Summary
تستخدم هذه المخطوطة ومقرها فيجي المفتوحة المصدر حزمة البرامج VirusMapper لتطبيق تحليل جسيم واحد إلى صور مجهرية فائقة الدقة من أجل توليد نماذج دقيقة للبنية النانو.
Abstract
فائقة الدقة مضان المجهر هو ثورة حاليا البحث بيولوجيا الخلية. قدرتها على كسر الحد قرار من حوالي 300 نانومتر يسمح التصوير الروتيني للمجمعات والعمليات البيولوجية النانوية. هذه الزيادة في القرار يعني أيضا أن أساليب شعبية في المجهر الإلكتروني، مثل تحليل جسيم واحد، ويمكن بسهولة أن تطبق على فائقة الدقة مضان المجهر. من خلال الجمع بين هذا النهج التحليلي مع فائقة الدقة التصوير الضوئي، يصبح من الممكن الاستفادة من جزيء محدد قدرة وسم المجهر مضان لتوليد الخرائط الهيكلية للعناصر الجزيئية ضمن هيكل متبدل الاستقرار. ولهذه الغاية، قمنا بتطوير خوارزمية جديدة - VirusMapper - تعبئتها بوصفه المساعد يماغيج سهلة الاستخدام وعالية الأداء، والإنتاجية العالية. تقدم هذه المقالة دليل متعمقة لهذا البرنامج، وعرض قدرتها على الكشف عن السمات الهيكلية الجديدة في م البيولوجيالمجمعات olecular. هنا، نقدم كيفية تجميع البيانات متوافقة ونقدم بروتوكول خطوة بخطوة حول كيفية استخدام هذه الخوارزمية لتطبيق تحليل جسيم واحد إلى صور فائقة الدقة.
Introduction
تمت زيارتها فائقة الدقة (SR) المجهري لها تأثير كبير على بيولوجيا الخلية من خلال توفير القدرة على صورة العمليات الجزيئية الأساسية جنبا إلى جنب مع وضع العلامات المحددة الجزيئي بالغ الأهمية لفهم لهم. SR يمكن الآن المجهر الضوئي من الاقتراب من قرارات (20-150 نانومتر) سابقا فقط للتحقيق مع المجهر الإلكتروني (EM) مع الحفاظ على الفوائد الرئيسية من المجهر الضوئي، مثل القدرة على صورة الخلايا الحية 1 و 2. وعلاوة على ذلك، وحفظ الهيكلي وجدت على مستوى النانو يسمح تطبيق تحليل جسيم واحد (SPA) لبيانات ريال، مفهوم يستخدم على نطاق واسع في المجهر الإلكتروني 3. باستخدام SPA، نسخا كثيرة للغاية الحفظ هيكل يمكن تصوير وبلغ متوسط معا لتحسين دقة، والدقة، أو الإشارة إلى الضجيج الكائن تصور. عندما تستخدم بالاقتران مع SR، وقد ثبت SPA ليكون أداة قوية لارتفاع فرسم الخرائط recision مكونات المجمع المسام النووي 4، 5، 6 جسيم مركزي، والفيروسات، مثل فيروس نقص المناعة البشرية 7 و HSV-1 8.
ومع ذلك، فقد تحدى التطبيق الروتيني المشترك لSPA ريال وبسبب عدم وجود البرامج المتاحة. لهذا السبب، قمنا بتطوير VirusMapper، وهو البرنامج المساعد لبرنامج معالجة الصور الشهير يماغيج / فيجي 9. وهذه هي أول مجموعة من البرامج المتاحة بحرية لSPA المعمم مع الصور مضان 10 مصممة لتوفير سريع، سهل الاستعمال، المتوسط السذاجة متعدد القنوات هياكل المصورة مع المجهر ريال. وعلى الرغم من تصميمه للبحث عن الفيروسات، ويمكن تطبيقها على أي مجمع الجزيئات التي الأنواع الجزيئية مختلفة يمكن تصويرها، التي تم تحديدها، والمترجمة.
VirusMapper يمكن استخدامها لإنتاج عالية الدقة الجزيئيةنماذج من أي بنية المعروفة، مما يسمح لحساب متوسط الأبعاد وغيرها من المعالم. تصميم خوارزمية يجعلها مفيدة بشكل خاص لفصل السكان من الهياكل، وتوفير لتحديد توجهات واضحة أو الدول الصرفية المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، والتصوير متعددة يمكن استخدامها لتوظيف قناة المرجعية في الحالات التي تكون فيها البنية الأساسية غير معروفة، مما يسمح لاكتشاف هيكل قائم على المرجعية. وتقدم الإرشادات للبرمجيات تحميل وتثبيت على https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . كما يمكن العثور على بيانات سبيل المثال هناك، وينصح المستخدمين لممارسة استخدام البرنامج على البيانات سبيل المثال قبل محاولة تطبيقه لبلدهم.
هنا، يتم وصف الخطوات لاستخدام هذا البرنامج المساعد لإنتاج نماذج SPA من البيانات الخام. البرنامج يأخذ الصور الخام التي تحتوي على س أحاديةص الهياكل المسمى متعددة كإدخال. وتعود، وفقا لعدد من المعايير التي يتم تعديلها كما هو تشغيل البرنامج، ونماذج SPA تبين متوسط توزيع مكونات المسمى داخل هياكل تصوير.
والهدف من هذا البروتوكول هو لإنتاج نماذج SPA دقيقة إعطاء متوسط تعريب مكونات داخل هياكل تصوير وفقا لخطوط الأنابيب المبين في الشكل (1). كما هو مبين في الشكل رقم 1، ينقسم سير العمل البرمجيات مفيد في ثلاث مراحل. المرحلة الأولى هي شريحة صور كبيرة، مما أدى إلى أكوام من جسيمات لكل قناة. هذه الجسيمات هي الوحدات التي سيتم المتوسط لخلق نماذج ولإنتاج البذور لتوليد نموذج. المرحلة الثانية هي لتوليد صور البذور، والتي تستخدم لتسجيل مجموعة كاملة من الجزيئات في المرحلة النهائية. ويتم ذلك عن طريق اختيار قناة المرجعية واختيار الجسيمات في هذه القناة التي من شأنها أن تساهم في الصورة يدوياeeds. ويتم اختيار البذور في هذه القناة المرجعية ولكن يمكن أن تتولد لجميع القنوات. وإعادة ترتيب الجزيئات في البداية عن طريق تركيب و2D التمويه في هذه القناة. جميع الجزيئات التي تم اختيارها وتكييفها ثم يتم متوسط لإنتاج البذور. لكل هيكل موحد ينظر في البيانات التي سيتم على غرار، يجب أن يتم تحديد الجزيئات البذور التي تمثل بوضوح ودقة هذا الهيكل. واجهة في هذه المرحلة هي أيضا مفيدة لمسح البيانات عن مثل هذه الهياكل.
المرحلة الأخيرة هي لتوليد نماذج باستخدام مطابقة القالب. ويتحقق ذلك من خلال تسجيل الجزيئات المستخرجة أصلا إلى صور البذور ولدت في القسم السابق من قبل عبر الارتباط. وبلغ متوسط مجموعة فرعية من الجسيمات المسجلة معا، وهذه العملية التكرارية مبادرة جديدة لخفض نموذج يعني خطأ التربيعية، إذا رغبت في ذلك. يتم تحديد هذه المجموعة الفرعية من خلال وضع حد أدنى للتشابه ضد البذور التي يجب الوفاء بها. عند إنشاء نموذجق في وقت واحد في عدة قنوات، والتشابه المشترك، أو متوسط أوجه التشابه لكل قناة، يتم استخدام. النماذج الناتجة والجسيمات المسجلة التي ساهموا فيها ويمكن بعد ذلك إجراء المزيد من التحليل.
Protocol
ملاحظة: هذا البروتوكول والفيديو تكملة الورقة الأصلية 10 اصفا حزمة البرامج في مزيد من التفاصيل. ويتم تشجيع القراء على مراجعتها بعناية لإرشادات إضافية بشأن استخدام البرنامج. هناك ثلاث مراحل رئيسية هي: استخراج الجسيمات، التي شرائح الصور الكبيرة الى جزيئات الفردية؛ اختيار البذور، حيث يتم تحديد الهياكل المشتركة في البيانات والانحياز لإنتاج البذور، والتي تستخدم في المرحلة النهائية. وتوليد نموذج، حيث قالب مطابق بناء على هذه البذور محاذاة الجزيئات والمتوسطات استخراج مجموعة فرعية لإنتاج نماذج SPA.
1. إعداد قبل تشغيل حزمة برمجيات
- إعداد عينات من هيكل قيد الدراسة على ساترة أو في الظروف التجريبية ذات الصلة.
- صورة العينات مع فائقة الدقة مضان المجهر، مثل منظم إضاءة المجهر (SIM) 11 أو stimulaنضوب تيد الانبعاثات (STED) 12 المجهري.
ملاحظة: التفاصيل الدقيقة لكيفية إعداد وعينات صورة يعتمد إلى حد كبير على طبيعة هيكل قيد الدراسة، لذلك ينبغي الرجوع إلى الأدبيات ذات الصلة. وكمثال على ذلك، فإن طريقة دقيقة لإعداد وتصوير عينات من فيروس جدري، مثل تلك المستخدمة هنا، وصفت في قسم النتائج تمثيلا. - خلق صور من حقول متعددة من رأي يظهر عدد كبير من نسخ منفصلة من هيكل أو الجسيمات، ويفضل أن الآلاف. جزيئات الصورة التي يتم فصلها وكذلك من بعضها البعض قدر الإمكان والتأكد من أن الصور خالية من الأوساخ أو الهياكل الفلورسنت الأخرى التي ليست من مصلحة.
- فتح جميع الصور التي تحتوي على جزيئات في فيجي عن طريق سحب الملفات إلى شريط الأدوات فيجي أو عن طريق اختيار "ملف"> "فتح".
- حدد "صورة"> "المكدس"> "أدوات"> "سلسلة" لسلسلةالصور في حزمة واحدة. ثم، إذا كانت الصورة الناتجة هي Hyperstack، وتحويلها إلى كومة عن طريق اختيار "صورة"> "Hyperstacks"> "Hyperstack إلى كومة".
ملاحظة: يجب أن يكون مكدس النهائي قنوات مقحم. إذا كان هناك نوعان من القنوات، شريحة الأولى في كومة ينبغي أن تكون القناة 1 من الصورة الأولى، يجب أن تكون شريحة الثانية القناة المقابلة 2، يجب أن تكون شريحة ثالثة القناة 1 من الصورة الثانية، وهلم جرا.
2. استخراج الجزيئات
- اختيار صورة لشريحة وحدد "استخراج الهياكل الفيروسية". اختيار مكان حفظ الجسيمات استخراج وعرض "استخراج الهياكل الفيروسية" الحوار (الشكل 2).
- تعيين المعلمات استخراج مع التقديرات الأولية التي إدخالها في مربع الحوار "استخراج الهياكل الفيروسية" على النحو التالي. صقل هذه المعايير بعد معاينة تجزئة الصورة.
- تعيين خدرإيه من القنوات في مجموعة البيانات مثل عدد من القنوات مضان المختلفة التي تم تصويرها (على سبيل المثال، 2).
- تعيين القناة المرجع الذي يتم استخراج الجزيئات من خلال الكشف عن القمم في تلك القناة عن طريق إدخال رقم من اختيار القناة. حدد القناة أكثر اتساقا. وهذا هو، القناة فيها معظم جسيمات لها نفس المظهر.
ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، فإن الجزيئات في هذه القناة لديها كحد أقصى المركزي. - اختيار أم لا لتطبيق ما قبل الكشف عن التمويه الضبابي. تعيين ما قبل الكشف عن التمويه الضبابي إلى 0 لتطبيق أي طمس. إذا تم زيادة هذه القيمة، يتم تطبيق فلتر التمويه الضبابي من نصف قطر معين قبل الكشف ماكسيما المحلي. استخدام هذه الميزة إذا لم يكن لدى القناة إشارة كحد أقصى المركزي (على سبيل المثال، شكل حلقة)؛ عدم وضوح الحث على مظهر واحد.
ملاحظة: مجزأة المناطق ذات الاهتمام (رويس) لا تملك التمويه الضبابي يطبق عليهم، وهذه الميزة هي استخدام فقطد لوضع رويس في قناة المرجعية. - حدد نصف قطرها العائد على الاستثمار (التي سيتم تعيين حول كل أقصى المحلي) في بكسل. اختر قيمة بحيث أن رويس هي أكبر قليلا من أكبر الجسيمات، كما هو الحال في الشكل (3). على سبيل المثال، في حالة ظهور أكبر الجسيمات ليكون قطرها حوالي 30 بكسل (يقدرها العين)، ثم حدد نصف قطرها ROI إلى 20 بكسل.
- تعيين عدد رويس استخدام في إطار ل، قيمة صغيرة نسبيا الأولية أقل من 100.
- تعيين الحد الأقصى للتداخل ROI. إذا يتم فصل جزيئات جيدا، والحفاظ على هذا صغيرة. إذا تتجمع الجسيمات، وزيادة هذا لتمكين رويس إلى التداخل.
- حدد "عرض المعاينة".
ملاحظة: عند تحديد هذا، ستظهر رويس المستخرجة للقناة المرجعية المرتبطة الإطار الحالي. - ضبط نصف قطرها ROI، وعدد من رويس، والعائد على الاستثمار أقصى تداخل أن يكون رويس ذات حجم مناسب حول العديد من الجسيمات ممكنكما في الشكل (3).
- حدد "OK" لتشغيل تجزئة. إغلاق الصورة ومدير ROI.
ملاحظة: لا تغيير أسماء الملفات من مجموعات الجسيمات. يجب أن تكون هذه الأسماء في شكل "الجسيمات الفيروسية - channelX" للأقسام التالية.
3. حدد بذور
- اختر "إنشاء بذور"، حدد المجلد حيث يتم حفظ الجسيمات المستخرج، وعرض "إنشاء بذور" الحوار والنوافذ (الشكل 4).
- تعيين المعلمات البذور الاختيار المبدئي عن طريق إدخالها في مربع الحوار "إنشاء بذور"، على النحو التالي.
- تعيين قناة المرجعية التي سيتم تركيبها على محاذاة ومركز كل القنوات. اختيار القناة التي معظم جسيمات لها نفس المظهر والتي تحتوي على أقصى المركزي، إن أمكن.
- حدد خانات لجميع القنوات التي يجب أن يتم إنشاء البذور.
- تحديد إذا كانت البذور يجب أن يكون rotatإد بنسبة 90 درجة. استخدام هذه الميزة لمحاذاة تتفق مع نماذج أخرى
- اختيار أم لا لتطبيق التمويه الضبابي قبل المحاذاة. حدد نصف قطرها طمس لكل قناة إلى 0 لتطبيق أي طمس. زيادة هذه القيمة إلى تطبيق فلتر التمويه الضبابي من نصف قطر معين قبل إعادة. استخدام هذه الميزة إذا الجزيئات لا تملك الحد الأقصى المركزي؛ عدم وضوح الحث على مظهر واحد.
ملاحظة: بذور يكن طمس تطبيقها، وهذه الميزة هي فقط للحصول على محاذاة متسقة. - تحديد ما إذا كان استخدام التصحيح التحول إلى مركز على حدة البذور للقنوات غير مرجعية، وإن لم يكن تناوب عليها، عن طريق فحص أو إلغاء تحديد خانات "تصحيح التحول" لكل قناة.
ملاحظة: استخدم هذا إذا لم يتم محاذاة القنوات بشكل جيد مع بعضها البعض. كما يمكن أن يكون مفيدا لمواءمة قنوات أخرى فقط وفقا لمرجعية، دون تصحيح التحول.
- اختيار الجسيمات لاستخدام البذور. البحث من خلال رانه الجسيمات تسلسل العثور على جسيم يشبه الهيكل الذي هو أن تكون على غرار وتسجيل عدد الإطار.
- أدخل الرقم في "إطارات لاستخدام" مربع، وسوف تظهر المزيد من النوافذ (الشكل 5). إدخال أرقام إطارات متعددة مفصولة بفواصل.
- عرض إطارات البذور ومتوسط البذور الناتجة في النوافذ التي تظهر.
ملاحظة: إن سجل تشير بذور مماثلة إلى المتوسط. - ضبط قناة إشارة، فإن نصف قطر التمويه الضبابي، وخيارات التصحيح التحول إلى تحسين عملية اختيار البذور حتى أن عددا من الأطر البذور وجدت لها مظهر مماثل. تواصل بذور مضيفا حتى يتم إنشاء متوسط البذور التي تشبه مرض هيكل ينظر في البيانات التي سيتم تصميمها.
- اسم البذور وحيث سيتم حفظ وحدد "OK" لحفظ الصور البذور النهائية لاستخدامها لاحقا في توليد نموذج.
4. توليد نماذج
- سيlect "إنشاء نماذج بناء على بذور"، حدد المجلد حيث يتم حفظ الجسيمات المستخرج، وعرض "إنشاء نماذج" الحوار (الشكل 6).
- تحميل بذور لكل قناة باستخدام خانات.
سيتم حفظ البذور في مجلد فرعي كان اسمه في مربع الحوار "إنشاء بذور": ملاحظة. الاسم الافتراضي هو "تحليل". رعاية لتحديد المتوسطات البذور، وليس إطارات، والتي يتم حفظها أيضا لتكون مرجعا. - تعيين المعلمات الأولية جيل النموذج من قبل إدخالها في مربع الحوار "إنشاء نماذج"، على النحو التالي. صقل في وقت لاحق هذه المعايير.
- تحديد ما إذا كان استخدام قناة المرجعية للمحاذاة، الذي يحسب الترجمة وتناوب فقط من القناة إشارة ويطبقها على جميع القنوات. في حالة استخدام هذا الخيار، حدد القناة لاستخدام كمرجع.
ملاحظة: يجب اختيار هذا الخيار فقط لاستخدام تحديدا قناة واحدة كما refereالامتحانات التنافسية الوطنية، كما لو فعل اكتشاف هيكل قائم على المرجعية. وإلا، فإنه سوف يؤدي إلى نماذج أقل دقة. القنوات يجب أن تنسجم بشكل جيد في حالة استخدام هذا الخيار. - اختيار ما إذا كنت تربيع شدة صورة خلال مطابقة القالب. هذا وسوف تزيد من حدة الخلافات الصغيرة، وذلك باستخدام هذا عند إنشاء نموذج التي لديها ميزات خفية بشكل خاص.
- اختيار الحد الأدنى تشابه ضد البذور باستخدام "الحد الأدنى للتشابه ضد البذور" شريط التمرير أو عن طريق إدخال رقم داخل منطقة الجزاء.
ملاحظة: الجسيمات فقط مع تشابه إلى البذور أكبر من سيستخدم هذا قطع. 60-80٪ عادة خيارا جيدا لتبدأ. - تعيين الحد الأقصى لعدد التكرارات إلى 1، وتحسين الحد الأدنى للتشابه ضد البذور، وزيادة في وقت لاحق، كما هو مطلوب.
- حدد خانات اختيار عناصر عملية توليد نموذج التي ستظهر.
ملاحظة: "مشاهدة البذور" سيتم عرض البذور التي تم تحميلها مع مربعاالصورة في الجزء العلوي من مربع الحوار. "مشاهدة نماذج" سيتم عرض كل التكرارات من النماذج التي تم إنشاؤها من حساب متوسط فرعية من الجسيمات التي تلبي الحد الأدنى للتشابه ضد البذور. "مشاهدة MSE" سيتم عرض صورة يعني خطأ مربع (MSE) الذي يسلط الضوء على مناطق نموذج التي هي الأكثر متغير. "مشاهدة جسيمات" سيتم عرض مجموعة فرعية من الجزيئات التي يتم استخدامها لإنشاء النماذج، مسجلة وفقا لأعلى تكرار لنموذج التي يتم عرضها.
- تحديد ما إذا كان استخدام قناة المرجعية للمحاذاة، الذي يحسب الترجمة وتناوب فقط من القناة إشارة ويطبقها على جميع القنوات. في حالة استخدام هذا الخيار، حدد القناة لاستخدام كمرجع.
- حدد "إظهار معاينة" لتوليد نماذج المعاينة وعرض النتائج.
ملاحظة: هذه هي الخطوة الأكثر كثافة حسابيا من هذه العملية. وقت التشغيل لمجموعة من بضعة آلاف من جزيئات بأقطار من بضع عشرات من بكسل على جهاز كمبيوتر سطح المكتب يجب أن يكون حوالي 10 دقيقة. إذا حساب الوقت هو المشكلة، يجب على المستخدمين أولا محاولة الخوارزمية على مجموعة فرعية صغيرة من البيانات أو استخدام دائرة نصف قطرها أصغر ROI في الخطوة 2.2.4، إذا أمكن ذلك. - عرض توليدنماذج د وتحسين المعلمات، وخاصة الحد الأدنى للتشابه ضد البذور. زيادة الحد الأدنى للتشابه ضد البذور حتى يتم تضمينها فقط الجسيمات الحقيقية للالتشكل المنمذجة في النموذج.
- زيادة الحد الأقصى لعدد مرات التكرار باستخدام "أقصى عدد التكرارات" شريط التمرير أو عن طريق إدخال رقم في مربع والسماح للعملية توليد نموذج تكرار. استخدام قيمة حوالي 10 للتكرار القصوى.
- تسمية نماذج وحدد "OK" لحفظ مداخن تطور النموذجية التي تحتوي على جميع التكرارات من عملية توليد نموذج النهائية.
ملاحظة: إذا كان الحد الأدنى للتشابه ضد البذور عالية بحيث لا الجزيئات وهذا التشابه، سيتم تحديث أي شيء. إذا ظهر المساعد ليتم تجميدها، والنظر في إمكانية أن الحد الأدنى للتشابه مرتفع جدا.
Representative Results
هنا، علينا أن نظهر البرنامج على نموذج الفيروسة الجدرية، وفيروس جدري. واحد من الفيروسات الثدييات، وحزم اللقاحية الأكثر تعقيدا حوالي 80 البروتينات المختلفة داخل 350 س 270 × 250 نانومتر 3 على شكل الطوب الجسيمات 13 و 14. ثلاثة الأساسات يمكن تمييز بواسطة المجهر الإلكتروني: نواة مركزية، والذي يحتوي على جينوم dsDNA. هيكلين البروتينية، ودعا الهيئات الجانبية، التي تطويق الأساسية؛ وطبقة ثنائية شحم بروتيني واحد مغلف 15. الحجم الكبير، بنية معقدة، وقابليته للالمؤتلف علامات بروتين فلوري جعل اللقاحية نظام ممتاز للتدليل على سير العمل VirusMapper.
استخدام البرنامج كما هو موضح هنا، وتوزيع مجموعة متنوعة من البروتينات على الفيريون اللقاحية يمكن أن تكون على غرار. وصفت والبروتين وتصويرها، وربما في نقل الركاب والحمولاتوقد استخدم الأمة مع بروتين آخر من التوزيع المعروفة كمرجع، والبرنامج كما هو موضح لإنتاج متوسط نماذج من توطين أن البروتين على الجسيمات. في هذا المثال، تم غرار اثنين من البروتينات، والداخلي L4 البروتين الأساسية، والجسم الجانبي الرئيسي F17 المكون.
فيروس جدري المؤتلف الذي F17 الموسومة مع GFP والموسومة L4 مع استخدمت mCherry 16. وقد تضعف فيروس المنقى في 1 ملي تريس، ودرجة الحموضة 9، وبد أن coverslips غسلها وعالية الأداء من قبل طلائها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبعد ذلك ثابتة العينات من خلال تطبيق 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة. وقد شنت Coverslips مباشرة على الشرائح في antifade المتوسطة المتزايدة. وجرى التصوير بها SIM على المجهر SIM التجاري. تم اختيار مجال الرؤية تحتوي على مئات من الفيروسات والصور تم الحصول عليها باستخدام 5 مرحلة التحولات و 3 دورات الشبكة مع 561 نانومتر (32 ميكرون يليق بيRIOD) و 488 نانومتر (32 ميكرون صريف فترة) ليزر. تم الحصول على الصور باستخدام كاميرا sCMOS ومعالجتها باستخدام برنامج المجهر. تم الانحياز القنوات على أساس شريحة حبة متعددة الألوان تصويرها مع نفس الإعدادات الحصول على الصور. بعد أن افتتح SIM إعادة الإعمار والمواءمة قناة الصور في فيجي ومتصلا إلى كومة صورة واحدة.
تم استخراج الجزيئات الفيروسية من الصور باستخدام قناة L4 كمرجع ودون تطبيق أي التمويه الضبابي، وهذه الجزيئات أن يكون الحد الأقصى المركزي. تم استخراج حوالي 15،000 الجسيمات في هذه التجربة.
نظرا لهندسة اللقاحية الهيئات الجانبية لها مظهر مختلف تماما بناء على اتجاه الفيروس. نحن تصور اثنين من التوجهات التي يمكن تمييزها واحد أو اثنين من الهيئات الجانبية. أشرنا إلى هذه التوجهات كما الأمامي وسهمي والاحترامively.
وقد تم اختيار البذور منفصلة للأمامي والسهمي التوجهات من خلال البحث عبر قائمة الجسيمات في مرحلة "إنشاء بذور" (الأرقام 4 و 5)؛ الجسيمات التي كانت بشكل واضح في اتجاه واحد أو والآخر الذي تم اختياره. تم استخدام قناة L4 كقناة إشارة إلى محاذاة البذور مع بعضها البعض. مرة أخرى، لم يكن التمويه الضبابي اللازم. وقد تم اختيار 5 جسيمات لكل اتجاه ووبلغ متوسط إنتاج البذور.
تم إنشاء نماذج لكل التوجه بناء على هذه البذور. ولم تستخدم قناة إشارة ولا قيم الكثافة المربعة. تم تعيين الحد الأقصى لعدد التكرارات في البداية إلى 1، وتعيين الحد الأدنى للتشابه لتشمل جميع أنحاء 1000 الجسيمات في كل حالة، الذي أعطى مظهر متناسق لكل اتجاه. ثم زاد الحد الأقصى لعدد مرات التكرار لالسماح للتقارب النموذج. وهكذا ولدت نماذج لتوجهات اثنين في القناتين (الشكل 7).
الشكل 1: VirusMapper سير العمل. ويتم تنظيم هذا البرنامج المساعد إلى ثلاث مراحل رئيسية. يتم استخراج الجزيئات الفيروسية من الصور الكبيرة، ويتم اختيار الصور قالب أو البذور شبه يدويا من البيانات، ويتم إنشاء نماذج SPA النهائية من البيانات من خلال الإشارة إلى البذور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: "استخراج الهياكل الفيروسية" الحوار. عند اختيار "استخراج الفيروسية متطوره وفاق "، سيظهر هذا الحوار. ينبغي أن تملأ المعلمات مع التقديرات الأولية للتجزئة المثلى." مشاهدة معاينة "يمكن بعد ذلك اختيار، والسماح للرويس لمعاينتها والمعلمات ليكون على ما يرام ضبطها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): إعداد المعلمات الاستخراج. بعد معاينة رويس التي سيتم استخراجها، في دائرة نصف قطرها ROI، عدد رويس، والحد الأقصى تداخل ROI يتم تعديلها لتحقيق مثل هذا الوضع. رويس هي أكبر قليلا من الجسيمات، يتم تضمين كافة الجزيئات في العائد على الاستثمار، ورويس يمكن أن تتداخل فيه الكفاية للسماح للجسيمات مجمع لفصلها.عنخ "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توليد قالب البذور مطابقة. "إنشاء بذور" الحوار (1) يحدد المعايير التي ينبغي اعطاؤها. تسلسل جزيئات الإشارة (2) يسمح للمستخدم من خلال المسح الجزيئات في قناة المرجعية. عند عرض الجسيمات في تسلسل جزيئات الإشارة، والجسيمات إعادة ترتيب لجميع القنوات يمكن أن ينظر في معاينات الجسيمات إعادة ترتيب (3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: إضافة الصور البذور. كما يتم إضافة بذور ل "إطارات لاستخدام" مربع، ومتوسط جميع البذور (4) والأطر المعنية (5) يتم عرض. واقترح الجزيئات التي تشبه إلى متوسط البذور الحالية في مربع الحوار (6). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (6): "إنشاء نماذج" الحوار. عند اختيار "إنشاء نماذج بناء على بذور،" سوف يظهر هذا الحوار. ينبغي شغل المعلمات مع التقديرات الأولية لتوليد النموذج الأمثل، وعناصر الإجراء الجيل نموذج ليتم عرضها خلال حساب يجب أن يكون محددا. "مشاهدة معاينة" يمكن بعد ذلك اختيار، والسماح للعملية توليد نموذج لتشغيل والمعلمات يكون على ما يرام ضبطها.ftp_upload / 55471 / 55471fig6large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: نماذج ولدت مع VirusMapper. تم تصوير virions اللقاحية مع البروتين الأساسية L4 ذات الكلمات الدلالية مع mCherry وF17 الجانبية بروتين الجسم الكلمات الدلالية مع EGFP باستخدام SIM. وبعد ذلك ولدت نماذج مع البرنامج، كما هو موضح في البروتوكول. وهناك اتجاهان، الأمامية والسهمي، وتتميز بظهور الهيئات الجانبية. شريط مقياس = 100 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
مع هذا الأسلوب، وقد تم تجهيز الباحثون إلى الجمع بين قوة SPA والفحص المجهري ريال من أجل توليد عالية الدقة، ونماذج 2D متعددة القنوات للبنية البروتين من الفيروسات وغيرها من المجمعات الجزيئات. ومع ذلك، ينبغي اتخاذ بعض الاعتبارات الهامة في الاعتبار.
وينبغي اختيار البذور لتمثيل هيكل والتي ينظر اليها على الدوام. وبالتالي، يجب فحص البيانات الخام بعناية قبل أن يتم اختيار البذور. وهذا أمر مهم للوقاية من نماذج متحيزة. الخيارات يمكن التصديق عليها من قبل دراسة الحد الأدنى للعتبات التشابه حاجة لتشمل عددا من الجزيئات في النماذج. بوضوح، لاختيار البذور، وأعلى هذه العتبة يجب أن يكون لعدد معين من الجسيمات، وأكثر أن هيكل هو واضح في البيانات.
مفهوم قالب مطابق مفيد بشكل خاص عندما يكون هناك تجانس في البيانات. جميع الهياكل المختلفة التي السادسينبغي تحديد sible ونماذج مختلفة خلق لكل حالة. خلال فصل هياكل غير المتجانسة في قناة واحدة ولكن في نفس الوقت خلق نماذج في القناة الثانية، قد تظهر أنماط من شأنها أن لم يكن واضحا على الفور.
وهناك اعتبار آخر أن تكون على علم عند استخدام هذه الخوارزمية هو أن الإجراء التكرار سوف يضاعف التماثل العشوائية. على سبيل المثال، عندما النمذجة هيكل مع اثنين من ماكسيما متماثل، سيتم محاذاة كافة التباينات الطفيفة بين ماكسيما مع بعضها البعض خلال التكرار، وبالتالي فإن النموذج النهائي يكون غير المتماثلة الحد الأقصى. إذا كان هذا لا يعكس التماثل المعروفة في البنية التي يتم تصميمها، ثم وهذا ينبغي أن تؤخذ بعين الاعتبار. حاليا، الطريقة الوحيدة لتجنب هذه تعظيم هي للحد من عدد التكرارات إلى 1، على الرغم من التطور المحتمل أن يكون لVirusMapper لدمج محاور التناظر في عملية توليد نموذج. فإن أي إصدارات جديدة من VirusMapper تكون افاعيlable على الموقع الإلكتروني المشار إليها (انظر المواد الجدول). وسيكون للمستخدمين أيضا العثور على التعليمات هنا للإجابة على أية استفسارات المشتركة.
البرنامج كما هو موضح ينطبق على أي هيكل التي يمكن تصويرها لقرار كاف لتصور الميزات التي يرغب المستخدم في تصميم نموذج. وعلى الرغم SPA يمكن أن تحسن القرار، وبشكل واضح لن تحسين الرؤية من الميزات التي عادة ما تكون غير مرئية. هذا البروتوكول لا، لذلك، وسيلة لتحسين نوعية البيانات. كما هو الحال مع أي تقنية، وإعداد العينات بعناية والاستفادة المثلى من استراتيجية التصوير سيوفر أنظف البيانات وأفضل النماذج الناتجة.
اختيار طريقة التصوير ريال مهم أيضا، وبصفة عامة، وسوف تعتمد على العينة في متناول اليد. تم التحقق من صحة VirusMapper للعمل بشكل جيد مع SIM وSTED 10، ويمكن أن تستخدم أيضا مع بيانات توطين المجهر ذات جودة عالية، ولكن يجب توخي الحذر في هذه الحالة،كما وضع العلامات متفرق يمكن أن يسبب مشاكل مماثلة لتلك التي تعظيم التماثل.
حاليا، VirusMapper هو خوارزمية فقط متاحة بحرية للتحليل جسيم واحد من الصور مضان وللأغراض العامة 2D SPA البرمجيات المتوسط الوحيد. الدراسات الأخرى التي استفادت من نفس المبادئ 4، 6، 8 استخدمت برامج مخصصة المتخصصة لكل دراسة معينة. وقد نشرت خوارزميات للأغراض العامة لإعادة إعمار بيانات 3D 5، 18، على الرغم من عدم تقديم البرامج.
عندما تستخدم على النحو الموضح في هذه المقالة، VirusMapper يمكن استخدامها لإنتاج نماذج محددة ودقيقة، وقوية للبنية البروتين الجزيئات من الفيروسات والمجمعات الأخرى. مع هذه النماذج، يمكن للباحثين أخذ القياسات الدقيقة للمتوسط أبعاد البنيةالقوام قيد الدراسة، وربما السماح لهم للوصول استنتاجات البيولوجية التي لن يكون الأمر خلاف ذلك ممكن.
وعلاوة على ذلك، مع قدرات متعددة القنوات من هذه التقنية، فمن الممكن لتعيين عدد غير محدود من البروتينات والمكونات داخل المجمعات واكتشاف بروتين منظمة جديدة. دراسة التغيرات في بنية النانو في مختلف الظروف ذات الصلة بيولوجيا، مثل مراحل مختلفة من دورة حياة الفيروس، لديه القدرة على تقديم رؤى قيمة حول علم الأحياء.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ونود أن نشكر كورينا بيرلي، جيرزي ساموليج، بيدرو ماتوس بيريرا، كريستوفر بليك، وكاترين شيرر لمساهماتها في تطوير الأصلي والتحقق من VirusMapper. كما نود أن نشكر أرتور ياكيموفيتش لله قراءة نقدية للمخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث (BB / M022374 / 1) (RH)؛ التمويل الأساسي لمختبر MRC لبيولوجيا الخلية الجزيئية، جامعة لندن (JM)؛ المجلس الأوروبي للبحوث (649101-UbiProPox) (JM)؛ ومجلس البحوث الطبية (MR / K015826 / 1) (RH وJM). ويتم تمويل RG من الهندسة والعلوم الفيزيائية مجلس البحوث (EP / M506448 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fiji | Open-source image analysis software | ||
| NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
| VectaShield antifade mounting medium | Vector Labs | H-100 | |
| Elyra PS1 | Zeiss | ||
| ZEN BLACK | Zeiss | Image processing software for SIM | |
| High performance coverslip | Zeiss | 474030-9000-000 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher | T7279 |
References
- Henriques, R., Griffiths, C., Rego, E. H., Mhlanga, M. M. PALM and STORM: Unlocking live-cell super-resolution. Biopolymers. 95 (5), 322-331 (2011).
- Gustafsson, N., Culley, S., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nat Commun. 7, 12471 (2016).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Szymborska, A., de Marco, A., Daigle, N., Cordes, V. C., Briggs, J. A. G., Ellenberg, J. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging. Science. 341 (6146), 655-658 (2013).
- Broeken, J., Johnson, H., et al. Resolution improvement by 3D particle averaging in localization microscopy. Methods Appl Fluoresc. 3 (1), 14003 (2015).
- Burns, S., Avena, J., Unruh, J., Yu, Z. Structured illumination with particle averaging reveals novel roles for yeast centrosome components during duplication. Elife. , (2015).
- Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM. Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (22), 8564-8569 (2012).
- Laine, R. F., Albecka, A., Svan de Linde,, Rees, E. J., Crump, C. M., Kaminski, C. F. Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging. Nat Commun. 6, 5980 (2015).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Gray, R. D. M., Beerli, C. VirusMapper: open-source nanoscale mapping of viral architecture through super-resolution microscopy. Sci Rep. 6, 29132 (2016).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J of Micros. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Let. 19 (11), 780 (1994).
- Chung, C. -S., Chen, C. -H., Ho, M. -Y., Huang, C. -Y., Liao, C. -L., Chang, W. Vaccinia virus proteome: identification of proteins in vaccinia virus intracellular mature virion particles. J Virol. 80 (5), 2127-2140 (2006).
- Moss, B. Poxviridae: the viruses and their replication. Fields virology. , Ovid. (2010).
- Condit, R. C., Moussatche, N., Traktman, P. In a nutshell: structure and assembly of the vaccinia virion. Adv Virus Res. 66 (6), 31-124 (2006).
- Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., et al. Vaccinia virus entry is followed by core activation and proteasome-mediated release of the immunomodulatory effector VH1 from lateral bodies. Cell Rep. 4 (3), 464-476 (2013).
- Nanoj-virusmapper. , Available from: https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper (2016).
- Fortun, D., Guichard, P., Unser, M. Reconstruction From Multiple Poses in Fluorescence Imaging: Proof of Concept. IEEE J Sel Topics Signal Process. 10 (1), 61-70 (2016).
