Abstract
Kväveoxid (NO •) är en liten radikal, som förmedlar flera viktiga cellfunktioner hos däggdjur, bakterier och växter. Trots förekomsten av ett stort antal metoder för att detektera NEJ • in vivo och in vitro, är mycket utmanande den realtidsövervakning av NO • vid enkelcellnivån. De fysiologiska eller patologiska effekterna av NO • bestäms av den verkliga koncentrationen och uppehållstid för denna radikal. Följaktligen metoder som gör att den encelliga detektering av NO • är mycket önskvärda. Nyligen utökade vi pallen av NO • indikatorer genom att införa enda fluorescerande protein-baserade genetiskt kodade kväveoxid (NO •) prober (geNOps) som direkt svara på cellulära NO • fluktuationer och därmed tar detta behov. Här visar vi användning av geNOps att bedöma intracellulära NO • signaler som svar på två olika kemiska NO • -liberating molekyler. Våra resultat also bekräfta att nyframställd 3- (2-hydroxi-1-metyl-2-nitrosohydrazino) -N-metyl-1-propanamin (NOC-7) har en mycket högre potential att framkalla förändringar i intracellulära NO • nivåer jämfört med den oorganiska NO • donator natriumnitroprussid (SNP). Vidare tvåfärgad levande cell imaging med hjälp av gröna geNOps (G-geNOp) och kemiska 2+ indikatorn Ca fura-2 utfördes för att visualisera den snäva reglering av Ca2 + -beroende NO • formation i enstaka endotelceller. Dessa representativa experiment visar att geNOps är lämpliga verktyg för att undersöka realtidsgenerering och nedbrytning av encelliga NO • signaler i olika experimentella uppställningar.
Introduction
Vi har nyligen utvecklat en ny klass av genetiskt kodade fluorescerande NO • prober, kallade geNOps 1. Dessa sensorer består av en helt enkelt byggd, bakterier härledda, NEJ • bindande domän 2, som är konjugerad till en distinkt fluorescerande protein (FP) variant 3 (cyan, grönt eller orange FP). NO • bindning till icke-heme järn (II) centrum 4 inom de geNOps omedelbart minskar fluorescensintensiteten 1. Viktigt, återvinner geNOps fluorescens snabbt och fullständigt när intracellulära NO • nivån sjunker 1. Följaktligen geNOps tillåter realtid avbildning av (under) cellulära NO • fluktuationer. Även NO • avkänning mekanism för geNOps förblir oklara så länge har de visat sig vara utmärkta NO • reportrar, och därmed har styrkan att öppna upp en ny era av polykromatisk, kvantitativ NO • bioimaging med höga rumsliga och tidsmässiga resolutioner 1, 5. Andra tillgängliga fluorescerande Nej • sonder baserade på små kemiska föreningar, som måste laddas in i celler, och irreversibelt modifierade av NO • 6. Ytterligare nackdelar med NO • känsliga små fluoroforer är deras potentiella cytotoxicitet och relativt låg specificitet som gör det svårt att använda dem på ett tillförlitligt, analytisk och avgörande sätt 7, 8, 9. Även om effektiv användning av genetiskt kodade fluorescerande prober kräver effektiva genöverföringstekniker har FP-baserade genetiskt kodade sensorer framträtt som oumbärliga verktyg som har revolutionerat vår förståelse av den inre funktionen hos celler 10, 11. Innan utvecklingen av den inre FP-baserade geNOps, en Förster resonansenergiöverföring (FRET) -baserade NO • sensor, benämnd NOA-en 12, konstruerades. Sato et al. utformat denna sofistikerade sond som består av två subenheter av NO • -känsliga lösligt guanylatcyklas (SGC), båda konjugerade att gräma-baserade sensorer rapporterar cykliskt guanosinmonofosfat (cGMP) -nivåer 12. Eftersom denna sond svarar på cGMP, endast indirekt känner det intracellulära NO • fluktuationer 12. Även NOA-1 svarar på NO • höjder i nano molar intervall, har detta verktyg inte använts ofta så långt, förmodligen på grund av begränsningar när det gäller tillgänglighet och användbarhet av denna skrymmande tvådelad sensor.
Mångsidiga funktioner av NO •, som påverkar grundläggande biologiska processer har väl karakteriserade 13, 14. Många studier visat att NO • concentration inom celler och underdomäner bestämmer cellens öde i hälsa och sjukdomar 14, 15, 16. I däggdjur, NO • huvudsakligen genereras enzymatiskt i olika celltyper genom väl karakteriserade kväveoxidsyntas (NOS) familj 17. Hittills har tre isoformer av NOS beskrivits 18, 19, 20; dessa är de Ca2 + / calmodulin-beroende endotel NOS (eNOS eller NOS-3) 18 och neuronal NOS (nNOS eller NOS-1) 19, och Ca2 + / calmodulin oberoende konstitutivt aktiv inducerbart NOS (iNOS eller NOS- 2) 20. Dessutom har förekomsten av mitokondriell NOS (mtNOS) också föreslagits 21. Dock är mtNOS betraktas som en splitsvariant av nNOS och därför inte separat klassificeras som en isoform 21. En annan isoform, bortsett från dem i däggdjursceller, är den så kallade bakterie NOS (bNOS), främst i grampositiva bakterier 22. Den enzymatiska produktionen av NO • är mycket kontrollerad och beror på tillgängligheten av flera kofaktorer såsom nikotinamidadenindinukleotid-fosfat (NADPH), flavinadenindinukleotid (FAD), tetrahydrobiopterin (BH4), molekylärt syre och L-arginin 17. Den katjoniska aminosyran L-arginin är substratet som omvandlas till L-citrullin på NO • produktion 17. Förutom den i hög grad reglerad enzymatisk alstring av NO • Det har postulerats att radikalen kan reduceras icke enzymatiskt från nitrit pooler från mitokondrier under hypoxiska betingelser 23. När NO • produceras i en cell, kan det fritt diffundera genom biomembran 14,ref "> 15. Men mycket kort halveringstid denna radikala bestäms huvudsakligen av miljöförhållanden och olika vägar och kemiska reaktioner försämra NO • nivåer 24 effektivt. Så småningom bildandet, diffusion och nedbrytning av NO • beror på olika miljöparametrar som bestämmer den effektiva koncentrationen av den starkt biologiskt aktiva molekylen 24.
Den geNOps tekniken gör det möjligt att direkt detektion av (sub) cellulär NO • fluktuationer 1 och är därför lämplig att ny undersökning, och nyligen upptäcka mekanismer som ansvarar för uppbyggnad och nedbrytning av cellulära NO • signaler. Här ger vi enkla protokoll och representativa resultat för användning av geNOps att visualisera exogent framkallat och endogent genererade NO • profiler, på nivån av enskilda celler. Vidare kan geNOps teknik anpassas för apkomplikation i andra cellmodellsystem för att studera de komplexa mönster av NO • bildning, diffusion och nedbrytning som svar på olika cellulära stimuli och påfrestningar.
Protocol
1. Framställning av kemiska buffertar och lösningar
- Bered en lagringsbuffert innehållande 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 2,6 mM NaHCOs 3, 0,44 mM KH 2 PO 4, 0,34 mM Na 2 HPO 4, 10 mM D- glukos, 2 mM L-glutamin, 1 x MEM-vitaminer, 1x MEM aminosyror, 1% pen strep, och en% amfotericin B. Lös upp alla komponenter i destillerat vatten och rör om bufferten för 20 min med användning av en magnetisk omrörare vid rumstemperatur. Justera pH till 7,44 med användning av 1 M NaOH. Efter droppvis tillsats av NaOH, mäta pH med användning av en pH-meter under ständig omrörning.
- Förbereda en fysiologisk Ca2 + -innehållande buffert, som består av 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glukos, och 10 mM HEPES. Justera pH till 7,4 med användning av NaOH såsom beskrivs i steg 1,1.
- Förbered en Ca2 + -fri buffert som består av samma ingredienserenligt förteckningen i steg 1,2. Använd 1 mM EGTA i stället för 2 mM.
- Solubilisera Fura-02:00 i DMSO för att erhålla en 1 mM stamlösning. Alikvotera stamlösning i tätt tillslutna ampuller och förvara vid -20 ° C i upp till en månad. Om fryst, tillåta stamlösningen ekvilibrera vid rumstemperatur under minst 1 h i skydd mot ljus. Späd Fura-2:00 förrådslösning i en ml lagringsbuffert (steg 1,1) för att erhålla en slutlig koncentration av 3,3 pM.
- Förbereda en ml av en 100 mM histamin förrådslösning i destillerat vatten (pH 7,0). Späd 100 mM histamin stamlösning i 100 ml Ca2 + -innehållande fysiologisk buffert till en slutlig koncentration av 100 | iM histamin.
- Solubilisera Nω-nitro-L-arginin (L-NNA) i 100 ml kalciuminnehållande fysiologisk buffert för att erhålla en slutlig koncentration av 300 ^ M. Lagra lösningarna vid 37 ° C vattenbad i minst en timme tills L-NNA är fullständigt upplöst.
- Solubilisera 10 mg NOC-7 i destillerat water (pH 7,0) för erhållande av en 10 mM förrådslösning. Alikvotera förrådslösning i små alikvoter i tätt förslutna vialer och lagra omedelbart vid -70 ° C. Späd NOC-7 stamlösning i en fysiologisk buffert för att erhålla en slutlig koncentration av 10 | iM NOC-7.
OBS: NOC-7 är en liten kemisk förening som spontant frisätter NO med en kort halveringstid. förbereda alltid arbets buffertar som består NOC-7 strax före varje experiment. - Gör en 1 mM natriumnitroprussid (SNP) lösning i en fysiologisk kalciumbuffert och förbereda en 10 iM utspädning.
OBS: förbereda alltid små mängder (~ 10 ml) av NO-donatorlösningar på grund av den snabba nedbrytningshastigheten. - Förbered en fosfatbuffrad lösning (PBS) bestående av 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,2 mM Na 2 HPO 4, och 1,5 mM KH 2 PO 4. Justera pH-värdet till 7,44 med NaOH / HCl.
2. Cellberedning
OBS! I order att uppnå en likformighet i utförandet av mätning av kväveoxid (NO •) i enstaka celler med användning av geNOps, celler måste förinkuberas med en järn (II) / vitamin C innehållande buffert före imaging experiment för att återställa Fe2 + inom NO • -bindande domänen av NO • -probes. Vid EA.hy926 och HEK293-celler, inkubation under 20 minuter med järn (II) booster lösning leder till full aktivering av NO • sensorer.
- Seed 5,5 x 10 5 EA.hy926 eller HEK293-celler för nästa dag eller 3,5 x 10 5 celler för dagen efter nästa dag, den 30-mm mikroskop täckglas i en brunn i en 6-brunnar. Inkubera cellerna vid 37 ° C i en fuktad miljö med 5% CO2.
OBS! Detaljerad information om adenoviral infektion av däggdjursceller och viruskonstruktion har beskrivits av Zhang et al. 25. Detta steg gäller inte för HEK 293-celler som stabilt uttrycker G-geNOp. - Ta fetalt kalvserum (FCS) och antibiotikafritt Dulbeccos Eagle modifierat medium (DMEM) och tillsätt adenoassocierat virus typ 5 (AAV5) vektor som bär den gen som kodar för G-geNOp (MOI: 500 för EA.hy926 celler gav nästan 100 % positiva celler; MOI: 1 är effektiva för HEK293-celler).
OBS: Användning av adenoassocierade virala vektorer tilldelas riskklass 2. skyddsnivå 2 inneslutning allmänhet krävs för arbete med denna vektor. Om nödvändigt, kan virusinfektion också utföras i FCS innehållande medium. Alternativt kan celler transfekterades transient med användning av lipidbaserade bärare 1. - Avlägsna odlingsmediet och tvätta cellerna med förvärmd (37 ° C) PBS. Tillsätt 1 ml DMEM / AAV5 medium på varje brunn under 1 timme. Detta steg gäller inte för HEK 293-celler som stabilt uttrycker G-geNOp.
- Tillsätt 1 ml 20% FCS-innehållande DMEM på varje brunn till en slutlig koncentration av 10% FCS. Ta inte bort AAV5-innehållande media från cellerna. gently gungbräda plattan för att homogenisera mediumet inom brunnarna. Inkubera cellerna under 48 h vid 37 ° C i en fuktig miljö med 5% CO2. Detta steg gäller inte de HEK 293-celler som stabilt uttrycker G-geNOp.
- Efter 48 timmar, tvätta cellerna med förvärmda PBS. Därefter tillsätt 2 ml förvärmda lagringsbuffert (avsnitt 1.1) till varje brunn och inkubera cellerna vid rum RT under minst en timme skyddas från ljusstrålning.
- Ersätta lagringsbufferten med 1 ml / brunn av järn (II) booster lösning vid rumstemperatur (RT). Inkubera cellerna för exakt 20 minuter i mörker.
OBS: inte överstiga eller minska den optimala inkubationstiden eftersom det kan påverka responsen i NO • sonder. - Tvätta cellerna en gång med lagringsbuffert och inkubera varje brunn med 2 ml lagringsbuffert under åtminstone 2 h vid RT för att tillåta cellerna att komma i jämvikt.
- Ersätta förvaringsbuffert med 3,3 | iM Fura-2:00 i 1 ml lagringsbuffert under 45 min vid RT, skyddadfrån ljus.
- Tvätta cellerna två gånger med lagringsbuffert och inkubera, än en gång under minst 30 min för att tillåta cellerna att komma i jämvikt.
3. Levande cell imaging av NO • och Ca 2 + -signaler i enskilda celler
- Fäst en 30 mm täckglas belagda med EAhy.926 eller HEK293-celler (från steg 2,1) i en metall perfusion kammare och placera den på mikroskopet. Ansluta inflödet röret till buffertreservoarer och utflödet till en vakuumpump. Säkerställa en konsekvent flöde och undvika tömning av täckglaset.
- Starta gravitationsdrivna perfusion med fysiologisk kalciumbuffert (från steg 1,2) med användning av en halvautomatisk perfusionssystemet.
OBS: Ett sådant system består av buffertreservoarer, respektive rör, magnetventiler som elektroniskt styrda och en vakuumpump (se figur 1B). Flödeshastigheten kan sträcka sig från 1 till 3 ml / min, beroende på höjden av perfusion reservoarer. För konsekventa lokala läkemedels tillämpkatjon, bör flödeshastigheten för alla använda reservoarer vara ungefär lika. Detta bör testas före avbildningsexperiment. Tänk på att endotelceller svarar på ökad skjuvspänning som kan induceras av rigorös perfusion. - Slå på avbildningssystemet och tillåta uppvärmning av alla anordningar för 30 min.
- Definiera avbildnings inställningar med respektive program. Välj excitationsvåglängd 340 nm och 380 nm för fura-2 avbildning och 480 nm för spännande G-geNOp. För att minimera fluorescens blekning öka kamera binning till fyra och minska exciteringsintensitet och exponeringstider. Se även steg 3,6-3,8.
OBS: Imaging inställningar och parametrar beror på den utrustning som används, fura-2 laddningseffektivitet och G-geNOp uttrycksnivåer. - Välj avbildningsregionen genom att flytta xyz-tabellen över mikroskopet förrän flera fluorescerande celler är i fokus. Sedan definiera områden av intresse (ROI) via respektive verktyg. Rita regioner som täcker flera hela single fluorescerande celler per bildfältet manuellt. Dessutom definierar en bakgrundsregion av liknande storlek.
OBS: När bilderna har förvärvats och lagras ROI kan också definieras nyligen efter avbildningsprocessen för vidare analys med hjälp av respektive bildanalys programvara (se Materials List). - Börja samla in uppgifter om en inverterad och avancerad fluorescerande mikroskop med en motordriven prov scen och en monokromatisk ljuskälla. Alternativt excite vid 340 nm och 380 nm för Fura-02:00 och 480 nm för G-geNOp respektive. Ställ respektive exponeringstider så att alla kanaler, är en tydlig fluorescenssignalen detekteras över tiden. Se även steg 3,4.
OBS: Detta beror på intensiteten av exciteringsljuset och kamerans binning. Till exempel använder 15% intensitet av excitationsljuset, en kamera binning av 4 och 150 ms för 340 nm, 50 ms för 380 nm och 300 ms för 480 nm. Se även steg 3,4. - Samla in det emitterade ljuset vid 510 nm för fura-2 / AM, 520 nm för G-Genop med hjälp av en charge-coupled device (CCD) kamera med lämpliga filter bestående av 500 nm matar, en 495 nm dikroisk och 510-520 nm emitter. Record en total ram varje 3 sek.
- Spela in de första minuterna (vid behov upp till tre min) i fysiologisk Ca 2 + buffert (1,2) för att erhålla baslinjen för respektive fluorescenssignaler över tiden.
- När en stabil baslinje fluorescens observeras, växla till 100 iM histamin eller ATP (1 | iM eller 100 M) innehållande fysiologisk Ca2 + buffert för att stimulera celler i 3 min.
OBS: EA.hy926 celler som svarar på de agonister visar en kraftig ökning av fura-2-förhållande (fluorescens exciteras vid 340 nm dividerat genom fluorescens exciteras vid 380 nm) och en tydlig minskning av G-geNOp fluorescenssignal. - Växla tillbaka till den fysiologiska Ca 2 + buffert utan histamin eller ATP och L-NNA under 5 min för att avlägsna föreningarna från cellerna. Det här steget kan förlängas tills fluoresscensförändringar återvinns fullständigt.
- Administrera 10 iM NOC-7 i fysiologisk Ca2 + buffert i 2 minuter med hjälp av perfusion systemet. NO givaren påverkar starkt G-geNOp fluorescens som vanligtvis minskar med> 20% som svar på 10 iM NOC-7. I EA.hy926 celler NOC-7 effekt är cirka 3 gånger starkare jämfört med agonistinducerad G-geNOp fluorescens släcka.
- Tvätta ur NO • -releasing förening för ungefär 10 minuter med fysiologisk Ca2 + buffert och stoppa inspelningen när basal fluorescens återvinns.
4. Dataanalys
- Export förvärvade genomsnittliga fluorescensintensitetsdata för enskilda celler över tiden, till dataanalysprogramvara.
- Subtrahera respektive bakgrundsvärden och beräkna förhållandet mellan 340 nm med 380 nm av respektive fura-2 signalerna för varje enskild cell med tiden.
- Subtrahera bakgrundsvärden för G-geNOp kanal för att få själva fluorescence intensitet av NO sond (F) över tiden med någon beräkningsprogram.
- Ta baslinjen fluorescensvärden som F 0 (F 0 är fluorescensen av NO-sonden över tid utan stimulering). Se även steg 4,5 och figur 1C.
- Beräkna en funktion över tiden för fluorescens blekningseffekter med hjälp av följande ekvation: F 0 = F initial • exp (-K • Time) + F platå. F initialt: maximal fluorescenssignal när avbildning startas; K: hastighetskonstanten för fluorescens blekning över tiden; F platå: fluorescens minst nås genom blekning med tiden; Se även steg 4.3- 4.4 och figur 1C.
OBS: För approximation kan alla fluorescensvärden över tiden före och efter cellstimulering användas. Ytterligare detaljer anges av Bentley et al. 27. - Att normalisera G-geNOp signal över tiden, beräkna en-F / F0 (stegen 4,3-4,5). Se figur 1C och 1D.
Representative Results
Visualisering av Encelliga NO • Profiler som svar på övergående Applied NO-givare
Vi använde en HEK-cellklon som stabilt uttrycker G-geNOp (Figur 1A), för att visualisera nej • signaler på en enda cell nivå som svar på två olika NO-frigörande små kemiska föreningar, NOC-7 och SNP. NO • givare följd tillämpas på och avlägsnas från celler under avbildning med en gravitationsbaserat perfusion system som säker kontinuerligt flöde (Figur 1B). Alla celler som uttrycker G-geNOp med olika intensitet visade en tydlig minskning av fluorescens som svar på NOC-7 och SNP (Figur 1C), vilket tyder på snabb NO • ackumulering i celler vid tillsats av NO • givarna. Normaliserade fluorescens signaler (1-F / F 0) visade att både NO • givare framkallade homogen ²cellula²r NEJ • höjder som helt återställd efter washout av NO • -releasing föreningar (Figur 1D). Men 10 iM SNP inducerade endast 50% av den cellulära NO • signal (9,63 ± 1,05%, n = 3/38) som nåddes med 10 iM NOC-7 (18,10 ± 1,20%, n = 3/38, p < 0,0001). För att uppnå lika intracellulära NO • nivåer med både NO • givare, var en koncentration av 1 mM SNP krävs (figurerna 1C, 1D).
Därefter testade vi förmågan nyberedd kontra passerat NOC-7 för att höja intracellulära NO • nivåer i HEK-celler. För detta ändamål framställde vi fyra experiment buffertar innehållande 5 iM NOC-7. NO • donator antingen lagt nyligen strax före mätning, eller hålls inom reservoarer för en timme, två timmar, och 3 h vid rumstemperatur före mätning. De olika buffertar varandra tillämpas och avlägsnas fROM G-geNOp uttryckande celler med användning av ett perfusionssystem (Figur 2B). Detta tillvägagångssätt avslöjades stabiliteten hos vattenhaltiga NOC-7 lösningar som, som väntat, uppvisade minskad kapacitet över tiden för att höja intracellulära NO • nivåer (figurerna 2A, 2C). Intressant NEJ • återvunna signalerna betydligt snabbare vid avlägsnande av utgångna buffertar, jämfört med den intracellulära NO • svar som framkallades av färsk NOC-7 (figur 2C), kanske indikerar vidhäftning av intakta NO • -liberating molekyler på cellkomponenter .
Samtidig Visualisering av Ca2 + och NO • Signaler i Single endotelceller
För att studera Ca 2 + -triggered NO • bildning i endotelceller, den vanligen använda endoteliala immortaliserad cell-surrogat, EA.hy926-cellinje, var transiently transfekterade med G-geNOp och laddad med Fura-2 / AM (se protokoll 2,8). Transfektion gav cirka 10% av G-geNOp positiva endotelceller (n = 6, figur 3A), vilket är tillräckligt för att spela in Ca2 + -evoked NO • produktionen på nivån av enstaka endotelceller. Emellertid uppnådde vi nästan 100% G-geNOp positiv EA.hy926 celler med användning av en adeno-associerad viral vektor (n = 6; se protokoll 2,2). Före flerkanaliga mätningar, cellerna inkuberades under 20 min vid rumstemperatur i lagringsbuffert bestående L-NNA, en potent irreversibel NOS-inhibitor 26. Kontrollceller hölls i samma buffert lagring utan L-NNA (se protokoll 1,1) (figur 3B). Behandling av kontrollceller med histamin, en potent inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3) -generating agonist, omedelbart förhöjd cytosoliska Ca 2 + nivåer följt av en gradvis ökning av intracellulär NO • tills agonisten var removed (figurerna 3C, 3D). Celler förbehandlade med NOS-hämmare visade liknande cytosoliska Ca 2 + -signaler, medan den intracellulära NO • nivå var nästan opåverkad som svar på histamin (figur 3E). EA.hy926 celler som uttrycker G-geNOp behandlades också med 1 | iM och 100 | iM av IP 3 -generating agonist ATP för att testa huruvida geNOps är lämpliga för att övervaka nej • signaler som svar på både låg fysiologisk och supra-fysiologiska koncentrationer av en agonist (Figur 3F). I endotelcellinje 1 pM ATP framkallade en tydlig cytosolisk NO • signal, vilket var ungefär hälften av den signal som erhålls genom 100 pM ATP (Figur 3F).
Figur 1: Intracellulära NO profiler som svar på olika NO-Liberati ng molekyler. (A) brett fält bilder av HEK-celler som stabilt uttrycker cytosoliskt G-geNOp. Skalstreck = 20 | im. (B) Schematisk illustration av en allvar baserade halv-automatiska perfusion system för kontrollerad applicering och borttagning av NOC-7 och SNP. (C) representant (av 3 oberoende experiment) icke-normaliserade encelliga fluorescensintensitet spår i godtyckliga enheter som funktion av tiden av HEK-celler som stabilt uttrycker cytosoliskt G-geNOp som svar på 10 | iM NOC-7, 10 pM SNP, och 1 mM SNP. Svart fet kurva representerar den genomsnittliga kurvan för 26 encelliga spår (ljusgrå kurvor). Prickade svarta kurvan representerar F 0, som användes för normalisering. (D) Normaliserade och inverterade enstaka spår (1-F / F 0, ljusgrå kurvor), och menar kurva (svart fet kurva) med tiden som svar på 10 iM NOC-7, 10 iM SNP, och 1 mM SNP utvinns ur panel C.es / ftp_upload / 55.486 / 55486fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Stabilitetstest av NOC-7 med stabilt G-geNOp uttrycker HEK celler. (A) representant NO • koncentration-responskurvan över tiden stabilt G-GeNOps uttrycker HEK celler vid applicering av färska och gamla NOC-7 buffertlösningar. Alla NOC-7 innehåller buffert bereddes initialt med en slutlig koncentration av 5 pM med användning av samma stamlösning (50 mM). Den förflutna tiden för respektive lösningar efter beredning tills avbildnings uppgår till 1 tim, 2 tim, och tre timmar som indikerat. (B) Schematisk illustration av en allvar baserade halv-automatiska perfusion system följd lägga till och ta bort NOC-7 innehåller lösningar under avbildning. (C) Temporal korrelationercellulär NO • signaler som svar på nyligen beredd och gamla NOC-7 buffertar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Samtidig flerkanalig avbildning av NO • och Ca 2 + -signaler i enstaka EA.hy926 celler. (A) Representativa brett fält fluorescensbilder av EAhy.926 celler som uttrycker G-geNOp (till vänster) som är laddade med fura-2 / AM (mitten och höger sida). Skalstreck = 20 | im. (B) Schematisk illustration av behandlingen av EAhy.926-celler med 500 | iM Nω-nitro-L-arginin (L-NNA) under 20 min i en sex-brunnsplatta före mätningen. (C) representant tidsförloppet av en samtidig registrering av fura-2 (excitation: 340 nm / 380 nm Emission: 510 nm) och G-geNOp signaler (excitation: 480 nm; emissions: 520 nm) som svar på 100 pM histamin. Såsom indikeras histamin avlägsnades efter 3 min med användning av ett perfusions-system. (D) Kurvor representerar samtidiga inspelningar av cytosoliskt Ca2 + (fura-2 förhållandesignaler F 340 / F 380 är grå heldragen linje) och NO • (normaliserad och inverterad kurva, en-F / F 0 är grön heldragen linje) signaler med tiden för en enda fura-2 / aM laddad endotelcell transient uttryckande G-geNOp. Cellerna stimulerades med 100 | iM histamin under 3 min i en Ca 2 + (2 mM CaCl2) innehållande buffert (n = 03/08). (E) Representant samtidigt registrerade Ca 2 + (grå heldragen linje) och NO • (grön heldragen linje) signaler över tiden av ett EA.hy926 cell som var förbehandlade med 500 pM Nω-nitro-L-arginin (L-NNA) före mätning (n = 03/12). Celler behandlades med 100 | iM histamin i närvaro av 2 mMCa2 +. (F) De genomsnittliga kurvor som representerar cytosoliska NO • signaler i gensvar på en pM ATP, följt av en andra cell stimulering med 100 pM ATP. Staplarna representerar medelvärden ± SD av maximala G-geNOp signaler som svar på en pM ATP (vit stapel) och 100 pM ATP (grön stapel) av 4 oberoende experiment; p <0,001 vs. 1 pM ATP. P-värdet beräknades med användning av ett oparat t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Sedan upptäckten av NO • som en viktig signalmolekyl i biologi 28, har särskilda realtidsmätning av den radikala i enskilda celler, vävnader och hela djur med hög upplösning i en genomförbar och tillförlitligt sätt har strävat efter. Här rapporterar vi tillämpningen av nyutvecklade genetiskt kodade fluorescerande NO • sonder (geNOps) som möjliggör exakt live-cell imaging av NO • signaler med brett fält fluorescensmikroskopi en.
Att kringgå arbetade och invasiva transfektion förfaranden HEK-cellklon som stabilt uttrycker grönt fluorescerande G-geNOp användes för att kvantifiera exogent genererade encelliga NO • profiler. Som HEK-celler som normalt inte producerar NO • endogent 29, är denna celltyp lämpliga för genereringen av en geNOp-baserad sensor-cellinjen, som kan vara användbar för många andra applikationer i sam-odlingsbetingelsermed NO • producera primära celler eller till och med i levande djur 30. Men i denna studie visar vi kapaciteten hos olika NO • -liberating föreningar av olika koncentrationer och stabiliteter, att framkalla intracellulära NO • signaler med hjälp av G-geNOp uttryck HEK cellmodell. Våra data visar att NO • -donor koncentration, kvalitet och appliceringsmetoden så småningom bestämma mönster av intracellulära Nej • profiler. Sådan information är nödvändig för in situ-farmakokinetiska karakterisering av olika NO • givare, som är indikativa för flera sjukdomar. I synnerhet har geNOps visat sig stabilt svara på flera upprepade ansökningar av NO • -donor pulser under en mycket lång tid en. Följaktligen experiment med användning av NO • -liberating föreningar som presenteras häri, tillåter halv kvantitativa slutsatser om de olika amplituder och kinetik respektive cellulär NO226; signaler (fig 1 och 2).
Även om stabilt uttryck HEK-cellklon kommer troligen från en enda cell, var en bred heterogenitet G-geNOps uttrycksnivåer observerades (Figur 1). Detta är ett vanligt inslag i stabila cellkloner som transkriptionen av den (genomet integrerade) genen av intresse är under kontroll av många faktorer, såsom olika miljöpåfrestningar 31 som påverkar celltillväxttakten 32 och cellcykeln status 33. De enkels FP-baserade geNOps är icke-kvotmetriska prober och följaktligen NO • -inducerad förlust av fluorescensintensitet ökar med geNOp expressionsnivån 1. Följaktligen är en förutsättning för att kvantifiera cellulära NO • signaler särskilt i händelse av en jämförande analys normalisering av geNOps signaler. Som framgår av vår senaste studie, en strikt linjär korrelation Bindexets basalfluorescensintensiteten hos geNOps och styrkan av NO • -inducerad fluorescensdämpning över ett brett område av fluorescensintensiteter har funnit en. Detta är ett viktigt inslag i geNOps för absolut kvantifiering av cellulära NO • signaler. Som visas i figur 1, normalisering av G-geNOps signaler som svar på NOC-7 och SNP avslöjade homogena NO • signaler i olika HEK celler från samma tallrik, vilket indikerar att HEK celler inte varierande med avseende på deras förmåga att ta upp och försämra NO • radikal som härstammar från NO • donator. Däremot använder geNOps i HeLa-celler visade tydliga heterogeniteter av cellulära NO • signaler mellan olika celler som svar på NOC-7. Dessa skillnader pekar på celltyp-specifika NO • metabolism och nedbrytningshastigheten, vilket kan ha flera konsekvenser i cell fysiologi och patologi, och kan avslöjade med hjälp av geNOps teknik.
Ändå två viktiga egenskaper hos geNOps måste noggrant övervägas för korrekt användning av sensorerna och tolkningar data: i) geNOps kräver tillräcklig järn (II) till fullo svara på NO • 1 och ii) beroende på FP-varianten, geNOps kan vara pH känsliga 1. Här beskriver vi ett protokoll som har befunnits vara lämplig för icke-toxisk järn (II) komplettering av geNOps, som uttrycks i endera HEK, HeLa eller EA.hy926 celler (se protokoll 2,6). Även om det har visats att cell behandling med järn (II) / vitamin C påverkade inte cellmorfologi, cell viabilitet och metaboliska aktiviteten hos celler 1, kan det vara nödvändigt att optimera detta viktiga steg för andra celltyper och vävnader. Men i vissa experimentella förhållanden, kan kravet på järn (II) laddar begränsa tillämpligheten av geNOps. Särskilt har det visat sig att askorbat kan minska NO • 35 och askorbat-järn (II) komplexen kan rensar NO • 36, 37. Dessutom kan överskott av järn (II) och askorbat inducera inflammatoriska svar 39 och koppla isär eNOS 41. Sådana effekter måste beaktas vid användning av geNOps teknik. Det har visat sig att under vissa experimentella betingelser, är den intracellulära pH kraftigt påverkat 34, som har potential att påverka geNOps fluorescens en. Notably, cyan och gröna geNOps varianter är relativt pH-känsligt som visar en minskning av fluorescens vid surgöring en. Därför kan akuta förändringar av (sub) cellulär pH simulera falska Nej • signaler vid användning av pH-känsliga geNOps. Som föreslagits i vårt tidigare arbete, den parallella användningen av NO • okänsliga geNOps (geNOps mut) som negativ controls rekommenderas att dissekera verklig cellulär NO • signalen från pH ändrar en. Dessutom cellulära pH-förändringar kan inspekteras med hjälp av pH-sonder såsom Sypher 34.
Vidare visualiseras vi den endogena enzymatiska NO • bildning som svar på en fysiologisk Ca 2 + -mobilizing agonist i endotelcellen surrogat EA.hy926. Den EA.hy926 cellinje är ett ofta använt modellsystem konsekvent uttrycka eNOS 38. Användning av geNOps transient uttryckta i EA.hy926 celler, bekräftade att IP3 medierad Ca2 + signaler framkalla djupgående NO • bildning i denna celltyp, som nästan helt blockerad av L-NNA. För att temporärt korrelera Ca2 + med nej • signaler, var G-geNOp-uttryckande celler laddade med UV-exciterbara kemisk Ca2 + -indicator fura-2 / AM. Den spektrala separationen av den Ca2 + bundet och obundet fura-2 fluo rescence från G-geNOp signal kan lätt uppnås med kommersiellt tillgängliga filteruppsättningar 40. Imaging båda sonderna avslöjades att Ca2 + -triggered enzymatisk NO • bildning sker mycket långsammare jämfört med den cytosoliska Ca 2 + ökning av denna typ endotelceller. Liknande kinetik encelliga NO • signaler i endotelceller från bovin lungartären vid cellbehandling med IP 3 -generating agonist bradykinin, samt skjuvspänningar har rapporterats med hjälp av NOA-1, en indirekt starkt NEJ • -känsliga sensor 12 . Följaktligen är dessa uppgifter understryka att Ca2 + -evoked eNOS-härledd NO • bildning kräver en viss starttid tills hela enzymatisk aktivitet har uppnåtts. Även om kinetiken för cellulär NO • bildning, diffusion och nedbrytning kan utvinnas ur andra uppgifter, till exempel spänningsbaserade mätningar av NO • inducerad kärl avkopplingss = "xref"> 26, den stora fördelen med fluorescerande Nej • prober är att de direkt omvandla cellulära NO • fluktuationer i synliga signaler i realtid. Därför, imaging cellulär NO • signaler med geNOps ger hög rumslig och tidsmässig upplösning, och erbjuder unika möjligheter i (åter) undersöker (sub) cellulär NO • homeostas. Exempelvis avbildnings eNOS shuttling 42 i kombination med geNOps tekniken i enkla endotelceller kan vara lämpliga för att korrelera NO • bildning med subcellulära lokalisering och translokation av NO • -producerande enzym eller andra relevanta proteiner såsom kalmodulin och caveolin 43.
Här beskriver vi praktiskt tillämpning av G-geNOp uttrycker HEK och EA.hy926 celler för att visualisera exogent och endogent genererad cellulära NO • signaler på encelliga nivå och i realtid på en konventionell brett fält fluorescens microscope. Våra data antyder att geNOps är lämpliga att specifikt spår (under) cellulära NO • dynamik under olika experimentella förhållanden med hjälp av alla typer av intressanta celltyper.
Disclosures
EE, MW, RM och WFG, anställda vid medicinska universitetet i Graz, har lämnat in en brittisk patentansökan (patentansökan nr WO2015EP74877 20.151.027, prioritet nummer GB20140019073 20.141.027) som beskriver delar av forskningen i detta manuskript. Licenser i samband med detta patent tillhandahålls till Next Generation Fluorescence Imaging (NGFI) GmbH ( http://www.ngfi.eu/ ), en spin-off-företag av den medicinska universiteten av Graz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.20 | sodium chloride |
| KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.1 | potassium chloride |
| CaCl2·2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T885.1 | calcium chloride dihydrate |
| MgCl2·6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | magnesium chloride hexahydrate |
| HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.3 | 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8551.1 | sodium hydrogencarbonate |
| KH2PO4 | Merck, Darmstadt, Germany | 104873 | potassium dihydrogen phosphate |
| Na2HPO4·2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.1 | sodium hydrogenphosphate dihydrate |
| D(+)-Glucose monohydrate | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | >99.5%; for cell culture, endotoxin free |
| EGTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3054.2 | ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6771.1 | sodium hydroxide |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4625.1 | hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N) |
| DMSO | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | dimethyl sulfoxide; highly polar, aprotic organic solvent |
| L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | G2128 | (S)-2-Aminoglutaric acid |
| DMEM, low glucose | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | D5523 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose; with 1,000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| MEM Vitamin solution (100x) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11120037 | 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
| MEM Amino acids solution (50x) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11130036 | 50x the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122.00 | antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures |
| Amphotericin B | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15290026.00 | Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi |
| FCS | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270106 | Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin |
| PBS, pH 7.4 | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010031.00 | phosphate-buffered saline |
| Fura-2 (AM) | Teflabs, Austin, TX, USA | 102 | fluorescent cytosolic calcium indicators |
| Histamine dihydrochlorid | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | H7250 | 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist |
| Nω-Nitro-L-arginine | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | N5501 | N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA; inhibitor of nitric oxide synthase |
| NOC-7 | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 487952 | 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release |
| Sodium nitroprusside dihydrate | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-203395A | sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound |
| 30 mm Cover slips | Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany | 41001130 | glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30 mm, (VE: 100 pcs.) |
| Iron(II) booster solution | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/ |
| G-geNOp plasmid | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product/g-genop/ |
| G-geNOp AAV5 | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/ |
| G-geNOp sensor cell line | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/ |
| HEK293A cell line | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R70507 | subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) |
| EA.hy926 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany | CRL-2922 | somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549 |
| TILL iMIC | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | digital microscope |
| Polychrome V monochromator | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | ultra fast switching |
| AVT Stingray F145B | Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany | n.a. | Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b |
| alpha Plan Fluar 40 | Zeiss, Göttingen, Germany | n.a. | 40X objective |
| dichroic filters | Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA | n.a. | GFP emitter 514/3 nm (515dcxr) |
| ValveBank8 Controller | AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA | 01-08 | programmable perfusion system control unit |
| BVC control | Vacuubrand, Wertheim, Germany | 727200 | Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system |
| ImageJ software | NIH Image | Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome |
References
- Eroglu, E., et al. Development of novel FP-based probes for live-cell imaging of nitric oxide dynamics. Nat Commun. 7, 10623 (2016).
- Bush, M., et al. The structural basis for enhancer-dependent assembly and activation of the AAA transcriptional activator NorR. Mo. Microbiol. 95 (1), 17-30 (2015).
- Cranfill, P. J., et al.
- D'Autréaux, B., Tucker, N., Spiro, S., Dixon, R. Characterization of the Nitric Oxide-Reactive Transcriptional Activator NorR. Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins, Part B. Poole, ed.P. oole,R. .K. .,(ed)., 437, 1st edition, Elsevier textbooks, s.l. 235-251 (2008).
- Strack, R. Sensors and probes: Yes to genetically encoded NO• sensors. Nat Methods. 13 (4), 288 (2016).
- Auten, R. L. Response to 'The use of diaminofluorescein for nitric oxide detection: Conceptual and methodological distinction between NO and nitrosation. Free Radic. Biol. Med. 50 (12), 1812 (2011).
- Sivaraman, G., Anand, T., Chellappa, D. A Fluorescence Switch for the Detection of Nitric Oxide and Histidine and Its Application in Live Cell Imaging. ChemPlusChem. 79 (12), 1761-1766 (2014).
- Ye, X., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Detection of nitric oxide in single cells. Analyst. 133 (4), 423-433 (2008).
- Thyagarajan, B., Malli, R., Schmidt, K., Graier, W. F., Groschner, K. Nitric oxide inhibits capacitative Ca2+ entry by suppression of mitochondrial Ca2+ handling. Br J Pharmacol. 137 (6), 821-830 (2002).
- Germond, A., Fujita, H., Ichimura, T., Watanabe, T. M. Design and development of genetically encoded fluorescent sensors to monitor intracellular chemical and physical parameters. Biophy. Rev. 8, 121-138 (2016).
- Malli, R., Eroglu, E., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F. Filling a GAP-An Optimized Probe for ER Ca2+ Imaging In Vivo. Cell Chem Biol. 23 (6), 641-643 (2016).
- Sato, M., Hida, N., Umezawa, Y. Imaging the nanomolar range of nitric oxide with an amplifier-coupled fluorescent indicator in living cells. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (41), 14515-14520 (2005).
- Weidinger, A., Kozlov, A. V. Biological Activities of Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Oxidative Stress versus Signal Transduction. Biomolecules. 5 (2), 472-484 (2015).
- Paolo, S. Nitric Oxide in Human Health and Disease. Encyclopedia of life sciences. , Wiley. Chichester. (2005).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
- Bonafe, F., Guarnieri, C., Muscari, C. Nitric oxide regulates multiple functions and fate of adult progenitor and stem cells. J Physiol Biochem. 71 (1), 141-153 (2015).
- Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur. Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
- Dudzinski, D. M., Igarashi, J., Greif, D., Michel, T. The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 46, 235-276 (2006).
- Zhou, L., Zhu, D. -Y. Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications. Nitric Oxide. 20 (4), 223-230 (2009).
- Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sci. 75 (6), 639-653 (2004).
- Ghafourifar, P., Cadenas, E.
- Crane, B. R., Sudhamsu, J., Patel, B. A.
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochim Biophys Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
- Zhang, Y., et al. Estrogen-related receptors stimulate pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4 gene expression. J Biol Chem. 281 (52), 39897-39906 (2006).
- Holzmann, S., Kukovetz, W. R., Windischhofer, W., Paschke, E., Graier, W. F. Pharmacologic differentiation between endothelium-dependent relaxations sensitive and resistant to nitro-L-arginine in coronary arteries. J Cardiovasc Pharmacol. 23 (5), 747-756 (1994).
- Bentley, M., et al. Vesicular calcium regulates coat retention, fusogenicity, and size of pre-Golgi intermediates. Mol Biol Cell. 21 (6), 1033-1046 (2010).
- Ignarro, L. J. Nitric oxide: a unique endogenous signaling molecule in vascular biology. Biosci Rep. 19 (2), 51-71 (1999).
- Upreti, M., Kumar, S., Rath, P. C. Replacement of 198MQMDII203 of mouse IRF-1 by 197IPVEVV202 of human IRF-1 abrogates induction of IFN-β, iNOS, and COX-2 gene expression by IRF-1. Biochem Biophys Res Com. 314 (3), 737-744 (2004).
- Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J Vis Exp. (111), (2016).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Na. Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Latchman, D. S. Transcriptional Gene Regulation in Eukaryotes. Encyclopedia of life sciences. , Wiley. Chichester. (2005).
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
- Suarez, S. A., et al. Nitric oxide is reduced to HNO by proton-coupled nucleophilic attack by ascorbate, tyrosine, and other alcohols. A new route to HNO in biological media. J Am Chem Soc. 137 (14), 4720-4727 (2015).
- Kuropteva, Z. V., Kudryavtsev, M. E. Ferrous-ascorbate complexes as carriers of nitric oxide. Gen Physiol Biophys. 16 (1), 91-96 (1997).
- Vanin, A. F., Huisman, A., Stroes, E. S., Ruijter-Heijstek, F. C., Rabelink, T. J., van Faassen, E. E. Antioxidant capacity of mononitrosyl-iron-dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping. Free Radic Biol Med. 30 (8), 813-824 (2001).
- Lindberg, R. A., Dewhirst, M. W., Buckley, B. J., Hughes, C. S., Whorton, A. R. Ca2+-dependent nitric oxide release in endothelial but not R3230Ac rat mammary adenocarcinoma cells. Am J Physiol. 271 (1), 332-337 (1996).
- Campo, G. M., et al. The SOD mimic MnTM-2-PyP(5+) reduces hyaluronan degradation-induced inflammation in mouse articular chondrocytes stimulated with Fe (II) plus ascorbate. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1610-1619 (2013).
- Waldeck-Weiermair, M., et al. Spatiotemporal correlations between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signals using a novel red-shifted mitochondrial targeted cameleon. PLOS ONE. 7 (9), 45917 (2012).
- Kuzkaya, N., Weissmann, N., Harrison, D. G., Dikalov, S. Interactions of peroxynitrite with uric acid in the presence of ascorbate and thiols: implications for uncoupling endothelial nitric oxide synthase. Biochem Pharmacol. 70 (3), 343-354 (2005).
- Liu, J., Hughes, T. E., Sessa, W. C. The first 35 amino acids and fatty acylation sites determine the molecular targeting of endothelial nitric oxide synthase into the Golgi region of cells: a green fluorescent protein study. J Cell Biol. 137 (7), 1525-1535 (1997).
- Feron, O. The Endothelial Nitric-oxide Synthase-Caveolin Regulatory Cycle. J Biol Chem. 273 (6), 3125-3128 (1998).
