Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Published: April 1, 2017 doi: 10.3791/55498
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Proteomic Mass Spectrometry, Wellcome Trust Sanger Institute

Summary

Här presenterar vi protokoll för affinitetsrening av proteinkomplex och deras separation genom blå nativ PAGE, följt av proteinkorrelations profilering med hjälp av etikett fri kvantitativ masspektrometri. Denna metod är användbar för att lösa interactomes i distinkta proteinkomplex.

Introduction

I celler, de flesta proteiner utföra sina uppgifter genom tillfälliga protein-proteininteraktioner eller genom att bilda stabila proteinaggregat. Karakterisera proteininteraktioner är avgörande för att fullt ut förstå cellulära processer. Affinitetsrening i kombination med masspektrometri (AP-MS) är en av de mest allmänt tillämpade strategier för att identifiera nativa proteininteraktioner. Betydande förbättringar i instrument kapacitet uppnås under det senaste decenniet har gjort denna metod extremt kraftfull. Det är viktigt att notera att de interaktioner som identifieras av AP-MS försök innefattar en blandning av direkta och indirekta samband mellan bete och bytesorganismer. Dessutom ofta proteiner delta i flera olika komplex inom samma cellulära sammanhang, som kan ha olika biologiska roller, och därför interactmedlemmarna som identifieras av AP-MS kan representera en blandning av distinkta proteinaggregaten eller funktionella enheter. Det är inte möjligt att härledasådan topologisk information som a priori från mono-dimensionell listor av proteiner alstrade genom enkla AP-MS experiment. Emellertid, kan tekniken utnyttjas ytterligare för att definiera arkitekturen av proteinkomplex genom att kombinera det med ett eller flera förfaranden för att lösa dessa aggregat.

För att lösa topologin för proteininteraktioner som identifierats genom AP-MS, har flera strategier tillämpats. Ett tillvägagångssätt är att utföra iterativ AP-MS-försök med användning av de bytesorganismer identifierade i en tidigare runda av experiment som beten 1. Även om mycket informativt, är detta en ganska arbetsintensiv uppgift både experimentellt och analytiskt. Protein tvärbindning i kombination med masspektrometri används alltmer för att härleda topologisk information om proteinkomplex 2, 3, 4, 5. Men computational analys av tvärbundna peptiderna fortfarande förblir en utmanande uppgift och följaktligen är flaskhalsen i arbetsflödet. Tillkomsten av MS-klyvningsbara tvärbindningsreagens bör underlätta kartläggningen av de aminosyrarester som är i omedelbar närhet i interagerande proteiner 6, 7. Ett annat alternativ är att kombinera affinitetsrening med tidigare ortogonala separationstekniker 8, 9. Kromatografisk fraktionering genom gelfiltrering eller jonbyte, eller sukrosgradientfraktionering har också nyligen använts i kombination med kvantitativ masspektrometri för att beskriva multiproteinkomplex vid en systemomfattande nivå, förbi den komplexa isoleringssteget 10, 11, 12, 13. Blå nativ polyakrylamidgelelektrofores (BN-PAGE) har i stor utsträckning för attundersöka nativa proteininteraktioner, typiskt de som inbegriper mitokondriell membranproteinkomplex 14. Denna separationsteknik har också nyligen använts i kombination med etikett-fritt protein kvantifiering och korrelations profilering, inte bara på mitokondriella komplex 15, 16, 17, utan också för unraveling andra proteinkomplex från hela celler 18, 19. Vi hypotesen att kombinationen av affinitetsrening med efterföljande nativa fraktioneringsmetoder och kvantitativ MS bör tillhandahålla en användbar strategi för att lösa flera proteinaggregat som innehåller ett särskilt protein.

Här beskriver vi en metod som kombinerar generisk epitop baserad affinitetsrening med blå nativ polyakrylamidgelelektrofores av de isolerade komplexen, följt av kvantitativ mass spectrometry och proteinkorrelations profilering, för att lösa de multipla aggregaten ett protein kan vara inblandade i. Vi använder mus embryonala stamceller där ett protein av intresse smält till en epitopmärkning uttrycks från den endogena lokuset för att uppnå nära fysiologiskt överflöd och säkerställa effektiv nativa komplex isolering. Detta tillvägagångssätt unravels de multipla interaktioner ett protein ingriper i, lösa dem i distinkta aggregat baserat på deras korrelations profiler, samtidigt som inte kräver mer arbete än konventionell geLC-MS 20.

Protocol

1. Isolering av Native proteinkomplex genom FLAG Affinitetsrening

  1. förberedelser
    1. Ställa in en 37 ° C vattenbad för att tina cellpelleten.
    2. Kyla ner en mikrocentrifug till 4 ° C.
    3. Placera flera mikrocentrifugrör av olika storlekar (1,5 ml, 15 ml) och en homogenisator i is.
    4. Förbereda 10 ml lysbuffert (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA) och hålla i is. Precis före användning av den buffert, tillsätt 10 | il av en M DTT och en krossad tablett av EDTA-fri proteashämmare.
  2. Framställning av antikroppsbundna pärlorna
    OBS: De antikroppsbelagda pärlor kan beredas upp till en vecka i förväg och förvaras i kylskåp tills det behövs. Protein G har högre affinitet än protein A för de flesta arter immunglobulin subtyper, med undantag av kanin-IgG, för vilken protein A har högre affinitet.
    1. Tvätta 50 mikroliter av Protein G-belagda magnetiska pärlor: Överföring 50 &# 956; L från pärluppslamningen till ett mikrocentrifugrör, placera röret i magnet att samla pärlorna på den sida av röret och avlägsna vätskan. Resuspendera kulorna i 0,5 ml av PBS-0,01% Tween-20.
    2. Placera röret i magnet att samla pärlorna på den sida av röret och avlägsna vätskan. Resuspendera kulorna i 40 ^ il PBS-0,01% Tween-20. Tillsätt 10 | ig (10 | il av 1 mg / ml stamlösning) av M2-anti-FLAG-antikropp. Inkubera med rotation under 20 minuter vid rumstemperatur.
    3. Placera röret i magnet att samla pärlorna på den sida av röret och avlägsna vätskan. Tvätta pärlorna med 0,5 ml av PBS-0,01% Tween-20.
    4. För tvärbindning av antikroppen till pärlorna, tvätta pärlorna två gånger med 1 ml 0,2 M trietanolamin pH 8,2. Då, resuspendera kulorna i 1 ml 20 mM DMP (dimetyl pimelimidate) i 0,2 M trietanolamin pH 8,2 (DMP lösningen bör beredas på nytt omedelbart före användning). Inkubera med rotation vid rumstemperatur under 30 min. Placera röret i magneten. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pärlorna i 0,5 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,5. Inkubera med rotation vid rumstemperatur under 15 min.
    5. Tvätta pärlorna 3 gånger med 0,5 ml PBS-0,1% Tween-20. Låt pärlor i den sista tvättningen tills det behövs.
  3. FLAG-baserade affinitetsrening
    OBS: Var försiktig att inte lämna pärlorna utan buffert under en lång tid. Alla buffertar och rör bör hållas i is hela tiden. Följande protokoll är optimerad för reningen av proteinkomplex från 2-5 x 10 8 celler (10-20 mg protein-lysat) som uttrycker endogena nivåer av en FLAG-märkt protein 20.
    1. Tina cellpelleten i ett vattenbad vid 37 ° C tills den börjar smälta. Ta röret ur badet, snurra den försiktigt tills pelleten smält fullständigt, och omedelbart placera röret innehållande cellsuspensionen på is.
    2. Tillsätt 5 ml av iskall lysbuffert(Innehållande DTT och proteasinhibitorer) och cellsuspensionen och virvla runt för att blanda. Inkubera i is under 10 min.
    3. Överför lysatet till en kall Dounce homogenisator. Lyserar med 20-30 slag med hjälp av tät mortelstöt (tills ingen märkbar viskositet). Överför homogenatet till kalla mikrocentrifugrör.
    4. Centrifugera vid 18 tusen xg under 15 min vid 4 ° C.
    5. Överför klarnat lysat till ett rent kallt rör. Lämna 50 mikroliter av lysat bakom. Ta en 35 mikroliter alikvot av lysat för att mäta proteinkoncentration och övervaka rening.
    6. Avlägsna PBS-0,1% Tween-20 från pärlorna. Resuspendera kulorna med 1 ml av lysatet och blanda med resten av lysatet. Inkubera blandningen i ett roterande hjul vid 4 ° C under 1-2 h.
    7. Samla pärlorna på sidan av röret med magneten. Samla in en 30 ul alikvot av supernatanten och kassera resten av supernatanten. Resuspendera pärlorna i 0,5 ml IPP150 buffert (10 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% NP-40) genom att pipettera 4-6 gånger. Överföra till ett 1,5 ml kallt rör.
    8. Upprepa tvättningar med 0,5 ml av IPP150 buffert två gånger till.
    9. Tvätta pärlor tre gånger med 0,5 ml FLAG nativt elueringsbuffert (20 mM Bis-Tris, pH 7, 20 mM NaCl, 0,02% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 200 mM ε-aminokapronsyra). Med den sista tvättningen, överför pärlorna till ett nytt kallt rör. Ta buffert ordentligt.
    10. Resuspendera kulorna i 100 mikroliter av 200 ug / ml 3x FLAG-peptiden i nativ elueringsbuffert. Inkubera vid 4 ° C under 10 min med försiktig rotation.
    11. Samla pärlorna med magneten och överför supernatanten till en kall nytt rör.
    12. Upprepa steg 1.3.10-1.3.11 två gånger. Pool alla eluat.
    13. Koncentrera eluatet ned till 25 mikroliter i en centrifugal filterenhet (10 kDa nominell molekylviktsgräns cut-off, PSE) genom centrifugering vid 10000 xg vid 4 ° C. Överföra den koncentrerade eluatet till en ny kall rör och till 50% glycerol för en slutkoncentration av 5%. Den koncentrerade eluatet kan hållas vid 4 ° C över natten om det behövs.

2. Blå Native PAGE

  1. förberedelser
    1. Förbereda ett L av 1x nativ PAGE Anod Buffer, 1x nativ PAGE Mörkblå Cathode Buffert och 1x nativ PAGE Ljusblå Katod buffert.
    2. Avlägsna kam av en förgjuten 3-12% nativ PAGE-gel och tvätta brunnarna två gånger med 1x nativ PAGE Mörkblå Katod buffert. Fyll brunnarna med 1x native PAGE Dark Blue Cathode buffert. Ställa in gelén i kör tanken men som inte tillför Mörkblå katodbufferten till katoden (inuti) kammare.
  2. Elektrofore run
    1. Preparera provet: Till de 25 mikroliter koncentrerade eluatet tillsätt lämplig volym av 4x nativ provladdningsbuffert och 0,5% G-250 provtillsats för slutkoncentrationer av 1x och 0,005% respektive.
    2. Ladda provet och nativa molekylviktsmarkörer som lämnar en tom brunn between dem. Belastning 10-20 mikroliter av 1x nativ provladdningsbuffert i alla tomma brunnar.
    3. Fylla katoden (inuti) kammare med 200 ml 1x nativ PAGE Mörkblå Katod Buffert försiktigt för att inte störa proverna. Fylla anoden (utanför) kammare med 550 ml 1x nativ PAGE Anod Buffer.
    4. Kör gelén vid 150 V under 30 min. Stoppa körningen bort Mörkblå Cathode buffert med en serologisk pipett och ersätta med 1x Ljusblå Cathode buffert. Fortsätt kör för 60 minuter. Gelén kan köras vid rumstemperatur eller vid 4 ° C; temperaturen kan ha en effekt på protein komplex struktur.
  3. gel färgning
    1. Öppna gelkassetten och kassera en av de kassettplattor. Gelén förblir fäst till den andra kassettplatta. Överför gelén i en bricka eller behållare innehållande tillräckligt fixativ lösning (40% metanol, 2% ättiksyra) för att täcka gelén och inkubera under 30 min med försiktig skakning.
    2. Ta bort fixerings solution och tillsätt tillräckligt med vatten för att täcka gelén. Gelen kan skannas för framtida referens.

3. masspektrometri Analys

Notera: Alla efterföljande steg bör utföras i ett laminärt flöde huva om möjligt för att säkerställa renhet av proverna. Alla lösningar bör förberedas med HPLC-kvalitet vatten. Diskutera detta protokoll med masspektrometri laboratorium som kommer att utföra analysen.

  1. förberedelser
    1. Placera en konisk botten 96-brunns platta på toppen av en annan 96-brunnsplatta för uppsamling av avfall. Pierce botten av brunnarna i den koniska bottnen 96-brunnsplatta med en 21 G nål.
    2. Tvätta brunnarna i den genomborrade 96-brunnsplatta.
      1. Tillsätt 200 pl av 50% acetonitril-0,25% myrsyra till brunnarna i den genomborrade plattan. Inkubera plattstapeln i en skakanordning under 10 min.
      2. Centrifugera vid 500 xg under 1 min, så att vätskan strömmar genom hålen in i avfallsuppsamlingsplattan. Kassera waste vätska.
      3. Upprepa steg 3.1.2.1-3.1.2.2 ytterligare två gånger.
      4. Fylla brunnarna i den genomborrade 96-brunnar med 150 pl av 50 mM ammoniumbikarbonat (nyligen gjort).
    3. Tvätta brunnarna i en centrifugalfiltrering 96-brunnsplatta.
      1. Placera en normal 96-brunnsplatta under centrifugalfiltrering plattan för uppsamling av avfall. Tillsätt 200 pl av 50% acetonitril-0,25% myrsyra till varje brunn i centrifugalfiltrering plattan.
      2. Centrifugera plattstapeln vid 200 xg under 1 min. Kasta avfallet.
      3. Upprepa steg 3.1.3.1-3.1.3.2 ytterligare två gånger.
  2. Gel excision och in-gel digestion
    OBS: Även skära gelen, identifiera och göra en del av gel slice i linje med var och en av proteinstandarder. Proteinstandarder kan användas för att uppskatta ungefärliga molekylvikter för alla gelskivor.
    1. Placera gelén med glasplattan på en ren yta. Skiva banan innehållering provet i 48 identiska skivor (1,5 mm x 5 mm). Skär varje skiva i 2-3 mindre bitar (utom de sista fem skivor i toppen av gelén) och placera varje skiva sekventiellt i en brunn av den genomborrade och tvättades 96-brunnsplatta.
    2. Lägg 50 mikroliter acetonitril till varje brunn. Inkubera plattan under skakning under 30-60 min. Avlägsna vätskan genom centrifugering såsom i steg 3.1.2.2.
    3. Lägga 200 mikroliter av 2 mM TCEP i 50 mM ammoniumbikarbonat till varje brunn. Inkubera plattan med skakning under 30 min vid rumstemperatur. Avlägsna vätskan genom centrifugering såsom i steg 3.1.2.2.
    4. Lägga 200 mikroliter av 4 mM jodacetamid i 50 mM ammoniumbikarbonat till varje brunn. Inkubera plattan med skakning under 30 min vid 37 ° C i mörker. Avlägsna vätskan genom centrifugering såsom i steg 3.1.2.2.
    5. Lägga 150 mikroliter av 50 mM ammoniumbikarbonat plus 50 ul acetonitril och inkubera plattan med skakning under 30 min vid rumstemperatur. Upprepa detta tvättsteg as många gånger som krävs tills all blå färg avlägsnas från gelbitama.
    6. Dehydratisera gelbitama genom tillsats av 200 mikroliter av ren acetonitril och inkubera under skakning vid rumstemperatur i 20 min tills gelbitama är vita och opaka. Ta acetonitril.
    7. Lägga 150 mikroliter av 0,001 mg / ml av trypsin (sekvenseringskvalitet) i kall 50 mM ammoniumbikarbonat till varje brunn. Inkubera plattan under skakning vid 37 ° C under 2 h. Efter 1 h, kontrollera att gelbitama är täckta med vätska; om detta inte är fallet, lägga till ytterligare 50-100 mikroliter av 50 mM ammoniumbikarbonat. Efter 2 h vid 37 ° C, fortsätta digerering vid 25 ° C över natten.
    8. Placera en ren konisk bottenplatta under gelinnehållande plattan, vilket säkerställer korrekt orientering av plattorna. Samla den vätska som innehåller peptidema genom centrifugering vid 200 xg under 1 min.
    9. Placera peptider-innehållande platta i en centrifugalindunstare och indunsta vätskan samtidigt utföra than nästa steg.
    10. Tillsätt 150 | il av 50% acetonitril-0,25% myrsyra till gelbitama. Inkubera under skakning vid 37 ° C under 30 min.
    11. Samla upp vätska i den partiellt torkade plattan från steg 3.2.9 genom centrifugering vid 200 xg under 1 min. Fortsätta indunstning av peptider innehållande plattan samtidigt utför nästa steg.
    12. Upprepa steg 3.2.10-3.2.11.
    13. Tillsätt 200 | il av ren acetonitril till varje brunn i plattan innehållande gelbitama. Inkubera under skakning vid rumstemperatur i 15 min.
    14. Samla upp vätskan i peptider innehållande plattan genom centrifugering vid 200 xg under 1 min.
    15. Se till att den slutliga koncentrationen av acetonitril i alla brunnar är över 55%. Om det behövs, lägga till extra ren acetonitril.
    16. Överföra de peptidlösningar till den tvättade centrifugalfiltrering platta. Placera en ren konisk bottenplatta under det att samla peptiderna. Centrifugera plattstapeln vid 200 xg under 1 min.
    17. Evaporåt vätskan i den koniska bottenplattan tills brunnarna är helt torra. Plattan kan täckas med ett silikonlock och lagrades vid -20 ° C vid detta skede.
    18. Re-upplösa peptider i 32 mikroliter av 0,5% myrsyra under kraftig skakning under 15 min. Lägga 8 mikroliter av 400 mM ammoniumbikarbonat och inkubera under kraftig skakning under 15 min. Centrifugera plattan vid 200 xg under 1 min. Täck med en silikonlock och förvara plattan vid -20 ° C tills masspektrometrianalys.
  3. Masspektrometri
    OBS: Analysera peptider på en hög upplösning masspektrometer med hjälp av metoder som är kompatibla med hagelgevär proteomik. Databeroende förvärvet är den mest använda LC-tandem MS set-up för denna typ av analys och bör optimeras för effektiv peptididentifiering, minimera redundanta sekvensering och val kandidat över bakgrundsbruset. Masspektra i scannings första stegets massanalys (MS 1) bör registreras i profil läge. Det är rekommenderared att företrädesvis välja dubbelt och tredubbelt laddade joner för andra stegets massanalys (MS2). Ett massområde av m / z 400-1,600 är lämplig för att identifiera de flesta peptider mellan 8-30 aminosyror intervall. Här, är ett protokoll för analys med användning av en Orbitrap masspektrometer tillgänglig.
    1. Injicera 20 mikroliter av prov per analys som använder den automatiska provtagaren av en nanoLC-MS / MS-systemet. Avsalta och koncentrera peptider på en omvänd fas C18-kolonn (100 | j, m id, 2 cm).
    2. Separata peptider på en analytisk C18-kolonn (75 | j, m id, 15 cm) med användning av en 30 min linjär gradient av 4-28% acetonitril / 0,1% myrsyra vid 300 nL / min.
    3. Analysera peptider i en masspektrometer med en topp 10 databeroende förvärvsmetoden med följande parametrar: m / z intervall 380-1,600, upplösning 30 tusen vid m / z 400, isolering bredd 2 Th, dynamisk uteslutning vid ± 10 ppm under 45 s , automatisk mål förstärkningsreglering vid ett x 10 6 för MS och 5000 för MS / MS, injektion maximala tiden 150 ms för MS och100 ms för MS / MS.

4. Dataanalys

  1. Protein identifiering och kvantifiering med användning MaxQuant
    1. Använda den fritt tillgängliga MaxQuant programvara för att identifiera och kvantifiera proteiner i varje gelfraktion från masspektrometri rådata.
      OBS: MaxQuant fungerar på data som genereras av databeroende förvärvs hagelgevär proteomik metoder. De MS-data från de blå nativa gelfraktionerna bör analyseras i batch som separata experiment och inte som fraktioner av ett experiment som kombinerar alla gelskivor. Kontrollera iBAQ värde rutan för att göra stökiometri beräkningar. Detaljerade protokoll för databassökning och protein kvantifiering med användning MaxQuant beskrivs i 21, 22.
  2. Protein profilanalys med hjälp av Perseus
    1. Använd fritt tillgänglig mjukvara Perseus att visa migrationsprofiler för de identifierade proteinerna och jämföra dem medStatistisk analys.
      OBS: Allmän dokumentation om hur man använder Perseus finns på http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials. Ett prov datauppsättning är tillgänglig som extra data.
    2. Ladda upp den proteingroups.txt filen returneras av MaxQuant analys innehållande protein identifieringar och kvantifiering värden för alla gelfraktionerna. Befolka intensitetsvärdena till Main boxen (Figur 1). En matris kommer att visas innehållande alla protein identifieringar i rader, med gelfraktionerna som kolumner.
    3. Ta bort poster som motsvarar omvänd träffar, proteiner endast identifierats genom webbplatsen och potentiella föroreningar genom att välja Filtrera rader baserat på kategoriska kolumn i Filtrera rader rullgardinsmenyn (figur 2).
    4. Normalisera fraktionsintensiteterna för varje protein över profilen mot den totala proteinintensiteten genom att välja Divide i Normalisera rullgardinsmenyn, därefter Sum (Figur 3). En ny mATRIX visas.
    5. Visa migration profil tomter av alla proteiner genom att välja profil Plot i Visualisering rullgardinsmenyn (figur 4).
    6. Välj Filter rader baserat på giltiga värden i filtret rader rullgardinsmenyn. Ange en av antalet giltiga värden som krävs.
    7. Utför hierarkisk klustring av identifierade proteiner i alla blå infödda gelfraktioner genom att välja hierarkiska klustring i Kluster / PCA rullgardinsmenyn. Avmarkera Kolumner trädet boxen (Figur 5). Klustren visualiseras i en värme kartan i fliken Kluster intill matrisen (figur 6).
    8. Lokalisera klustret innehållande betesproteinet i dendrogram. Andra komponenter i klustret representerar proteiner sam-migrerar med betet och är därför potentiella interagerande proteiner / subenheter av samma komplex.

Figur 1 r /> Figur 1. Skärmdump av Perseus dataöverföring fönster. Figuren visar stegen för laddning av proteinidentifiering och kvantifiering data till Perseus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Skärmbild av Perseus fönster för filtrering av poster som motsvarar föroreningar, omvänd träffar och proteiner som identifierats genom site. Välja Filter rader av kategoriska kolumn öppnas ett nytt fönster för att välja vilken typ av protein poster tas bort från datamängden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

/55498fig3.jpg"/>
Figur 3. Skärmdump av Perseus normalisering fönster. Välja Divide i normaliserings menyn öppnas ett nytt fönster med olika alternativ. Välja Sum uppdelar intensitetsvärdet för ett protein i varje fraktion genom den totala intensiteten av det proteinet i alla fraktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Skärmdump av Perseus visar migrationsprofil tomter. Proteiner kan väljas i matrisen nedan profilerna att belysa deras motsvarande profil. Verktygsfältet kan användas för att redigera och exportera profilerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 5. Skärmdump av Perseus hierarkisk klustring fönster. Figuren visar inställningarna för hierarkisk klustring av proteiner med användning av Manhattan (L1) avståndsmått. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. Skärmbild av Perseus visar dendrogram och protein intensiteter heatmap. Arbetsflödet på den högra sidan av huvudpanelen visar varje steg utförs och den resulterande matrisen, och kan användas för att ångra något steg. Arbetsflödet kan också avgrenas från någon mellanliggande matris. Klicka här för att se en större version av denna figure.

  1. Beräkning av relativ stökiometri
    1. Välj subenheter av ett proteinkomplex baserat på deras co-klustring med betesproteinet och avgränsa profiltoppen (s) där de visas.
    2. Använda iBAQ värden returneras av MaxQuant analys för varje subenhet i varje fraktion separat och normalisera med motsvarande bete iBAQ värde i den fraktionen.
    3. Plotta normaliserade iBAQs för bete och protein komplexa subenheter tvärs fraktionerna av den valda toppen och tillämpa linjär regression. Beräkna relativa mängden komplexa subenheten att bete genom att jämföra trender deras normaliserade iBAQ värden.
  2. Uppskattning av proteinkomplex storlek
    1. Använda proteinstandarder för att beräkna predikterade molekylvikter för de inriktnings blå nativa gelskivor från provet körfält. Från dessa, generera en linjär regressionsmodell genom att plotta gelskivor i x -axeln och molekylvikter i y -axeln. Använda modellen för att uppskatta den observerade molekylviktsområde av proteinkomplexet (er) baserat på den blå nativa slice (er) från vilka de identifierades.

Representative Results

Arbetsflödet av Affinitetsrening Blå nativt protein Korrelation profilering genom masspektrometri (ABC-MS) strategi visas i figur 7. Nativa proteinkomplex runt ett protein av intresse isoleras genom affinitetsrening med användning av antikroppar mot en epitop-tag (i detta fall FLAG) och kompetitiv eluering. Komplexen löses med BN-PAGE, och hela gel lane skärs ut i 48 sektioner, och preparerades för hagelgevär LC-MS / MS. Kvantitativ MS-informationen används för att generera en migrationsprofil för varje identifierad proteinet över blå nativa separation. Proteiner som interagerar för att bilda en distinkt komplex display liknande migrationsprofiler med överlagringsbara toppar. När ett protein av intresse deltar i mer än en montering, är multipla toppar observerades i dess migrationsprofil, med tanke på de sub-komplexen är inom upplösningseffekten hos den blå nativ gel. En systematisk jämförelse av migranson profiler kan uppnås genom protein korrelation profilering med användning hierarkisk klustring. Den dendrogram och toppintensiteterna för alla fraktioner visualiseras i en värmekarta, som underlättar identifiering av interagerande proteiner som hör till distinkta proteinkomplex (Figur 8).

Vi använde denna strategi för att analysera de samverkande partner Mta2, en kärna subenheten av nurd kromatinremodellering komplexa 20. Såsom visas i fig 9, migrationsprofilen för Mta2 visade två toppar av distinkta intensiteter mellan 700 kDa och 1,2 MDa, med den lägre masstopp som visar högre överflöd. Andra nurd kärn subenheter, inklusive Mta1 / 3, HDAC1 / 2 och Mbd3, visade identiska separationsmönster, om än topparna för vissa av de subenheter, nämligen Chd4, Gatad2a / b och Rbbp4 / 7, hade den inversa överflöd fördelningen (figur 9A, B). Däremot profil Cdk2ap1, en reglerande faktor som rekryterar den nurd komplexet till Wnt genpromotorer 23, visas endast den högre masstopp (Figur 9C), och så gjorde Sall4, en transkriptionell repressor som också har visats binda nurd 20, 24, 25. Således, var fraktionering av affinitetsrenade Mta2 associerade proteiner genom blå nativ PAGE kan lösa två olika former av nurd komplex.

ABC-MS tillåter också identifiering av nya interactmedlemmar samtidigt tilldela dem till speciella protein enheter. Genom granskning av de proteiner kluster och fraktions intensiteter representerade i ett värme karta vi upptäckt ett starkt samband mellan nurd subenheter och Wdr5, en regulatorisk underenhet av MLL metyltransferas komplexet 26, med Wdr5 uppvisar två migreringstoppar som sammanfaller med de två nurd peaks (Figur 8), vilket antyder en ny interaktion mellan Wdr5 och nurd. Vi bekräftade denna interaktion med co-immunoprecipitation och co-migration i gelkromatografi 20.

Valet av avståndsmåttet beräkning i den hierarkiska klustring kommer att påverka formen på kluster och därmed de korrelationer. Vi rekommenderar att experimentera med olika mått för att uppnå bästa passform med befintlig interaktion kunskap om protein eller komplex av intresse. Generellt vi uppnått de bästa resultaten med Manhattan (L1) avstånd metric 20. Pearson korrelation eller euklidiska avståndsmått har också rapporterats för att identifiera komplex baserade på alternativa fraktioneringstekniker 10, 11, 12.

Quantitative MS-data erhållna från de blå nativa fraktionerna kan också användas för att bestämma stökiometrin för proteinkomplex. Den iBAQ (intensitet baserat absolut kvantifiering) värdet ger ett mått på relativ förekomst av de identifierade proteinerna 27, 28. De iBAQ värdena för de protein komplexa medlemmar i alla de fraktioner inom en migrationsprofil topp är normaliserade till den hos betesproteinet för att erhålla relativa mängder. De normaliserade iBAQs över en profil topp för en given proteinkomplex medlem bör följa en horisontell trend och trend värden återspeglar stökiometrin för de interagerande proteinerna relativt betesproteinet. För en mer detaljerad representation av stökiometri beräkningar finns 20.

figur 7
Figur 7: Schematisk arbetsflödet som sammanfattar ABC-MS sTRATEGI. Denna siffra är modifierad från 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8. Hierarkisk klustring av BN-PAGE-migrationsprofiler av Mta2 påverkare. Mta2-associerade proteiner grupperade baserat på likheten mellan deras migrationsprofiler. Endast en delmängd av den värme karta innehållande nurd komplexet visas (innesluten i den blå rutan). Den gula rutan belyser det starka sambandet mellan Wdr5 med nurd komplex. De kommenterade molekylvikter uppskattades från migreringsavstånden proteinstandarder körda i samma gel. Denna forskning publicerades ursprungligen i molekylär och cellulär Proteomics 20 American Society for biokemi och Mo lecular Biology. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 9
Figur 9. BN-PAGE migrering profilen för nurd subenheter och associerade proteiner. A) Mta2 och nurd subenheter är närvarande vid en liknande intensitetsmönster. B) Mta2 och nurd subenheter med den inversa intensitetsmönstret. C) Mta2 och Cdk2ap1, som är närvarande endast i den högre molekylvikten nurd enhet. De kommenterade molekylvikter uppskattades från migrationsprofilen för proteinstandarder. Denna forskning publicerades ursprungligen i Molecular and Cellular Proteomics 20 American Society for biokemi och molekylärbiologi._blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

kompletterande File
Kompletterande data: Prov dataset. MaxQuant-härledda proteingroups.txt fil som innehåller protein identifieringar och kvantifiering värden från en ABC-MS experimentet. Denna forskning publicerades ursprungligen i Molecular and Cellular Proteomics 20 American Society for biokemi och molekylärbiologi. Klicka här för att ladda ner filen.

Discussion

Här beskriver vi användningen av affinitetsrening följt av blå nativ gelelektrofores i kombination med kvantitativ masspektrometri för att lösa proteinkomplex. Detta tillvägagångssätt erbjuder en metod för att riva upp endimensionella proteininteraktionslistor i funktionella proteinaggregat.

Vi visar den metod som bygger på användning av epitopmärkta proteiner. Emellertid, om en cellinje som uttrycker ett märkt protein inte är tillgänglig, kanske ett alternativ vara att använda antikroppar mot proteinet av intresse, förutsatt att det är en peptid som finns för att uppnå nativt kompetitiv eluering. Den mängd utgångsmaterial och mängd av pärlor kan behöva modifieras beroende på expressionsnivån av målproteinet. Vi utför typiskt detta protokoll med 2-5 x 10 8 celler utgångsmaterial, och detta är tillräckligt även för proteiner med låg expressionsnivå. Lysbufferten kompositionen bör väljas empiriskt för att uppnånära att slutföra upplösningen av betet. Detta kan vara svårt för vissa typer av proteiner, i synnerhet kromatin-bindning eller membranproteiner. Alternativ är att öka mängden av salt, förutsatt att proteinkomplexet som studeras är stabilt i hög salthalt, eller med användning av sonikering och / eller nukleasbehandling för kromatin bindande proteiner 20, 29. I fallet av membranproteiner, kan omkopplings detergent till DDM eller digitonin vara tillrådligt 30. I fallet med DNA-bindande proteiner, är det användbart att inkludera ett nukleas såsom Benzonase under reningssteget 20. Fullständigt avlägsnande av nukleinsyror säkerställer att interaktioner detekterade ske mellan proteiner och är inte medieras av DNA.

Ett kritiskt element att beakta när man använder denna metod är stabiliteten hos komplexet som undersöks. Tillvägagångssättet är lång och kan innebära preserving proteinkomplexet över natten. Vi har uppnått god framgång med två kromatinremodellering komplex (D. Bode och M. Pardo, data visas inte), men detta bör utvärderas. Steget affinitetsrening kan förkortas om så erfordras.

Alternativa tekniker som gör att nativt fraktione, såsom storleksexklusionskromatografi, har i stor utsträckning använts i över 50 år för att karakterisera proteinkomplex. Vi och andra har visat att lösningen av blå nativ PAGE är överlägsen den som uppnås med användning av storlekssorterande kromatografi 20, 31, 32, 33. En annan fördel med blå nativ PAGE är att den inte kräver kromatografisystem, som är dyrt, utan snarare använder protein elektroforesutrustning som är utbredd i laboratorier. När det gäller praktisk tid, den här metoden inte innebär mer arbete än den traditionella geLC-MS / MS aILLVÄGAGÅNGSSÄTT eller offline kromatografisk fraktionering. Men eftersom de flesta fraktioneringstekniker gör, har det en gräns för sin upplösning. Komplex som är mycket homogen eller nära i massa och form kan vara bortom upplösning som erbjuds av blått infödd PAGE, och därmed det protokoll som rapporteras här är kanske inte allmänt framgångsrik i att lösa olika komplex med delade subenheter. Uppmuntrande, har vi varit framgångsrika i att separera två mycket likartade tetra komplex som delar tre subenheter (M. Pardo, manuskript under utarbetande).

Eftersom masspektrometri blivit allt känsligare, kan även mycket små mängder av icke-specifika Interactmedlemmar och föroreningar detekteras i AP-MS-proverna. Den metod som presenteras här kan hjälpa till vid diskriminering av verkliga interactmedlemmar från bakgrundskontaminering i affinitetsrening genom att fokusera uppmärksamheten på proteiner med migrations toppar som sammanfaller med bete migrations toppar vid högre molekylvikt än den hosde monomera proteiner.

Flera grupper har använt fraktioneringstekniker, följt av proteinkorrelations profilering att avgränsa proteinkomplex vid cellulär skala utan behov av föregående isolering 10, 11, 12, 34. Detta kan dock innebära att upptäcka under stökiometriska interaktioner. Inkorporeringen av ett anrikningssteg genom affinitetsrening kan hjälpa till att övervinna detta. Det tillvägagångssätt som beskrivs här bör vara allmänt användbar för att utforska topologi av proteinkomplex och unraveling de multipla komplexen ett givet protein tar del i inom samma cellulära sammanhanget. Strategin är enkel och mottaglig för laboratorier som inte kan ha dyra kromatografiska fraktione utrustning för att lösa proteinkomplex.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein G Dynabeads Life Technologies 10003D
FLAG antibody M2 Sigma-Aldrich F1804
Tween-20, protein grade, 10% solution Millipore 655206
Dimethyl pimelimidate Sigma-Aldrich 80490
0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2 Sigma-Aldrich T0449
3x FLAG peptide Sigma-Aldrich F4799
Vivaspin 5K NMWCO, PES Sartorius VS0112
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel Life Technologies BN1001
20x NativePAGE Running Buffer Life Technologies BN2001
20x NativePAGE Cathode Additive Life Technologies BN2002
4x NativePAGE sample loading buffer Life Technologies BN2003
NativeMARK Life Technologies LC0725
NativePAGE 5% G-250 sample additive  Life Technologies BN2004
Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene Thermo 249944
Multiscreen HTS 96-well filtration system Thermo MSDVN6550
Nunc 96-well cap natural Thermo 276002
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) Sigma-Aldrich 646547
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I1149
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific A/0627/17
Trypsin, sequencing grade Roche 11418475001
MaxQuant (software) N.A. N.A. http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
Perseus (software) N.A. N.A. http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goudreault, M., et al. A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein. Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).
  2. Leitner, A., et al. Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics. Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).
  3. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  4. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).
  5. Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. Mass spectrometry supported determination of protein complex structure. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).
  6. Kaake, R. M., et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).
  7. Kao, A., et al. Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes. Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).
  8. Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes. Methods. 61 (2), 98-104 (2013).
  9. Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase. J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).
  10. Havugimana, P. C., et al. A census of human soluble protein complexes. Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).
  11. Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).
  12. Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome. Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).
  13. Liu, F., Heck, A. J. Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry. Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).
  14. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  15. Heide, H., et al. Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex. Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).
  16. Wessels, H. J., et al. Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling. PLoS One. 8 (7), 68340 (2013).
  17. Wessels, H. J., et al. LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes. Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).
  18. Remmerie, N., et al. Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods. J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).
  19. Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry. Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).
  20. Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).
  21. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  22. Cox, J., et al. A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics. Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).
  23. Kim, J. J., et al. A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).
  24. Lauberth, S. M., Rauchman, M. A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex. J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).
  25. Miller, A., et al. Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex. Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).
  26. Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases. J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).
  27. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  28. Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics. Nucleic Acids Res. 41 (1), 28 (2013).
  29. Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners. J Proteomics. 100, 55-59 (2014).
  30. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  31. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  32. Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
  33. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).
  34. Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).

Tags

Biokemi Blå naturlig PAGE protein korrelations profilering multiproteinkomplex affinitetsrening kvantitativ masspektrometri interactome AP-MS interaktion protein
Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pardo, M., Bode, D., Yu, L.,… More

Pardo, M., Bode, D., Yu, L., Choudhary, J. S. Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling. J. Vis. Exp. (122), e55498, doi:10.3791/55498 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter