuten om het monster van het bloedvaatje te platen.
- Verwijder het gewicht en veeg de overtollige oplossing van de deklaag af.
- Breng nagellak aan op de 4 hoeken van de deklaag, plaats de glijbanen in een glijbaan, bedek de zijde omhoog en blijf in het donker bij RT(Of 4 ° C) 's nachts. Dit proces fladder het weefsel verder en maakt het makkelijker om microscopie te maken bij hoge vergrotingen.
- Verzegel de deklaag volledig met nagellak.
- Voer de microscopie uit zodra de nagellak droog is.
- Sla indien nodig glijbanen op -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een typisch en gezicht immunofluorescentiebeeld van het endothelium is getoond in figuur 3 . Dit beeld toont een enkele optische sectie van een aorta van de muis die dichtbij de opening van een intercostale slagader (het grote donkere ei-vormige gebied) wordt geplaatst. De aorta was dubbelkleurig met anti-VE-cadherine (groen) en anti-VCAM-1 (vasculaire celadhesiemolecule-1) (rood). Elke endotheliale cel wordt geschetst met een groene lineaire kleuring bij de linker hechting. Vanwege de kleine ongelijkheden van het monster, zijn sommige adheren-kruispunten buiten deze optische sectie. Anti-VCAM-1-kleuring is sterker bij de opening van de intercostale slagader waar de verstoorde bloedstroom bekend is. Figuur 4 toont een gezichtvervulling van carotis-arteriën met anti-VE-cadherine (groen), anti-VCAM-1 (rood) en DAPI (paars). De linker halsslagader (LCA) werd gedeeltelijk geligeerd terwijl de rechter halsslagader (RCA) onaangetast was. De vaartuigen werden 1 dag na de Operatie en gekleurd. Opmerking verhoogde anti-VCAM-1 kleuring in het geligeerde vat. Exemplaren die immunofluorescentief zijn met verschillende antilichamen kunnen worden gebruikt om het expressieniveau van eiwitten van belang te onderzoeken, de mate van posttranslationele modificaties van doelwitproteïnen en natuurlijk het patroon van lokalisatie van verschillende eiwitten in endotheliale cellen en in andere cellen binnen de Bloedvatmuur 10 , 11 .
Figuur 1 : Gedetailleerde vaartuiganatomie in de muiscyclusgebied. Het vaatnetwerk voor en na dissectie wordt aan de linkerkant getoond. Alle slagaders worden geïdentificeerd in het diagram dat rechts wordt weergegeven. Zwarte lijnen geven ligaties aan. Schaal: 1 divisie = 1 mm._blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 2: Diagram dat laat zien hoe Carotide Arteries en Aorta worden gemaakt in En Face Preparations. Gestippelde lijnen langs de schipwand geven aan dat er snijdingen zijn om de vaten te openen. De gekleurde micrographs tonen werkelijke en gezichtspreparaten. Schaal: 1 divisie = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een En-Face Afbeelding van het Endothelium Stained met Anti-VE-Cadherine (Green) en Anti-VCAM-1 (Red). Een confocale enkele optische sectie van endotheelcellen in de buurt van een intercostale opening isgetoond. Merk op dat VCAM-1-expressie is verhoogd in endothelcellen die zich bevinden op het vaartuigtakpunt waar de bloedstroom niet-laminair is. De afbeelding werd opgenomen met behulp van een objectieflens van 60x (NA 1,4, olie). Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: En gezichtsafbeeldingen van de linker- en rechterkarotidearterijen die zijn gemarkeerd met anti-VE-cadherine (groen), anti-VCAM-1 (rood) en DAPI (paars). De linker halsslagader werd gedeeltelijk geligeerd en de juiste carotide werd intact gelaten. Deze en-gezichtspreparaten werden 24 uur na de operatie gemaakt. Verhoogde expressie van VCAM-1 op de geligeerde kant ten opzichte van het intacte vat is duidelijk. Deze beelden werden in de buurt van de bifurcatie van gewone halsslagaders genomenGebruikmakend van een laser scanning confocal microscoop met een objectieflens van 60x (NA 1.4, olie). Schaalstaven = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij het hanteren van muisbloedvaten is het belangrijk om te onthouden dat het endothelium breekbaar is en dat een overmatige mechanische kracht endothelcellen zal beschadigen. Bijvoorbeeld, de endotheelcellen breken of losmaken van de vaatwand als het vat te krachtig wordt geperfueerd, wat gemakkelijk kan gebeuren wanneer de vaatwasser wordt geperfuseerd met een handbediende spuit.
Om constante perfusiedruk te verkrijgen, gebruiken we een zwaartekracht perfusie systeem met een druk van 120 cm waterkolom. Er is gemeld dat de gemiddelde arteriële druk van een muis, die door de stam verschilt, varieert tussen 130 en 170 cm H2014. Zo is de perfusiedruk die we gebruiken iets minder dan de gemeten arteriële druk. Wanneer we perfusie-vaste rat aorta, 90 cm H 2 O kolom druk werd gebruikt 6 .
In situ zijn endothelcellen ook beschadigd als het vaartuig tijdens het oogsten wordt uitgetrokken, Schoonmaken, longitudinale splitsing, immunostaining en montage. In feite is mechanische schade een van de gemeenschappelijke oorzaken van het verliezen van endotheelcellen in een gezichtspreparatie. Vaartuigrekken kunnen zich voordoen bij elke stap tijdens de procedure, maar meestal gebeurt het bij het oogsten van het vaartuig. Het is ook makkelijk om het vaatje uit te breiden wanneer het vetweefsel aan de adventitia wordt verwijderd.
Voorbereidingen worden gemaakt door een schip langs de lengte te schuiven. Dit gebeurt meestal met behulp van een scherpe oftalmische schaar. Het punt van de schaar kan echter te groot zijn als de binnendiameter van het doelvat klein is. In een dergelijk geval kan men een gebroken dun wegwerp scheermesje gebruiken om een snede te maken. We hebben deze techniek gebruikt om een gezichtspreparatie van chick mesenteric artery 15 te maken .
Na fixatie worden een gezichtspreparaten doordrenkt. Gewoonlijk wordt PBS met Triton X-100 gebruiktDit doel, maar het is mogelijk om andere permeabiliseringsreagentia zoals Tween-20, Nonidet P-40, saponine, digitonine en Leucomerm te gebruiken. Ideaal gezien moet de permeabilisatieconditie in elk laboratorium worden geoptimaliseerd. Voor de aorta- en carotisarteria van de muis behandelen we hen met PBS die 0,1 minuten Triton X-100 bij RT bevat en deze behandeling is voldoende om alle cellen in de vaatwand te permeabiliseren. Permeabiliseerde monsters worden vervolgens sequentieel behandeld eerst met een primair antilichaam en vervolgens een secundair antilichaam dat fluorescent gelabeld is. Voor het vinken van muisvaten is het van cruciaal belang dat het primaire antilichaam niet in de muis wordt gemaakt omdat het muisvasculaire weefsel muis IgG bevat, dat zal worden gemerkt door het fluorescent gemerkt secundair anti-muis IgG, waardoor een hoge achtergrondkleuring wordt veroorzaakt. Voor microscopie moet het monster zo vlak mogelijk zijn. Wij drukken dia's voor 5 minuten met 3,5 kg gewicht. Dit specifieke gewicht werd empirisch bepaald.
wHen en face preparaten zijn immunofluorescent genoemd, ze kunnen worden bestudeerd door gebruik te maken van een gewone epifluorescentie microscoop, een laser scanning confocal microscoop, en een multiphoton microscoop. Confocale microscopie is het best om beelden van het endothelium en het subendotheliale gebied tot 50 μm of zo van het vaatoppervlak te verkrijgen, terwijl diepe penetratie van het excitatielicht dat wordt bereikt door de veelvoudige belichtingsmethode, het mogelijk maakt in-focusbeelden te verkrijgen vanuit de diepte van Tot 2 mm van het vaatoppervlak van het vaartuig. Daarnaast kan multiphoton microscopie worden gebruikt voor tweede harmonische beeldvorming, meestal om collageenvezelorganisatie in de vaatwand te bestuderen. Een gezichtspreparatie is groot, waardoor we een groot vaatgebied kunnen onderzoeken, zoals de hele lengte van de aorta. Dit zijn enkele van de voordelen van het gebruik van immunofluorescente gekleurde preparaten van een gezichtsbloedvat. Er zijn echter enkele nadelen van deze techniek. Allereerst is de methode beperkt tot deBeschikbaarheid van specifieke antilichamen en andere fluorescente gelabelde reagentia zoals fluorescerende phalloidine, DAPI en DiI-Ac-LDL (Acetylated Low Density Lipoprotein gelabeld met 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl-indocarbocyanine perchloraat). Aangezien beeldvorming gebaseerd is op fluorescentie, kunnen niet-fluorescerende delen van monsters niet worden afgebeeld. De hele bergmonsters vertonen in het algemeen autofluorescentie, en elastinevezels die in grote bloedvaten voorkomen, fluoreseren groen. Deze fluorescentie is vooral problematisch bij gebruik van een epifluorescentiemicroscoop; Daardoor wordt beeldvorming door een confocale microscoop sterk aanbevolen. Interferentie van deze groene autofluorescentie kan echter aanzienlijk worden verminderd door gebruik te maken van secundaire antilichamen die zijn gemerkt met een rode fluorescerende kleurstof. Tenslotte, aangezien een gezichtsmonster dik is, is beeldvorming door verzonden verlichting niet mogelijk.
Commerciële confocale en multiphoton microscopen komen met beeldanalysesoftware inclusiefEen voor het kwantitatief analyseren van de fluorescerende intensiteit van beelden. Gekwalificeerde gegevens zijn betrouwbaarder als vergelijkingen binnen dezelfde dia worden gemaakt. Dit komt omdat alle voorwaarden voor immunostaining hetzelfde zijn voor het monster. Als de kleurintensiteiten vergeleken moeten worden tussen verschillende dia's (bijvoorbeeld normale versus zieke vaten), is de enige manier om de gegevens te valideren, het monstergetal te verhogen, zodat zowel technische als biologische variaties gemiddeld kunnen worden gemeten. In het algemeen zijn intensiteitsmetingen op confocale beelden die dichtbij het oppervlak van schepen worden verkregen betrouwbaarder. Fluorescerende intensiteiten van beelden verkregen uit dieper gebieden van weefsel zijn meestal variabeler door verschillende graden van verstrooiing en absorptie van zowel excitatie als uitgestraalde fluorescerende licht. In het algemeen moet men voorzichtig zijn bij het interpreteren van subtiele intensiteitsverschillen die worden gedetecteerd in de diepe gebieden van specimens. Om het beeldvermogen van dieper weefsels te verbeteren, worden pogingen gedaan om t te makenKwantitatief doorzichtig en enkele indrukwekkende afbeeldingen zijn verkregen (zie bijvoorbeeld een recent artikel van Neckel et al. 16 en door deze auteurs aangehaalde documenten). Hoewel het mogelijk is dat de behandelingen die worden gebruikt om weefsels doorschijnend te maken, bepaalde antigenen en / of denaturatie van bepaalde epitopen kunnen extraheren, kan deze methode worden gebruikt om meer fluorescerende signalen van diepere weefsels te verkrijgen.
Het gebruik van gezichtspreparaten is niet beperkt tot beeldvorming door fluorescentiemicroscopie. Met behulp van een stereomicroscoop kunnen een preparaat voor gezichtsschepen worden gebruikt om de mate van atherosclerotische plaqueformatie te onderzoeken na het opvullen van ze met Olijfrode O. En preparaten voor gezichtsbehandeling kunnen aseptisch worden gemaakt. Dergelijke preparaten kunnen in de cultuur worden gehouden en kunnen gebruikt worden als een ex vivo systeem om de leukocyt-endotheliale cel interactie te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen
Acknowledgments
De onderzoeksactiviteiten van de auteurs worden ondersteund door subsidies van het Nationaal Instituut voor Gezondheid aan Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G | |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 | |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch | Cardinal Health | 4024 | |
| Blunt retractors, 2.5 mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 | |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Curity gauze sponges 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| Electric heating pad, 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Micro cover glass 22 mm x 50 mm | VWR | 48393059 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 | |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| Petri dishes 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 | |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 | |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 | |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).
- Rogers, K. A., Kalnins, V. I. A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence. J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).
- Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. The regeneration of aortic endothelium. J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).
- Sade, R. M., Folkman, J. En face stripping of vascular endothelium. Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).
- White, G. E., Gimbrone, M. A. Jr, Fujiwara, K. Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ. J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).
- Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress. Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).
- Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy. Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).
- Chèvre, R., et al. High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice. Circ Res. 114, 770-779 (2014).
- Heo, K. -S., et al. Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function. J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).
- Le, N. -T., et al. A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis. Circ. 127, 486-499 (2013).
- Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ. Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).
- Nigro, P., et al. Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice. J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).
- Jinguji, Y., Fujiwara, K. Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery. Endothelium. 2, 35-47 (1994).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
