Summary
여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.
Introduction
세포에서, 가장 단백질은 일시적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 통해 안정한 단백질 또는 조립체를 형성하여 기능을 수행한다. 단백질 상호 작용을 특성화하는 것은 충분히 이해 세포 과정에 매우 중요합니다. 질량 분석 (AP-MS)와 함께 선호도 정화는 천연 단백질 상호 작용을 식별하기 위해 가장 일반적으로 적용되는 전략 중 하나입니다. 지난 10 년간 달성 기기의 기능을 크게 향상이 방법은 매우 강력한 만들었습니다. AP-MS 실험에 의해 확인 된 상호 작용이 미끼와할까요 사이의 직접 및 간접 협회의 혼합물을 포함하는 것이 중요합니다. 또한, 종종 단백질은 다른 생물학적 역할을 할 수도 있습니다 동일한 세포 맥락에서 여러 가지 다른 단지에 참여, 따라서 AP-MS에 의해 식별됩니다 인터랙는 별개의 단백질 어셈블리 또는 기능 엔티티의 혼합을 나타낼 수 있습니다. 도출 할 수 없습니다이러한 토폴로지 정보는 AP-MS 간단한 실험에 의해 생성 된 단백질의 모노 차원 목록에서 선험적. 그러나,이 기술은 이러한 어셈블리를 해결하기 위해 하나 이상의 방법과 결합하여 단백질 복합체의 구조를 정의하는 데 더 이용 될 수있다.
AP-MS를 통해 확인 된 단백질 상호 작용의 토폴로지를 해결하기 위해 몇 가지 전략이 적용되고있다. 하나의 방법은 실험 1과 베이트 이전 라운드에서 확인할까요을 이용하여 반복적 인 AP-MS 실험을 수행한다. 매우 유익한 있지만,이 두 실험 및 해석 상당히 노동 집약적 인 작업입니다. 질량 분석기와 결합 단백질 가교 점점 단백질 복합체 2, 3, 4, 5에 대한 위상 정보를 도출하는 데 사용되고있다. 그러나 computatio가교 결합 된 펩티드의 최종 분석은 여전히 도전 과제로 남아 따라서 흐름의 병목 현상이다. MS 분해성 가교 시약의 출현 단백질 (6, 7)를 상호 작용에 가까운 위치에 아미노산 잔기의 매핑을 용이하게한다. 또 다른 방법은 종래의 직교 분리 기술 8,9 친화 정제를 조합하는 것이다. 겔 여과 나 이온 교환 수, 또는 수 크로스 구배 분획 법에 의해 크로마토 그래피 분별은 또한 최근에 의해 통과 복잡한 분리 단계 10, 11, 12, 13, 시스템 전체의 레벨에서 multiprotein 착물을 설명하기 위해 정량적 질량 분석과 조합하여 사용되고있다. 블루 네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (BN-PAGE)는 널리 적용되었습니다천연 단백질 상호 작용, 미토콘드리아 막 단백질 복합체 (14)를 포함하는 일반적으로 사람들을 조사합니다. 이 분리 기술은 최근 미토콘드리아 단지 15 일에뿐만 아니라 라벨이없는 단백질 정량과 상관 프로파일 링과 함께 사용 된 16, 17,뿐만 아니라 19 일 전체 세포 18에서 다른 단백질 복합체를 푸는합니다. 우리는 이후 기본 분류 방법과 정량적 인 MS와 친화력 정화의 조합이 특정 단백질을 포함하는 여러 단백질 어셈블리를 해결하기위한 유용한 전략을 제공해야한다는 가설을 세웠다.
여기서 우리는 정량적 질량 SP이어서 절연 단지 청색 기본 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동법으로 일반 에피토프 계 친화 정제를 조합하는 방법을 설명ectrometry 단백질 상관 프로파일은 단백질에 관여 할 수있는 여러 어셈블리를 해결합니다. 우리는 에피토프 태그에 융합 관심의 단백질이 생리적 풍부 가까이 달성하고 효율적인 기본을 보장하기 위해 내생 로커스에서 표현 마우스 배아 줄기 세포를 사용 복잡한 격리. 이 방법은 단백질이 기존의 geLC-MS (20)보다 더 많은 작업을 필요로하지 않는 동안, 자신의 상관 프로필을 기반으로 별개의 어셈블리에 이러한 문제를 해결하기에 종사 여러 상호 작용을 풀어.
Protocol
FLAG 선호도 정화하여 기본 단백질 복합체의 1. 분리
- 준비
- 세포 펠렛을 해동을 위해 37 ° C의 물을 욕조를 설정합니다.
- 4 ° C에 마이크로 원심을 냉각.
- 크기가 다른 여러 마이크로 원심 튜브 (1.5 ㎖, 15 mL) 및 얼음의 균질화를 놓는다.
- 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl pH를 8, 150 mM의 염화나트륨, 0.1 % Nonidet P-40, 1 mM의 EDTA)을 10 ㎖를 준비하고 얼음에 보관. 직전의 버퍼를 사용하여 10의 1 M DTT μL 및 EDTA 프리 프로테아제 억제제의 분쇄 된 정제를 추가한다.
- 항체 결합 구슬의 준비
참고 : 항체 코팅 구슬 미리 주일까지 준비하고 필요할 때까지 냉장고에 보관하실 수 있습니다. 대부분의 종은 높은 친 화성을 가지는 단백질을 토끼 IgG를 제외한, 아형 면역 글로불린 단백질은 G 단백질 (A)보다 높은 친 화성을 갖는다.- 50 μL 단백질 G 코팅 된 자성 비드 씻겨 : 전송을 50# 956; 미세 원심 분리 튜브에 비드 슬러리의 L은 튜브 측의 비드를 수집하여, 액체를 제거하기 위해 자석에 튜브를 놓는다. PBS-0.01 % 트윈 20, 0.5 mL의 비드를 재현 탁.
- 튜브의 측면에 비드를 수집하여, 액체를 제거하기 위해 자석에 튜브를 놓는다. PBS-0.01 % 트윈 -20, 40 μL의 비드를 재현 탁. 10 μg의 (1 ㎎을 10 μL / ㎖ 원액) M2 항 FLAG 항체를 추가한다. 실온에서 20 분 동안 회전 인큐베이션.
- 튜브의 측면에 비드를 수집하여, 액체를 제거하기 위해 자석에 튜브를 놓는다. PBS-0.01 % 트윈 20, 0.5 ㎖의 비드를 세척 하였다.
- 비드에 항체를 가교를 들어, 0.2 M 트리에탄올 아민 pH를 8.2 mL로 1 회 비드를 세척 하였다. 다음으로, (사용 직전에 제조한다 신선한 DMP 용액) 트리에탄올 아민 0.2 M의 pH를 8.2에서 20mM의 DMP (디메틸 pimelimidate) 1 ㎖에 재현 탁 비즈. 실온에서 30 분 동안 회전 인큐베이션. 자석에 튜브를 놓습니다. 상청액을 제거하고 50 mM 트리스 - 염산 pH를 7.5 0.5 mL에 비드를 재현 탁. 실온에서 15 분 동안 회전 인큐베이션.
- PBS-0.1 % 트윈 -20 0.5 ㎖의 비드를 3 회 반복한다. 필요할 때까지 마지막 세척에 구슬을 둡니다.
- FLAG 계 친화 정제
참고 : 오랜 시간 동안 버퍼없이 구슬을 떠나지 않을에주의하십시오. 모든 버퍼 및 튜브는 항상 얼음에 보관해야합니다. 다음 프로토콜은 FLAG 표지 된 단백질 (20)의 내인성 수준을 발현 2-5 × 108 세포로부터 단백질 복합체의 정제 (10-20 mg의 단백질 용 해물)에 최적화되어있다.- 이 녹기 시작할 때까지 37 ℃에서 수욕에서 세포 펠렛을 해동. , 욕조에서 튜브를 타고 펠렛가 완전히 해동 될 때까지 부드럽게 소용돌이, 즉시 얼음에 세포 현탁액을 포함하는 튜브를 배치합니다.
- 빙냉 용해 완충액 5 mL를 추가세포 현탁액에 소용돌이 (DTT 및 프로테아제 억제제를 함유하는) 혼합한다. 10 분 동안 얼음에서 인큐베이션.
- 감기 다운스 균질에 해물을 전송합니다. (눈에 띄는 점도이 없을 때까지) 꽉 유봉을 사용하여 20 ~ 30 스트로크를 Lyse. 차가운 마이크로 원심 튜브에 균질를 전송합니다.
- 4 ℃에서 15 분 동안 18,000 XG 원심 분리기.
- 깨끗하고 차가운 튜브에 분해물을 전송합니다. 뒤에 용해 액 50 μL를 남겨주세요. 단백질 농도를 측정하고 정화를 모니터링 할 해물의 35 μL 나누어지는 가져 가라.
- 구슬에서 PBS-0.1 % 트윈 20을 제거합니다. 분해물의 1 mL로 구슬을 재현 탁과 해물의 나머지 부분과 섞는다. 1-2 시간 동안 4 ℃에서 회전 휠의 혼합물을 인큐베이션.
- 자석과 튜브의 측면에 구슬을 수집합니다. 상층 액의 30 μL 나누어지는을 수집하고 상등액의 나머지 부분을 폐기합니다. IPP150 완충액 (10 mM 트리스 - 염산 pH를 8 (15)의 0.5 mL의 비드를 재현 탁0 mM의 염화나트륨, 1mM의 EDTA, 0.1 % NP-40) 4-6 회 피펫 팅. 1.5 mL의 차가운 튜브에 전송합니다.
- IPP150 버퍼 두 번 이상 0.5 mL로 세척을 반복한다.
- 워시 FLAG 고유 용출 완충액 (20 mM의 비스 - 트리스 pH가 7, 20 mM의 염화나트륨, 0.02 % Nonidet P-40, 1 mM의 EDTA, 200 mM의 ε 아미노 카프로 산) 0.5 mL로 세 번 구슬. 마지막 세척과 함께, 새로운 냉각 튜브에 구슬을 전송합니다. 철저하게 버퍼를 제거합니다.
- 고유 용출 완충액 200 ㎍ / ㎖의 3 배 FLAG 펩티드를 100 μL의 비드를 재현 탁. 부드러운 회전을 10 분 동안 4 ℃에서 인큐베이션.
- 자석에 구슬을 수집하고 차가운 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
- 반복 두 번 1.3.10-1.3.11 단계를 반복합니다. 모든 용출액을 풀.
- 4 ℃에서 10,000 XG에서 원심 분리하여 원심 분리 필터 장치 (10 kDa의 명목 분자량 한계 컷 - 오프 PES) 아래로 25 μL로 용출액을 농축시킨다. 새로운 냉각 튜브에 집중 용출액을 전송하고 50 % glyce를 추가5 %의 최종 농도 ROL. 필요한 경우 농축 용출액을 밤새 4 ℃에서 유지 될 수있다.
2. 블루 기본 페이지
- 준비
- 1 배 기본 페이지 양극 버퍼, 1X 기본 PAGE 다크 블루 음극 버퍼 및 1X 기본 페이지 라이트 블루 음극 버퍼 1 L를 준비합니다.
- 프리 캐스트 3~12% 기본 PAGE 젤의 빗을 제거하고 1X 기본 PAGE 다크 블루 음극 버퍼로 두 번 우물을 씻는다. 1 배 기본 PAGE 다크 블루 음극 버퍼로 우물을 채 웁니다. 실행중인 탱크의 젤을 설정하지만, 음극 (내부) 챔버에 다크 블루 음극 버퍼를 추가하지 마십시오.
- 전기 실행
- 샘플 준비 : 1X 용출액 각각 최종 농도 0.005 %에 해당 네이티브 4X 샘플 로딩 버퍼의 부피는 0.5 %의 G-250 샘플을 추가 첨가제 농축 25 μL한다.
- betwee 빈 우물을 떠나 샘플 및 네이티브 분자량 마커를로드를 n 개. 모든 빈 우물에 1 배 기본 샘플 로딩 버퍼의 부하 10 ~ 20 μL.
- 샘플을 방해하지 않도록주의 1 배 기본 PAGE 다크 블루 음극 버퍼의 200 mL를 음극 (내부) 챔버를 입력합니다. 1X 천연 PAGE 양극 완충액 550 mL를 애노드 (외부) 챔버를 채운다.
- 30 분, 150 V에서 젤을 실행. , 실행을 중지하고 혈청 학적 피펫 다크 블루 음극 버퍼를 제거하고 1 배 라이트 블루 음극 버퍼로 교체합니다. 60 분의 실행을 계속합니다. 겔 C 실온 또는 4 ℃에서 실행될 수있다; 온도는 단백질의 복잡한 구조에 영향을 미칠 수 있습니다.
- 젤 염색
- 겔 카세트를 열고 카세트 판을 버린다. 겔은 다른 카세트 판에 부착 된 상태로 유지. 겔을 포함하고 온화한 진탕하면서 30 분 동안 배양 충분한 정착 용액 (40 % 메탄올, 2 % 아세트산)을 함유 한 트레이나 용기에 겔을 전송.
- 정착액 오디오 솔루션을 제거이온 겔을 커버하기에 충분한 물을 첨가 하였다. 젤은 향후 참조를 위해 스캔 할 수 있습니다.
3. 질량 분광법 분석
주의 : 샘플의 청결을 위해 가능한 모든 후속 단계는 층류 후드에서 수행되어야한다. 모든 솔루션은 HPLC 등급의 물을 준비해야합니다. 분석을 수행 할 질량 분석 실험실이 프로토콜을 토론한다.
- 준비
- 폐기물을 수집하는 다른 96- 웰 플레이트 위에 원추형 바닥 96 웰 플레이트를 놓는다. 피어스 21 G 바늘 원추형 바닥 96 웰 플레이트의 웰의 바닥.
- 주입 투과 96- 웰 플레이트의 웰을 세척한다.
- 주입 투과 판의 웰에 50 % 아세토 니트릴 - 0.25 % 포름산 200 μL를 추가한다. 10 분 동안 진탕 기에서 플레이트를 인큐베이션 스택.
- 1 분 동안 500 XG에서 원심 분리되도록 액체 폐기물 수집 플레이트에 구멍을 통해 흐른다. 승 폐기ASTE 액체.
- 단계를 반복 3.1.2.1-3.1.2.2 두 번 더.
- 50mM의 중탄산 암모늄 150 μL와 관통 96 웰 플레이트 채우기 (갓).
- 원심 여과를 96- 웰 플레이트의 웰을 세척한다.
- 폐기물 수집 원심 여과 판 하에서 통상 96 웰 플레이트를 놓는다. 원심 여과 플레이트의 각 웰에 50 % 아세토 니트릴 - 0.25 % 포름산 200 μL를 추가한다.
- 1 분 동안 200 XG에 판 스택 원심 분리기. 폐기물을 폐기하십시오.
- 단계를 반복 3.1.3.1-3.1.3.2 두 번 더.
- 젤 절제와 인 - 젤 소화
참고 : 젤을 절개하는 동안, 식별 및 단백질 표준의 각 정렬 겔 슬라이스를 기록합니다. 단백질 표준은 모든 젤 슬라이스에 대한 대략적인 분자량을 추정하는 데 사용할 수 있습니다.- 깨끗한 표면에 유리판 겔을 놓는다. 차선에 포함 슬라이스동일한 48 개 조각 (1.5 mm × 5 mm)로 샘플을 보내고. (겔의 맨 마지막 5 개 조각은 제외) 2-3 작은 조각으로 각각의 조각으로 절단하고 피어싱의 한 웰에 각 조각을 순차적으로 배치하고 96- 웰 플레이트를 세척 하였다.
- 각 웰에 아세토 니트릴 50 μL를 추가합니다. 30-60 분 동안 진탕 플레이트를 인큐베이션. 단계 3.1.2.2에서와 같이 원심 분리하여 액체를 제거합니다.
- 각 웰의 50 mM 중탄산 암모늄의 2 밀리미터 TCEP 200 μL를 추가한다. 30 분 동안 실온에서 진탕하면서 인큐베이션 플레이트. 단계 3.1.2.2에서와 같이 원심 분리하여 액체를 제거합니다.
- 각 웰의 50 mM 중탄산 암모늄의 요오도 아세트 아미드 4 mm 인 200 μL를 추가한다. 어둠 속에서 37 ° C에서 30 분 동안 진탕 플레이트를 인큐베이션. 단계 3.1.2.2에서와 같이 원심 분리하여 액체를 제거합니다.
- 50mM의 중탄산 암모늄 150 μL 플러스 아세토 니트릴의 50 μL를 추가하고 실온에서 30 분 동안 진탕 배양 플레이트. 이 세척 단계 A를 반복모든 블루 색상이 젤 조각에서 제거 될 때까지 필요에 따라 여러 번이야.
- 순수 아세토 니트릴 200 μL를 첨가하여 겔 조각 탈수 겔 조각 백색 불투명 할 때까지 20 분 동안 실온에서 진탕 배양한다. 아세토 니트릴을 제거합니다.
- 각 웰에 차가운 50mM의 중탄산 암모늄 0.001 밀리그램 / ㎖의 트립신 (시퀀싱 등급) 150 μL를 추가한다. 2 시간 동안 37 ° C에서 진탕 플레이트를 인큐베이션. 1 시간 후, 젤 조각은 액체로 덮여 있음을 확인; 그렇지 않은 경우의 50 mM 중탄산 암모늄의 다른 50-100 μL를 추가한다. 37 ° C에서 2 시간 후, 밤새 25 ℃에서의 분해를 계속한다.
- 플레이트의 정확한 방향을 보장 겔 함유 플레이트 하에서 깨끗한 원추형 바닥 판을 놓는다. 1 분 동안 200 XG에서 원심 분리에 의해 펩타이드를 함유하는 액체를 수집한다.
- 원심 증발기에서 펩티드 - 함유 플레이트를 놓고 t를 수행하는 동안, 액체를 증발그는 다음 단계.
- 겔 조각을 50 % 아세토 니트릴 - 0.25 % 포름산 150 μL를 추가한다. 30 분 동안 37 ℃에서 진탕하면서 인큐베이션.
- 1 분 동안 200 XG에서 원심 분리 단계 3.2.9에서 부분적으로 건조 된 플레이트에 액체를 수집한다. 다음 단계를 수행하는 동안 펩티드 - 함유 플레이트를 증발 계속.
- 반복 3.2.10-3.2.11 단계를 반복합니다.
- 겔 조각을 포함하고있는 플레이트의 각 웰에 순수 아세토 니트릴 200 μL를 추가한다. 15 분 동안 실온에서 진탕하면서 인큐베이션.
- 1 분 동안 200 XG에서 원심 분리에 의해 펩티드 - 함유 플레이트에 액체를 수집한다.
- 모든 우물에서 아세토 니트릴의 최종 농도가 55 % 이상인지 확인합니다. 필요한 경우, 여분의 순수 아세토 니트릴을 추가합니다.
- 세정, 원심 여과 판 펩티드 용액을 전송. 펩티드를 수집하여 그 아래 깨끗한 원추형 바닥 판을 놓는다. 1 분 동안 200 XG에 판 스택 원심 분리기.
- 에바웰이 완전히 건조 될 때까지 원추형 바닥 판에 액체를 먹었다. 플레이트는 실리콘 덮개 피복 단계에서 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
- 격렬하게 15 분 동안 진탕 0.5 % 포름산 32 μL의 펩티드를 재용. 400 mM의 중탄산 암모늄 8 μL를 첨가하고 격렬하게 15 분 동안 진탕 배양한다. 1 분 동안 200 XG에 플레이트를 원심 분리기. 실리콘 뚜껑을 덮고, 질량 스펙트럼 분석까지 -20 ℃에서 플레이트를 저장한다.
- 질량 분석
참고 : 샷건 프로테오믹스 (proteomics)와 호환 방법을 사용하여 고해상도 질량 분석기에 펩티드를 분석합니다. 데이터 종속 취득 이러한 유형의 분석을 위해 가장 일반적으로 사용되는 MS가 설정 LC-탠덤이며, 배경 잡음 위에 중복 서열과 후보 선택을 최소화 펩티드 효율적인 식별을 위해 최적화되어야한다. 제 1 단계 질량 분석 검사 (MS1) 질량 스펙트럼 프로파일 모드로 기록되어야한다. 그것은 추천입니다ED 우선적 두번째 단계 질량 분석 (MS2)에 대한 이중 및 삼중 하전 된 이온을 선택한다. m / z 400-1,600의 질량 범위는 8-30 아미노산 범위 사이에서 가장 펩티드를 확인하기에 적합하다. 여기서, Orbitrap 질량 분광계를 사용하여 분석을위한 프로토콜이 제공된다.- nanoLC-MS / MS 시스템의 오토 샘플러를 사용하여 분석 당 20 μL의 시료를 주입한다. C18 컬럼 (100 μm의 ID, 2cm)을 탈염 및 역상 펩티드에 집중.
- 300 거리 nL / min으로 4-28 % 아세토 니트릴 / 0.1 % 포름산 30 분 선형 구배를 이용한 분석 C18 컬럼 (75 μm의 ID, 15cm)에서 분리 된 펩타이드.
- 다음과 같은 파라미터를 가진 10 가지의 데이터 종속 취득 방법과 질량 분석기에서 펩타이드를 분석 : m / z 범위 380-1,600, m의 해상도 30,000 / z 400, 2 목 단리 폭 45 s의 ± 10 ppm에서 동적 제외 자동 이득 제어 대상 MS / MS, 최대 분사 시간 1 X MS 10 6 5000에서 MS에 대한 MS (150) 및MS / MS 100 MS.
4. 데이터 분석
- MaxQuant를 사용하여 단백질 식별 및 정량화
- 질량 분석 원시 데이터로부터 각 겔 분율에 단백질을 식별하고 정량화하기 위해 자유롭게 사용할 수 MaxQuant 소프트웨어를 사용합니다.
참고 : MaxQuant 데이터에 의존 수집 샷건 프로테오믹스 방법에 의해 생성 된 데이터에서 작동합니다. 청색 네이티브 겔 분획으로부터 MS 데이터는 별도의 실험뿐만 아니라 모든 겔 조각을 조합 한 실험의 분획으로서 일괄 적으로 해석되어야한다. 화학 양론 계산을 수행 할 수 iBAQ 값 확인란을 선택합니다. MaxQuant를 이용하여 데이터베이스 검색 및 단백질 정량 상세한 프로토콜은, (22) (21)에 기재되어있다.
- 질량 분석 원시 데이터로부터 각 겔 분율에 단백질을 식별하고 정량화하기 위해 자유롭게 사용할 수 MaxQuant 소프트웨어를 사용합니다.
- 페르세우스를 사용하여 단백질의 프로파일 분석
- 확인 된 단백질의 이동 프로파일을 표시하기 위해 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어 페르세우스를 사용하여 사용하여 비교통계 분석.
참고 : 페르세우스를 사용하는 방법에 대한 일반 문서는 http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials에서 확인할 수있다. 샘플 데이터 세트는 보충 자료로 사용할 수 있습니다. - 모든 젤 분수의 단백질 식별 및 정량 값을 포함하는 MaxQuant 분석에 의해 반환 된 proteingroups.txt 파일을 업로드합니다. 메인 상자 (그림 1)에 강도 값을 채 웁니다. 행렬는 열로서 겔 분율과, 행에있는 모든 단백질을 포함하는 식별 표시한다.
- 히트 역에 대응하는 엔트리만을 필터 로우 드롭 다운 메뉴의 범주 열을 기반으로 필터 열 (도 2)을 선택하여 위치 및 잠재적 오염에 의해 식별 된 단백질을 제거한다.
- 그 후, 평준화 드롭 다운 메뉴에서 합계 (도 3) 분할을 선택하여 총 단백질 강도 프로파일에 대하여 각각 전체 단백질의 분획 농도를 정상화. 새로운 mATRIX가 나타납니다.
- 시각화 드롭 다운 메뉴 (도 4) 프로필 플롯을 선택하여 모든 단백질의 이동 프로파일의 플롯을 보여준다.
- 필터 행 드롭 다운 메뉴에서 유효 값을 기준으로 필터링을 선택합니다 행. 필요한 유효한 값의 수에 1을 입력합니다.
- 클러스터링 / PCA 드롭 다운 메뉴에서 계층 적 클러스터링을 선택하여 모든 블루 기본 젤 분수에서 확인 된 단백질의 계층 적 클러스터링을 수행합니다. 열 나무 상자 (그림 5)의 선택을 취소합니다. 클러스터는 다음의 매트릭스 (도 6)으로 클러스터링 탭에서 열지도 시각화된다.
- dendrogram은의 미끼 단백질을 포함하는 클러스터를 찾습니다. 클러스터의 다른 구성 요소는 미끼와 공동 이주 단백질을 나타내며, 따라서 동일한 복합체의 잠재적 상호 작용 단백질 / 서브 유닛이다.
- 확인 된 단백질의 이동 프로파일을 표시하기 위해 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어 페르세우스를 사용하여 사용하여 비교통계 분석.
사이트 식별 안타 단백질을 역 오염에 대응하는 항목의 필터링 페르세우스 창 2. 스크린 도표. 범주 열을 기준으로 필터 행을 선택하면 단백질 항목의 유형을 선택할 수있는 새 창이 데이터 세트에서 제거 할 열립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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페르세우스 정규화 창 3. 스크린 샷 그림. 정상화 메뉴에서 나누기를 선택하면 다른 옵션으로 새 창을 엽니 다. 합계를 선택하면 모든 분획에 걸쳐 그 단백질의 전체 강도에 의해 각 분획의 단백질의 강도 값을 나눈다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
페르세우스 이주 프로파일의 플롯을 나타낸도 4의 스크린 샷. 단백질은 해당 프로파일을 강조하는 프로파일 아래 행렬에서 선택 될 수있다. 이 도구 모음은 프로파일을 편집하고 수출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
페르세우스 계층 적 클러스터링 창 5. 스크린 샷 그림. 도면은 맨해튼 (L1)의 거리 메트릭을 사용하여 단백질의 클러스터링 계층의 설정을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
페르세우스도 6의 스크린 샷 Dendrogram이 단백질 농도 히트 맵을 도시. 메인 패널의 오른쪽에있는 작업 흐름은 단계마다 수행하고, 생성 행렬을 나타내며, 임의의 단계를 취소 할 수있다. 워크 플로우는 중간 행렬로부터 분기 할 수있다. 이 F의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오igure.
- 상대 화학량 론의 계산
- 미끼 단백질과의 공동 클러스터링 기반으로하는 단백질 복합체의 서브 유닛을 선택하고 나타나는 프로파일 피크 (들)을 구분합니다.
- 각 분획에 대한 각 서브 유닛 MaxQuant 분석 iBAQ 반환 값을 개별적으로 사용하여 그 부분에 대응하는 미끼 iBAQ 값으로 정규화.
- 선택된 피크 분획에 걸쳐 미끼 단백질 소단위 복합체에 대한 정규화 iBAQs 플롯 선형 회귀를 적용한다. 그 정규화 iBAQ 값의 추이를 비교하여 미끼 복잡한 서브 유닛의 상대적 양을 계산한다.
- 단백질 복잡한 크기의 추정
- 샘플 차선에서 정렬 블루 기본 젤 조각에 대한 예측 분자량을 계산하는 단백질 표준을 사용합니다. 이들로부터, y를 이동시킴으로써 행한다에서 겔은 X시킴으로써 행한다 슬라이스 및 분자량 플롯하여 선형 회귀 모델을 생성한다. 가 확인 된에서 파란색 기본 슬라이스 (들)에 따라 단백질 복합체 (들)의 관찰 분자량 범위를 추정하는 모델을 사용합니다.
Representative Results
질량 분석에 의해 친 화성 정제 블루 천연 단백질 상관 프로파일의 워크 플로우 (ABC-MS) 전략은도 7에 도시되어있다. 관심의 단백질 주변의 원주민 단백질 복합체 (이 경우 FLAG)에 에피토프 태그에 대한 항체를 사용하여 친화력 정화 및 경쟁력 용출에 의해 격리됩니다. 착물은 BN-PAGE에 의해 해결되며, 전체 겔 레인은 48 개 부분으로 절개하고, 샷건 LC-MS / MS를 위해 준비했다. MS 정량 정보는 청색 기본 분리 걸쳐 각각의 식별 된 단백질 마이그레이션 프로파일을 생성하는 데 사용된다. 상호 작용하는 단백질을 겹쳐 피크 구별 복잡한 디스플레이 유사한 이동 프로파일을 형성한다. 목적 단백질은 하나 개 이상의 부 조립에 걸리는 경우, 다수의 피크가, 그 이동 프로파일에서 관찰 된 서브 착물 청색 네이티브 겔 해상력 내에 주어진다. 미그의 체계적인 비교배급량 프로필 계층 클러스터링을 사용하여 단백질의 프로파일 상관에 의해 달성 될 수있다. dendrogram은 모든 분획에 대한 피크 강도가 별개의 단백질 복합체에 속하는 단백질 (도 8)의 상호 작용의 확인을 용이하게 열지도 시각화된다.
우리는 MTA2, 복잡한 20 개조 NuRD 염색질의 핵심 서브 유닛의 상호 작용 파트너를 분석하기 위해이 전략을 사용했다. 도 9에 도시 된 바와 같이, MTA2의 이동 프로파일은 더 풍부 표시 하부 질량 피크, 700 kDa 이상 1.2 MDA 간의 구별 강도의 두 피크를 표시. MTA1 / 3 HDAC1 / 2 Mbd3 포함한 기타 NuRD 코어 서브 유닛은, 상기 서브 유닛, 즉 Chd4의 일부 피크이라도 동일한 분리 패턴을 보였다 B Gatad2a / 및 Rbbp4 / 7은 (도 9a 역 풍부 분포 있었다 B). 한편, CDK의 프로필2ap1,이 Wnt 유전자 프로모터 (23)에 NuRD 복합체를 모집 규제 인자 만 높은 질량 피크 (도 9c)를 표시하고 있으므로 Sall4도 NuRD 20, 24, 25에 결합하는 것으로 나타났다 전사 리프레했다. 따라서, 청색 기본 PAGE에 의한 친 화성 정제 MTA2 관련 단백질 분획은 NuRD 복합체의 두 가지 형태를 확인할 수 있었다.
ABC-MS는 특정한 단백질 엔티티에 할당하면서 신규 인터랙의 식별을 허용한다. 열 -지도에 표시된 단백질 클러스터 및 분획 강도의 시험을 통하여 우리는 두 NuRD 피와 일치 개의 이전 피크를 표시 NuRD 소단위와 Wdr5와 Wdr5 상기 MLL의 메틸화 착체 (26)의 조절 서브 유닛 사이의 강한 상관을 검출Wdr5 및 NuRD 간의 새로운 상호 작용을 제안 eaks (도 8). 우리는 크기 배제 크로마토 그래피 (20)의 공동 면역와 공동으로 마이그레이션하여이 상호 작용을 확인했다.
계층 적 클러스터링 디스턴스 메트릭 계산의 선택은 클러스터 따라서 상관의 형태에 영향을 미칠 것이다. 우리는 단백질 또는 관심의 복잡한의 기존 상호 작용의 지식을 가진 가장 적합한을 달성하기 위해 서로 다른 측정 실험을하는 것이 좋습니다. 일반적으로 우리는 맨하탄 (L1)의 거리 메트릭 (20)에 최적의 결과를 달성했다. 피어슨 상관 또는 유클리드 거리 메트릭은 다른 분류 기법 10, 11, 12에 기초하여 복합체를 식별하기 위해보고되었다.
관음청색 기본 분획으로부터 수득 titative MS 데이터는 단백질 복합체의 화학량 론을 결정하는 데 사용될 수있다. iBAQ (강도 계 절대 정량) 값은 식별 된 단백질 (27), (28)의 상대적인 풍부함의 측정치를 제공한다. 마이그레이션 프로파일 내의 모든 피크 분획에서의 단백질의 복합 부재 iBAQ 값은 상대적인 양을 얻기 베이트 단백질의 정규화된다. 주어진 단백질 복합체 부재의 프로파일 피크 걸쳐 정규화 iBAQs 수평 흐름을 따라야하고, 그래프 값 미끼 단백질에 대해 상호 작용하는 단백질의 화학량 론을 반영한다. 화학량 론 계산의 더 상세한 표현, 20 참조.
도 7 : 도식 플로 요약 ABC-MS의trategy. 이는도 20에서 수정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
MTA2의 인터랙의 BN-PAGE 이전 프로파일도 8 계층 클러스터링. MTA2 관련 단백질은 자신의 마이그레이션 프로필의 유사성에 따라 클러스터했다. 오직 NuRD 착체를 함유하는 가열 - 맵의 서브 세트 (파란색 상자 묶인) 도시되어있다. 노란색 상자가 NuRD 단지와 Wdr5의 강한 상관 관계를 강조한다. 주석 분자량이 같은 젤에서 실행 단백질 표준의 이동 거리에서 추정되었다. 이 연구는 원래 생화학 및 모 20 미국 사회 분자 세포 프로테오믹스에 발표 된 lecular 생물학. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
NuRD 소단위와 관련된 단백질도 9 BN-PAGE 이전 단면도. A) 동일한 강도의 패턴으로 존재하고 MTA2 NuRD 소단위. B) 상기 역 강도 패턴 MTA2 및 NuRD 소단위. 오직 고 분자량 NuRD 엔티티에 존재하는 C) 및 MTA2 Cdk2ap1. 주석 분자량은 단백질 표준의 마이그레이션 프로필에서 추정되었다. 이 연구는 원래 분자 세포 프로테오믹스 (20) 생화학 및 분자 생물학에 대한 미국 사회에 출판되었다."_blank>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 자료 : 샘플 데이터 세트. ABC-MS 실험에서 단백질 동정 및 정량 값을 포함 proteingroups.txt 파일 MaxQuant 유래. 이 연구는 원래 분자 세포 프로테오믹스 (20) 생화학 및 분자 생물학에 대한 미국 사회에 출판되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기, 우리는 단백질 복합체를 해결하기 위해 양적 질량 분석과 함께 파란색 기본 겔 전기 영동 다음에 친화력 정화의 사용을 설명합니다. 이 방법은 기능성 단백질 어셈블리로 일차원 단백질 상호 작용의 목록을 해명하기위한 방법을 제공한다.
우리는 에피토프 - 태그 단백질의 사용을 기반으로하는 방법을 보여줍니다. 태그가 단백질을 발현하는 세포주를 사용할 수없는 경우, 대안은 관심의 단백질에 대한 항체를 사용하는 네이티브 경쟁 용출을 달성 할 수 펩타이드가 제공 할 수도 있습니다. 출발 물질과 구슬의 양의 크기는 목적 단백질의 발현 수준에 따라 수정해야 할 수도 있습니다. 우리는 일반적으로 출발 물질 2-5 × 108 셀이 프로토콜을 수행하고, 이는 심지어 낮은 발현 수준을 갖는 단백질을 충분하다. 용해 완충액의 조성은 달성하도록 실험적으로 선택되어야근처 미끼의 가용화를 완료합니다. 이 바인딩 특정 염색질 또는 막 단백질에서 단백질의 일부 유형에 대한 도전이 될 수 있습니다. 대안적인 옵션은 연구중인 단백질 복합체는 높은 염 또는 염색질 결합 단백질 20, 29, 초음파 및 / 또는 뉴 클레아 제 처리를 사용하여 안정한 것이어야한다 소금의 양을 증가시키는 것을 포함한다. 막 단백질의 경우, DDM 또는 디기 토닌에 세제를 전환하는 것이 바람직 할 수도있다 (30). 이 DNA 결합 단백질의 경우, 정제 단계 (20) 중 벤조 나제 바와 같은 뉴 클레아 제를 포함하는 것이 유용하다. 핵산의 완전한 제거는 검출 된 상호 작용 단백질과 DNA 사이에서 발생에 의해 매개되지 않는 것을 보장한다.
이 방법을 사용하여 조사중인 착체의 안정성이 때 중요한 요소를 고려한다. 절차는 길고 preservin을 포함 할 수있다g 단백질 복합체 밤새. 우리는이 크로 마틴 리모델링 복합체 (D 보데와 M 파르도, 데이터가 표시되지 않음) 좋은 성공을 달성,하지만이 평가되어야한다. 필요한 경우 친화 정제 공정을 단축 할 수있다.
같은 크기 배제 크로마토 그래피 등의 기본 분류를 허용 대체 기술은 널리 단백질 복합체의 특성을 50 년 이상 사용되어왔다. 우리는 청색 등 천연 PAGE의 해상도가 크기 배제 크로마토 그래피 20, 31, 32, 33을 사용하여 달성이 우수하다는 것을 보여 주었다. 블루 기본 페이지의 또 다른 장점은 비용이 크로마토 그래피 시스템을 필요로하지 않는, 오히려 실험실에서 널리 퍼져 단백질 전기 영동 장비를 사용합니다. 의 측면에서 손에 시간,이 방법은 기존의 geLC-MS / MS (A)보다 더 많은 작업을 포함하지 않습니다pproach 또는 오프라인 크로마토 그래피 분별. 대부분의 분류 기술 할 그러나, 그것은 그들의 해상도에 한계가 있습니다. 매우 균일 또는 질량과 모양에 가까운 단지는 파란색 기본 페이지에서 제공하는 해상도 및 공유 서브 유닛과 별개의 단지를 해결 보편적으로 성공하지 않을 수 있습니다 여기에보고 따라서 프로토콜을 넘어 수 있습니다. 격려하여, 우리는 세 개의 서브 유닛 (M 파르도, 준비 원고를) 공유하는 두 개의 매우 유사 사량 단지를 분리하는데 성공했다.
질량 분석 점점 민감한되어 있기 때문에, 불특정 인터랙 오염물 미세한 양 AP-MS 샘플에서 검출 될 수있다. 여기에 제시된 방법은보다 높은 분자량에서 미끼 마이그레이션 피크와 일치 마이그레이션 봉우리 단백질에 관심을 집중하여 친화력 정화의 배경 오염 실제 인터랙의 차별에 도움이 있습니다단량체 단백질.
몇몇 그룹이 이전의 분리 10, 11, 12, 34에 대한 필요없이 셀룰러 규모 단백질 복합체를 묘사하는 단백질 상관 프로파일이어서 분별 기법을 사용 하였다. 그러나,이 하위 화학 양 론적 상호 작용을 검출하는 오류가 발생할 수 있습니다. 친화력 정화를 통해 농축 단계의 통합이를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 방법은 특정 단백질이 동일한 셀룰러 컨텍스트 내의 소요 부분에 상기 다수의 복합체 단백질 복합체의 토폴로지 탐색 및 해명에 일반적으로 유용한 것으로한다. 이 전략은 단백질 복합체를 해결하기 위해 고가의 크로마토 그래피 분별 장비가 없을 수 있습니다 실험실 간단하고 의무입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein G Dynabeads | Life Technologies | 10003D | |
| FLAG antibody M2 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| Tween-20, protein grade, 10% solution | Millipore | 655206 | |
| Dimethyl pimelimidate | Sigma-Aldrich | 80490 | |
| 0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2 | Sigma-Aldrich | T0449 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| Vivaspin 5K NMWCO, PES | Sartorius | VS0112 | |
| NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel | Life Technologies | BN1001 | |
| 20x NativePAGE Running Buffer | Life Technologies | BN2001 | |
| 20x NativePAGE Cathode Additive | Life Technologies | BN2002 | |
| 4x NativePAGE sample loading buffer | Life Technologies | BN2003 | |
| NativeMARK | Life Technologies | LC0725 | |
| NativePAGE 5% G-250 sample additive | Life Technologies | BN2004 | |
| Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene | Thermo | 249944 | |
| Multiscreen HTS 96-well filtration system | Thermo | MSDVN6550 | |
| Nunc 96-well cap natural | Thermo | 276002 | |
| TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A/0627/17 | |
| Trypsin, sequencing grade | Roche | 11418475001 | |
| MaxQuant (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant |
| Perseus (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus |
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