Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Атомно-силовая микроскопия Исследования распознавания повреждения ДНК при восстановлении эксцизии нуклеотидов

Published: May 24, 2017 doi: 10.3791/55501
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg
* These authors contributed equally

Introduction

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является мощным методом анализа взаимодействий белок-ДНК 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Это требует только небольшого количества материала образца, чтобы непосредственно визуализировать гетерогенные образцы с разрешением на уровне одной молекулы. Неоднородность может быть результатом различных конформационных или олигомерных состояний белка. В частности, в контексте образцов белковой ДНК белковые комплексы могут отображать различные стехиометрии и / или конформации, индуцированные связыванием ДНК в целом или связываясь с конкретным сайтом-мишенью в ДНК. Гетерогенные образцы также могут содержать два (или более) различных вида белков и различный белковый комплексФормы ( например , состоящие только из одного типа белковых и гетеромерных комплексов) могут по-разному взаимодействовать с ДНК. Обсуждаемые здесь исследования используют AFM-визуализацию в воздухе на статических, высушенных образцах репарационных ДНК-белков, связанных с длинными фрагментами ДНК (~ 900 пар оснований, bp), которые содержат поражение, которое представляет собой мишень этих белков. Высокое молекулярное разрешение AFM позволяет различать различные типы белковых комплексов и определять позиции связывания белков на фрагментах ДНК. Важно отметить, что повреждения вносятся в ДНК-субстраты в четко определенных положениях. Поскольку положение участка поражения в ДНК известно, распределения белков, связанных с ДНК, обеспечивают понимание различительных (распознающих) свойств распознавания поражения (различных) белковых комплексов, например , насколько хорошо они распознают определенный тип поражения (по сравнению К неразрушенной ДНК) 2 , 3 , , 5 , 6 . Их положения в ДНК также позволяют различать белковые комплексы, специфически связанные с поражениями и комплексами, связанными неспецифически в другом месте ДНК. Отдельная характеристика этих различных сложных типов (комплексы, специфически связанные с повреждением против неспецифических комплексов) может выявить потенциальные конформационные изменения в комплексах, индуцированных при идентификации целевого сайта.

Рекомбинантные белки репарации ДНК - это геликазы, которые ответственны за распознавание поражения в пути восстановления иссекающих нуклеотидов (NER). В бактериях NER достигается белками UvrA, UvrB и UvrC. UvrA отвечает за первичное зондирование поражения в ДНК-сканирующем комплексе UvaA 2 / UvrB 2 . После проверки на повреждение UvrB этот комплекс превращается в мономерный UvrB, связанный на участке повреждения, и этот специфический комплекс может затем набирать pРокариотическая эндонуклеаза NER UvrC. UvrC вырезает короткий (12-13 NT) участок одноцепочечной ДНК (оцДНК), содержащей поражение. Отсутствующее растяжение затем снова заполняется ДНК-полимеразой. Наконец, лигаза ДНК уплотняет вновь синтезированное растение с исходной ДНК 9 , 10 . У эукариот большинство белков каскада NER являются частью большого, мультимерного комплекса транскрипционного фактора II H (TFIIH). После первичного обнаружения поражения через тримерный комплекс CEN2-XPC-HR23B, TFIIH рекрутируется в целевой участок ДНК. Когда XPD внутри комплекса проверяет наличие поражения NER-мишени, эукариотические эндонуклеазы NER XPG и XPF рекрутируются для акциза короткого (24-32 nt) участка оцДНК, содержащего поражение 9,10. Здесь, в частности, изучались геликазы UvrB и XPD из прокариот и эукариотических NER, соответственно. Эти геликазы нуждаются в непарномДНК (пузырь ДНК) наматывается на одну из двух одиночных нитей ДНК и затем транслоцируется вдоль этой цепи, подпитываемой гидролизом АТФ. В дополнение к повреждениям ДНК, пузырь ДНК был, следовательно, введен в субстраты, которые функционируют как место загрузки белков.

Процедура получения специфических субстратов ДНК поражения описана ранее 11 . Для этого требуется кольцевая ДНК-конструкция (плазмида) с двумя близко расположенными рестрикционными сайтами для нимазы. В контексте этого исследования была использована плазмида pUC19N (2729 bp) (создана лабораторией С. Вильсона, NIEHS). Эта плазмида содержит три близко расположенные рестрикционные сайты для нимазы Nt.BstNBI, которые образуют 48-нуклеотидное (nt) растяжение. После инкубации с нимазой участок ссДНК между этими сайтами можно удалить и заменить олигонуклеотидом, содержащим любую целевую особенность. После каждой стадии полное ферментативное расщепление испытывают через агарозный гельэлектрофорез. Никеированная кольцевая ДНК может быть различена из-за ее более низкой электрофоретической подвижности по сравнению с исходной суперспирализованной плазмидой. Промежуток ДНК и замещение удаленной вытяжки специфическим олигонуклеотидом субстрата можно оценить путем переваривания ферментом рестрикции, который вырезает субстрат исключительно в области между никами. Таким образом, линеаризация круговой плазмиды ферментом будет подавлена ​​для разрыхленной ДНК и восстановлена ​​после вставки специфического олигонуклеотида. Наконец, два сайта редукции эндонуклеазами (в идеале одиночные резцы) позволяют получить линейный ДНК-субстрат с желаемой длиной и с определенным сайтом-мишенью в определенном положении, а также пузырь ДНК на расстоянии от очага поражения либо в 5 'Или 3' направлении.

Распознавание поражений геликазными НЕР можно исследовать с помощью визуализации АСМ. Замедленная транслокация ДНК геликаз при tОн участок поражения виден как пик в расположении положения белка на ДНК и указывает на распознавание поражения. Поскольку транслокация ДНК этих геликаз является, кроме того, направленной, с полярностью 5'-к-3 ', зависимость распознавания поражения от положения места загрузки (пузырь ДНК вверх или вниз по течению от повреждения) также указывает, является ли поражение преимущественно распознаваемым На транслоцированной или на противоположной, неперемещенной нити оцДНК 5 , 9 . В следующих разделах будут использованы используемые методы, и основные результаты этих экспериментов будут кратко обсуждаться. Важно отметить, что аналогично примерной работе по восстановлению ДНК, показанной здесь, АФМ-визуализация может быть применена к изучению различных взаимодействующих с ДНК систем, таких как репликация ДНК или транскрипция 8 , 12 , 13 , 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка образцов

  1. Приготовление ДНК субстратов 11
    1. Создание щели оцДНК в плазмиде
      1. Полностью переварить образец плазмиды (здесь: модифицированный pUC19, pUC19N) в реакционной трубке с подходящей никазой (здесь: Nt.BstNBI) с последующей инактивацией тепла инактивацией фермента, используя условия в соответствии с протоколом производителя (см. презентация). Начните с ~ 50 мкл и ~ 500 нМ плазмиды с достаточным выходом.
      2. Проверьте наложение плазмиды электрофорезом в агарозном геле на разбавленных образцах (~ 20 нМ) 15 . Наденьте перчатки для защиты от ДНК-связывающего красителя, используемого для визуализации ДНК.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Различные электрофоретические подвижности позволяют различать никелевую (релаксированную) и сверхскрученную кольцевую плазмидную ДНК ( рис. 1 ).
      3. Удалите вырезанное оцДНК-стрейч (между сайтами ников) из плазмиды с помощьюИнкубацию с 10-кратным избытком комплементарного олигонуклеотида (олигонуклеотид 1 в таблице 1 ), встряхиванием при 300 об / мин в течение 30 мин вблизи температуры плавления олигонуклеотида (здесь: 68 ° С для pUC19N) в тепловом блоке ( фиг.1 ).
      4. Отделяют плазмиду с зазором от меньших фрагментов ДНК с использованием фильтра с молекулярной массой 50 кДа (MWCO) центрифугированием в течение 10 мин при 10000 мкг в таблетной центрифуге ( фиг.1 ). Чтобы извлечь концентрированную ДНК из фильтра, инвертируйте фильтр и вставьте в новую 1,5 мл реакционную трубку. Центрифуга в течение 3 мин при 1000 х g.
      5. Заполните полученный концентрированный образец ДНК до 500 мкл деионизированной, отфильтрованной водой, добавьте дополнительный ~ 5-кратный избыток комплементарного олигонуклеотида и повторите шаги 1.1.1.3 и 1.1.1.4 не менее 3 раз.
      6. Протестируйте для полного разрыва ДНК путем инкубации с подходящим рестрикционным ферментом (здесь: XhoI или BglII), используя conditiВ соответствии с описанием производителя. Используйте образцы ДНК с разведенным (никированным или пропахшим) (~ 20 нМ). Проведите электрофорез в агарозном геле, чтобы отличить линеаризованную плазмиду (не содержащую щели оцДНК) и неврезанную ДНК (прорезанную ДНК), используя ДНК с никами в качестве положительного контроля (включая опорную лестницу для ДНК, см. Рисунок 1 ). Носить перчатки.
    2. Повторное заполнение щели модифицированными олигонуклеотидами оцДНК
      1. Отцеливают прорезанную плазмиду путем инкубации с 25-кратным избытком 5'-фосфорилированного олигонуклеотида, который содержит специфический целевой сайт (ы) выбора, инкубируя при ~ 45 ° C в течение 4 ч ( фиг.1 ). Здесь используют 48 нт оцДНК, содержащую поражение, либо аддуктированный с флюоресцеином тимин, либо димер циклобутанового пиримидина (CPD), и, кроме того, короткую (8 NT) некомплементарную последовательность для продуцирования ДНК-пузырьков (см. Таблицу 1 ).
      2. Ковалентно связывают отожженную вставку с плазмидой с помощью инкубаС ДНК-лигазой Т4 в течение ночи при комнатной температуре в соответствии с протоколом производителя ( рис. 1 ). Для этой реакции добавляют ATP, содержащий концентрированный буферный основной раствор, для получения подходящих буферных условий для лигазы ( например , используют буфер для реакции UvrB: 50 мМ Tris-HCl pH 7,5, 10 мМ MgCl 2 , 50 мМ KCl, 5 мМ DTT, 1 мМ АТФ).
      3. Тест на введение специфического олигонуклеотида в плазму, заполненную пробелами, путем переваривания разбавленных образцов подходящим рестрикционным ферментом (тот же, что в 1.1.1.6) в соответствии с протоколом производителя, с последующим электрофорезом в агарозном геле (как в 1.1.1.6, Figure 1 ).
    3. Приготовление линейного ДНК-субстрата
      1. Переваривают модифицированную плазмидную ДНК рестрикционными ферментами (в идеале с единственным сайтом рестрикции в плазмиде), используя условия, рекомендованные производителем ( рисунок 1 ). Этот шаг дает линейные фрагменты, содержащиеВставляя вставленную модификацию в определенное положение. Здесь используют срезы SspI и BspQI в положениях 613 и 255 bp выше и ниже по течению от вставки, соответственно, в результате чего фрагмент ДНК размером 916 пар оснований, содержащий специфический участок поражения, составляет ~ 30% от длины ДНК.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Для экспериментов по визуализации АСМ, как описано здесь, подходящими субстратами являются фрагменты ДНК длиной ~ 200 п.н. и ~ 2000 п.о.
      2. Изолируйте целевой фрагмент с помощью электрофореза в агарозном геле и экстракции геля с использованием коммерческого набора. Надевайте защитные перчатки.
      3. Необязательно, разрезайте агарозный гель скальпелем, чтобы отделить лестницу ДНК и разбавленные пробы (первые две дорожки) от дорожек, содержащих концентрированную ДНК, которую необходимо очистить. Только подвергайте гелевую часть первыми двумя дорожками воздействию ультрафиолетового излучения, помещая только эту часть геля на УФ-стол.
        1. Вырежьте полоску, соответствующую фрагменту выбора, с помощью скальпеля. Повторно объединить две части геля (с УФ-ярлыкале). Используйте положение вырезанной полосы из разбавленного образца в качестве ориентации для положения полосы желаемого ДНК-субстрата. Учитывайте более высокую концентрацию, вырезая немного более широкие срезы, чем для разбавленного контроля.
          ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку здесь было обнаружено распознавание УФ-повреждений, при использовании этого подхода в субстрате ДНК было тщательно предотвращено введение дополнительных УФ-лучей посредством УФ-облучения.
      4. Вычислить концентрацию ДНК c в поглощении на 260 нм, измеренную с помощью спектрофотометра UV-Vis с использованием закона Ламберта-Биера с коэффициентом средней молярной экстинкции двойной двунитевой ДНК (dsDNA) ε 260 нм -6 700 М - 1 см - 1 на 1 п.о .:
        Уравнение
        Где L - длина пути (длина измерительной камеры, как правило, 1 см).
    </ Li>
  2. Экспрессия и очистка белков
    1. Рекомбинантно экспрессировать UvrB в E. coli и очищать белок посредством стандартного сродства к хитиновым шарикам 15 и эксклюзионной хроматографии 15, как описано ранее 16 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: ген uvrB от Bacillus caldotenax был клонирован в вектор pTYB1.
    2. Express XPD в Е. coli и очищают белок через стандартное сродство к никелю IDA 15 и эксклюзионную хроматографию 15 с последующей анионообменной хроматографией 15 , как описано ранее 17 .
      ПРИМЕЧАНИЕ : ген для белка группы D Chaetomium thermophilum Xeroderma piggyosum (XPD) был клонирован в вектор pBADM11. C. thermophilum p44 был добрым подарком из лаборатории Кэролайн Кискер, выраженной и пуриFied, как описано 17 .

2. Эксперимент АСМ

  1. Базовые приготовления
    1. Необязательно предварительно инкубировать ДНК-субстрат при 65 ° С в течение 10 мин в тепловом блоке для удаления потенциальных кристаллов микросолей, которые могли образоваться во время хранения в холодильнике.
    2. Готовят реакционный буфер (ы) при 10-кратной концентрации (10х буферы).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Буфер для XPD-реакции при концентрации 1х содержал 20 мМ Трис-HCl pH 7,5, 10 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2 , 1 мМ TCEP, 2 мМ АТФ; 1x буферный раствор UvrB содержал 50 мМ Tris-HCl pH 7,5, 50 мМ KCl, 10 мМ MgCl 2 , 5 мМ DTT и 1 мМ АТФ.
    3. Предварительно инкубировать белки в более высокой концентрации в подходящих условиях инкубации для усиления комплексообразования. Предварительно развести небольшой объем (1 мкл) отдельных белков в 1x белковом реакционном буфере до желаемой концентрации и смешать небольшие объемы ( например , 1 мкл) tОн индивидуальных белковых растворов в 0,5 мл реакционной трубки.
      1. Поместите трубку в тепловой блок для температур инкубации выше комнатной температуры. Выберите коэффициент концентрации в зависимости от ожидаемой комплексной стехиометрии, эквимолярной или соответствующей концентрации. Здесь инкубируют 1 мкл XPD (20 мкМ в 1 х XPD реакционном буфере) и 1 мкл p44 (20 мкМ в 1х XPD реакционном буфере) при 10 мкМ каждый в течение 10 мин при 37 ° С.
    4. Инкубируйте образцы в подходящих концентрациях белка и ДНК в белковом реакционном буфере в 0,5 мл реакционной пробирке. Здесь используют 500 нМ UvrB или 1 мкМ XPD + 1 мкМ р44 и 100 нМ ДНК. Пипетируйте небольшие объемы для сохранения материала, например , 0,25-0,5 мкл белка (предварительно разведенного до 10-кратной концентрации инкубации) и ДНК в общем объеме 2,5-5 мкл 1x белкового реакционного буфера. Здесь, инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С в тепловом блоке. Спирально вниз в реакционной трубе кратко (~ 1 с) в столовом центрифугеE для обеспечения смешивания небольших объемов.
  2. Отбор образцов
    1. Подготовьте слюдяную подложку: отрежьте кусочек слюды приблизительно 1 x 1 см 2 от более крупных полосок с помощью скальпеля. Слейте верхние слои многослойной слюдяной части минерала с помощью клейкой ленты, чтобы выявить чистую, плоскую и атомарно гладкую поверхность подложки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: кусок слюды можно повторно использовать для нескольких экспериментов путем удаления дополнительного слоя (слоев).
    2. Подготовьте буфер для осаждения АСМ деионизированной, отфильтрованной водой, например , 25 мМ HEPES pH 7,5, 25 мМ Na-ацетата, 10 мМ Mg-ацетата. Фильтр через шприцевой фильтр 0,02 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Двухвалентные катионы в буфере осаждения служат для хелатного взаимодействия отрицательно заряженных молекул ДНК с поверхностью слюды, которая также отрицательно заряжается при нейтральном рН. Если относительно высокая концентрация ионов Mg 2+ в буфере осаждения создает проблему для конкретной системы белок-ДНК, альтернативно,Поверхность слюды может быть предварительно загружена аминогруппами с использованием химии на основе силатрана для обеспечения положительных поверхностных зарядов для закрепления 18 . Затем осаждение образца может быть проведено в буфере, который не содержит или содержит только небольшие количества двухвалентных катионов.
    3. Разбавьте пробу (см. 2.1) для немедленного осаждения на слюду в буфере осаждения. Вложите небольшой объем (здесь: 20 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициенты разведения зависят от концентрации образца. Здесь разбавленные образцы 50-100х. Как правило, ~ 1 нМ ДНК приводит к хорошему покрытию поверхности для ~ 1000 пар оснований.
    4. Тщательно прополощите образец три-четыре раза с помощью нескольких миллилитров фильтрованной деионизированной воды, залейте лишнюю жидкость и высушите в слабом потоке азота. Весь процесс от осаждения образца до высушенных образцов может быть выполнен в течение менее 30 с.
    5. Закрепите кусок слюды на предметном стекле микроскопа, используя клейкую ленту по краям.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Различные системы АСМ имеют dIfferent требования для крепления образца к этапу. Другие АСМ обладают магнитными ступенями, а части слюды закреплены на магнитных дисках, например , с использованием термического клея. Подробности используемой здесь системы АСМ можно найти в таблице материалов.
  3. Отображение AFM
    1. Поместите образец (см. 2.2.5) централизованно на этапе AFM и закрепите подставку для микроскопа на сцене магнитными подушечками.
    2. Вставьте наконечник АСМ в держатель наконечника. Используйте кантилеверы с острым (<10 нм) AFM-зонд, подходящим для колебательных, прерывистых контактных изображений в воздухе. Используйте , например, AFM-зонды, как указано в таблице материалов . Здесь (в зависимости от АСМ) закрепите наконечник в держателе под зажимом, затянув зажимной винт (затяните палец). Вставьте держатель наконечника в измерительную головку AFM. Положите голову на спину для этого шага.
    3. Поместите измерительную головку AFM сверху образца. Детали зависят от модели AFM. Здесь mУбедитесь, что голова устойчиво стоит со своими ногами внутри углублений в кадре. Убедитесь, что слюда находится на той стадии, где кончик АСМ будет парить прямо над ней. Винты с микрометрами в правой части сцены обеспечивают точное позиционирование образца.
    4. Совместите лазер AFM на задней части кантилевера для оптимальной мощности сигнала с позиционно-чувствительного фотоприемника, на который отражается лазер. Детали зависят от модели AFM.
      1. Здесь поверните колеса с правой и с задней стороны измерительной головки AFM, чтобы отрегулировать положение x и y для AFM-лазера, чтобы направлять его центрально на конец кантилевера. Посмотрите сигнал отражения в окне видео AFM (если доступно, нажмите здесь значок камеры и выберите вход: Svideo).
      2. После грубого позиционирования оптимизируйте суммарный сигнал детектора (Sum in Sum и Deflection Meter window в программном обеспечении AFM) путем тонкой настройки положения лазера двумя колесами (остановитесь в конце кантилевера, суммой signaL зависит от АСМ и типа кантилевера, здесь: цель для суммы> 5).
    5. Нулевой сигнал разности от верхнего и нижнего диодов матрицы детектора (здесь: сигнал отклонения в окне суммирования и отклонения) путем направления лазерного отражения АСМ на центр детектора (здесь: поверните колесо в левой части измерения АСМ глава).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Отклонения от нуля указывают на отклонение кантилевера из-за поверхностных взаимодействий, которые AFM преобразует в информацию о высоте.
    6. Определите резонансную частоту кантилевера с помощью частотной настройки, реализованной в программном обеспечении AFM (здесь: команда автоматической настройки в окне Master Panel / Tune). Выберите амплитуду, соответствующую входу 1 В для пьезодатчика, который управляет колебаниями кантилевера. Установите частоту колебаний немного (5%) ниже резонансной частоты и обнулите фазу колебаний.
    7. Приблизьте наконечник к поверхности образца, используя сырой модE (здесь: команда Включить в окно главной панели) до достижения защитного параметра (уставки). Используйте ~ 2% отрезки амплитуды колебаний свободного уровня в качестве уставки (здесь введите контрольную точку 980 мВ в мастер-панели).
    8. Мелко зацепите наконечник АСМ с поверхностью образца, опустив заданное значение с помощью программного обеспечения AFM. Стремитесь к отображению отталкивающего режима с фазой осцилляций кантилевера (окно «Фаза в сумме» и «Отклонение») чуть ниже фазы свободного уровня (перед включением, здесь обычно ~ 70). Здесь используйте типичные конечные уставки порядка 70-80% от амплитуды свободного уровня (1 В).
    9. Перед сканированием выберите сигналы для записи на панели главного канала. Выберите высоту (Ht) и амплитуду (Am).
    10. Начните сканирование образцов (здесь: команда Do Scan in Master Panel). Используйте скорость сканирования, например, 2,5 мкм / с (команда Скорость сканирования на главной панели), чтобы получить области поверхности изображения 4 мкм × 4 мкм или 8 мкм × 8 мкм (введите размер сканирования в главной панелиЛ) с разрешением пикселов 2048 или 4096 (точки сканирования и линии сканирования на главной панели) соответственно.
    11. Сохраните файл изображения (команда «Сохранить изображение на главной панели») без изменений фитинга (выберите «Нет» на панели «Мастер-канал» / «Сохранить плоскость»).
    12. Для дальнейшего анализа обработайте сохраненное изображение. Загрузите изображение (команда Просмотр сохраненных данных в меню Анализ АСМ). Откройте панель Modify Panel (нажмите M в верхней части изображения). Примените плоскость в размерах x и y к изображению высоты (расширение HtR) (команда XY в окне Planefit в панели Modify, выберите Planefit Order 3). Затем сгладьте изображение (команда Flatten в окне Flatten в панели Modify), выбрав Flatten Order 3.
    13. Экспортируйте изображение в виде файла TIFF (нажмите «Команды» в верхней части изображения, выберите «Экспорт TIFF 2х», соответствующий разрешению 2048 пикселей) для дальнейшего анализа.

3. АФМ-анализ

  1. Объем белкового комплекса
    1. пред-Выбирать соответствующие комплексы белок-ДНК путем прямого визуального контроля изображений в программном обеспечении AFM с использованием подходящей цветовой схемы для максимизации различных проявлений комплексов разного размера (см. Различные цвета и размеры различных комплексов на рисунке 2 , здесь: цветовая схема SeaLandAndFire в Программное обеспечение AFM). Для образцов XPD возможные комплексы включали ДНК XPD / p44 , а также XPD-ДНК и p44-ДНК с отчетливо различными размерами из-за относительно больших молекулярных масс XPD (~ 95 кДа) и p44 (~ 40 кДа) ,
    2. Измерьте объемы отдельных пиков белка на ДНК для проверки сложного типа. Этого можно достичь с помощью другого графического программного обеспечения (здесь: инструмент раздела программного обеспечения АСМ).
      1. Измерьте высоту (h) и диаметр (d) участков пиков белка с помощью курсоров оконного окна. Измерьте диаметр близко к основанию частица.
      2. Определить объем (V) горохаKs, используя простые математические модели, например , используя следующую формулу, которая основана на модели шарового колпачка:
        Уравнение
    3. Переведите измеренные объемы в приблизительную молекулярную массу белка.
      1. Первоначально откалибруйте систему AFM для преобразования объема в молекулярную массу (MW) с использованием ряда белков с известной молекулярной массой (здесь: всего было проведено 12 экспериментов, каждый из которых проводился между 25 и 851 точками данных на 5 различных белках в мономерных, димерных , Тримерные или тетрамерные состояния) 4 , 19 , 20 . Депозитные и имиджевые белки (как описано выше, в 2.2 и 2.3) и измеряют их объемы, как описано выше (3.1.2). Постройте объемы по их известным молекулярным весам. Результирующий график покажет линейную зависимость между V и MW, уравнение которой можно получить изЛиния, соответствующая данным. Для используемой здесь АСМ-системы было получено следующее соотношение: 19 :
        Уравнение
        ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг не должен повторяться перед каждым измерением, но выполняется только один раз. Калибровка объема до МВ может быть применена к изображениям, полученным в аналогичных условиях визуализации с использованием AFM-зондов с небольшим изменением диаметров.
      2. Основываясь на измеренных объемах (3.1.2) и калибровке V-MW (3.1.3.1), определите приблизительную молекулярную массу белковых комплексов 20 , которая предоставляет информацию о ее молекулярном содержании. Например , для образцов XPD / p44 были получены ~ 50 кДа, ~ 100 кДа и ~ 140 кДа, в соответствии с комплексами ДНК p44 (или пиками, вызванными простой надстройкой ДНК), только пики XPD и пики XPD / p44 соответственно ,
  2. Положения белкового комплекса на ДНК
    1. Определить ДНКДлины фрагментов.
      1. Проследите фрагменты ДНК в AFM-изображениях, например , с помощью функции свободной руки от подходящего программного обеспечения анализа изображений (см., Например, Table of Materials) и измерьте длину линии.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Исключайте агрегаты ДНК, а также фрагменты, обрезанные по краям изображения.
      2. Bin и начертите длины ДНК из всего эксперимента на гистограмме, используя подходящий анализ данных и графическое программное обеспечение (см. Таблицу материалов ).
      3. Подгоните распределение длин по гауссовой кривой в программном анализе и графическом анализе для определения длины фрагментов ДНК. Чтобы узнать положение вставленного участка ДНК-ДНК (см. 1.1), включайте только фрагменты ДНК с правильной длиной в пределах двух стандартных отклонений от центра кривой Гаусса (y = y 0 + z exp (-2 (xx c ) 2 / w 2 ), где z - нормальный фактор, а x c и w - центр иПолная максимальная полуширина гауссова) в дальнейших анализах.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Длина ДНК в центре кривой Гаусса должна быть близка к теоретической длине фрагмента ДНК (рассчитанная с использованием 0,34 нм / п.о.). Длины до 10% короче теоретического значения являются типичными и, вероятно, вызваны ограничениями разрешения АСМ.
    2. Определить положения пиков белка на ДНК-субстратах.
      1. Измерьте расстояние пиков белка от более близкого конца фрагмента ДНК, как описано в 3.2.1.1, и разделите на полную длину ДНК, чтобы получить расстояния в единицах доли длины ДНК.
      2. Bin и постройте график измеренных расстояний в гистограмме, используя подходящий анализ данных и графическое программное обеспечение (см., Например , рис. 3 ). Как правило, выберите размер бункера, который дает приблизительно √n бункеров для n точек данных.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Так как концы ДНК не могут быть выделены здесь, график только фракции длины ДНК 0.5 (центр фрагмента ДНКМент). Поскольку связывание конца ДНК не является фокусом исследования, исключить концы ДНК из анализов, начав бин данные позиции немного после позиции 0 ( например , здесь: бинирование из доли ДНК длиной 0,02).
    3. Определить целевую специфичность сайта по распределению белковых комплексных позиций.
      1. Установите максимальное (усиленные вхождения связывания) в распределение по положению с кривой Гаусса, как в 3.2.1.3, но ногами на высоте привязки фона (см . Рис. 3 ).
      2. Вычислите специфичность S для конкретного участка по сравнению с неспецифическим фоновым ДНК (молекулы белка, связанные с неспецифическими сайтами ДНК), со следующей формулой 21
        Уравнение
        A sp : количество конкретных комплексов (площадь под гауссовой кривой)
        A nsp : количество неспецифических комплексов (площадь фона, 0 ); Доля покрытой здесь длины ДНК составляет 0,48 для гистограммы, начинающейся с 0,02 длины ДНК)
        N: количество возможных участков связывания ДНК (здесь: N = 914, исключая концы ДНК)
  3. Углы изгиба ДНК
    1. Используя угловой инструмент в подходящем программном обеспечении для анализа изображений, измерьте угол β между двумя линиями, расположенными в центре вдоль основной цепи ДНК и центрирующими на пике белка (см., Например , вставка на рисунке 4 ). Измерьте углы для статистически значимого числа комплексов белок-ДНК (> 50, в идеале> 100) 2 , 3 , 5 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Угол изгиба ДНК определяется как 180 ° -β 2 , 3 , 5 .
    2. Использование программного обеспечения для анализа и графического анализа данных(См. Таблицу материалов) создают гистограмму распределения угла изгиба, разбивая углы изгиба ДНК.
    3. Подгоните распределение угла изгиба кривой Гаусса. Если в распределении присутствует более одного максимума, выберите несколько пиков Гаусса. Центр (ы) гауссовой кривой (ы) дают (ют) среднее угловое состояние изгиба конкретного вида.
    4. Если сдвиг угла изгиба (s) (максимумы гауссовой посадки) проявляется для распределений, например, различных вариантов белка или разных видов сложных белков, применяют t-критерий ученика для оценки уровня значимости изменения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Выделение различных комплексных типов на основе комплексных объемов белка

Геликазная активность прокариотной геликазной НЕРВ UvrB стимулируется связыванием ДНК 22 , 23 . UvrB требует неспаренной области в ДНК (пузырек ДНК), чтобы правильно загрузить одну из двух одиночных нитей оцДНК. In vivo эта структура ДНК обеспечивается взаимодействием ДНК через другой белок каскада NER; В экспериментах in vitro пузырь можно искусственно вводить в фрагменты dsDNA в непосредственной близости к целевому поражению. Протеин-белковые взаимодействия также усиливают связывание ДНК с UvrB 9 . Однако, как только UvrB загружается на ДНК, его активность, по-видимому, не зависит от кофакторов белка 9 . В противоположность этому, эукариотическая XPERAS NER требует взаимодействияС протеином р44, который, как и XPD, является частью комплекса субъединиц транскрипционного фактора IIH (TFIIH) in vivo , для активации его геликазной активности, но это взаимодействие не влияет на связывание XPD с ДНК 17 . Ожидается, что только XPD будет загружать ДНК в пузырек ДНК, но не транслоцироваться на поражение (в отсутствие кофактора, активирующего геликаз). Таким образом, XPD без p44 не может взаимодействовать и идентифицировать поражение при загрузке на расстоянии от места повреждения. Инкубации XPD с p44 в присутствии повреждения, содержащего ДНК-субстрат, приводят к соединению комплексов ДНК XPD- или XPD / p44 (и, возможно, минорных видов p44, связанных с ДНК). Для раздельного анализа распознавания повреждений XPD / p44 и XPD эти различные сложные типы можно различать на основе их объемов в AFM-изображениях ( рисунок 2 ) 9 , как описано в Протоколе 3.1 выше. АСМ-системы могут быть откалиброваны с использованием рРотеинов с известной молекулярной массой, чтобы выявить линейную зависимость между объемом АФМ и приблизительной молекулярной массой белка (комплекса) 20 , что позволяет интерпретировать измеренные объемы. Таким образом, положения связывания ДНК могут быть отдельно определены для неактивной мономерной XPD геликазы (~ 95 кДа, в соответствии с типом 100 нм 3 класса 2 на фиг.2 ) и для геликазных активных комплексов XPD / p44 (~ 135 кДа, ~ 150 нм 3 вида 3 класса), основываясь на их различных объемах AFM.

Определение распознавания повреждения от положения связывания белка с ДНК

Здесь использовались длинные (916 пар оснований) ДНК-субстраты, содержащие поражение при ~ 30% длины ДНК. Контроль за точным положением поражения в субстрате ДНК позволяет провести различие между специфическим (связанным поражением, ~ 30% длины ДНК) и nonspe(Поиск поражений) комплексов в зависимости от их положения на ДНК. Были выбраны два разных очага поражения, которые являются мишенями НЭР; ДНК-субстраты содержали либо аддукт флуоресцеина (F), либо димер циклобутанового пиримидина (CPD). В дополнение к месту повреждения ДНК содержала непарную область (пузырь ДНК 8 нт), которая служила местом загрузки геликаз. Этот загрузочный участок был расположен на расстоянии 26 нт (для содержащего ДНК субстрата) или 23 нт (для содержащего CPD субстрата) или 5 'или 3' от повреждения (см. Таблицу 1 ). Распознавание повреждений приводит к остановке транслокации ДНК гебриказ UvrB и XPD на участке-мишени, что проявляется в распределении положения белка AFM на ДНК как пике в положении поражения. Положения повреждений и пузырьков в этих субстратах не могут быть различимы per se в пределах разрешающей способности AFM-изображения (<10 нм). Однако доля конкретных комплексов, которая представляет собой aМонтирование молекул, остановленных на поражении, и указывает на распознавание поражения, сильно зависело от того, было ли поражение помещено 3 'или 5' из пузыря ( рис. 3 ) 9 .

Из доли комплексов на конкретном участке (площадь под пиком гауссовой аппроксимации по отношению к площади неспецифически связанного фона) была рассчитана специфичность S, UvrB и XPD для двух исследованных типов повреждений (см. Выше Протокол 3.2). Для UvrB загрузка 5 'из положения поражения приводила к более высокой специфичности (S B, F 5 ~ 200 и S B, CPD 5 ~ 400), чем загрузка 3' от повреждения (S B, F 3 и S B, CPD 3 ~ 100) для Оба типа поражения. Для XPD комплексы, содержащие только XPD (класс 2 на фиг. 2 ) и комплексы, содержащие XPD, а также кофакторный белок, активирующий helicase p44 (класс 3 на фиг. 2 ), различались как descrIbed в предыдущем разделе. Пики белка класса 2 (только XPD, неактивная геликаза) не локализовались преимущественно на участках поражения независимо от того, были ли они нагружены 5 'или 3' и не зависят от типа поражения (данные не показаны). Напротив, распределения по положению для комплексов XPD / p44 (класс 3) показали усиленное связывание при F-повреждениях для нагружения 5 'от повреждения (S XPD / p44, F5 ~ 300 по сравнению с S XPD / p44, F3 ~ 100), но в CPD Поражений для нагрузки 3 'от поражения (S XPD / p44, CPD3 ~ 600 по сравнению с S XPD / p44, CPD5 ~ 100, Рисунок 3 ). Поскольку UvrB и XPD представляют собой 5'-к-3 'геликазы, эти данные дают информацию о том, застаиваются ли комплексы путем взаимодействия с поражением в цепи оцДНК, которую они транслоцируют (транслоцированная цепь, для загрузки 5' из очага поражения) Или в противоположной, неперемещенной нити (для загрузки 3 'от повреждения). Концепция схематично показана на

Исследование конформационных изменений при идентификации повреждений с помощью XPD

Измерение изгиба, введенного в ДНК на участке связанных комплексов из изображений АСМ (см. Протокол 3.3 выше), может выявить важную информацию о сложных конформационных изменениях. Углы изгиба ДНК были измерены для археального XPD 5 , который не требует взаимодействия кофактора белка для активности геликазы. В этих исследованиях флуоресцеиновое поражение было расположено в направленииВ контексте пузырька ДНК для увеличения нагрузки на белок при поражении, ~ 30% от длины фрагмента ДНК. На рисунке 4 показано, что гауссово соответствует распределениям угла изгиба ДНК, полученным для белковых комплексов в неспецифических (неповрежденных) положениях ДНК и ~ 30% длины ДНК, что соответствует XPD, связанному с положением поражения флуоресцеина (специфические комплексы). Данные показывают средний угол изгиба для неспецифических комплексов ~ 50 ° против ~ 65 ° для конкретных комплексов. Этот сдвиг угла изгиба ДНК зависел от присутствия ATP или ATPƔs, что указывает на то, что для конформационных перестроек 5 необходим связывание, но не гидролиз ATP (ре), а не гидролиз 5 .

Рисунок 1
Рисунок 1: Подготовка ДНК-субстратов. Промежуток ssDNA вводят в круговую плазмидную ДНК, вырезая плазмиду (здесь с нимазой N.BstNBI) в cloИ удаляли замкнутое вытяжение оцДНК посредством центрифужной фильтрации после дестабилизации тепла в присутствии избытка комплементарного олигонуклеотида. Специфический олигонуклеотид, содержащий выбранную особенность, может быть затем отожжен и лигирован в область зазора. Наконец, переваривание рестрикционными ферментами (здесь с SspI и BspQI) приводит к линейной ДНК-субстрату с целевым признаком в точно известном положении (здесь при 30% длины фрагмента ДНК). Контрольные анализы позволяют тестировать отдельные стадии (показанные внизу) посредством электрофореза в агарозном геле (черная стрелка указывает 3000 п.о.). Никирование может быть проверено измененной электрофоретической подвижностью зарубцевавшейся, релаксированной кольцевой ДНК (контроль над ником, дорожка 2) в сравнении с суперскрученной плазмидой (дорожка 1). Полное гашение ДНК, а также последующая инсерция специфического олиго могут быть проверены путем переваривания ферментом рестрикции, который разрезает область зазора (здесь: XhoI, inПолоски 2, 4 и 6), так что отсутствие разреза ДНК указывает на образование зазоров (дорожки 1,2 - прорезанная ДНК, дорожки 3,4 - заполненная ДНК) и повторное застопоривание разреза указывает на введение специфического олигонуклеотида (дорожки 5, 6) , Конечная линейная подложка, которая содержит специфический признак, может быть очищена от геля после электрофореза в агарозном геле и проверена на гомогенность и чистоту посредством AFM-изображения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Отличия различных сложных типов от их томов AFM. ( A ) AFM изображение комплексов XPD / p44-DNA (серая стрелка) и XPD-ДНК (черная стрелка). ( B ) Примеры трех различных типов связанных ДНК-комплексов, интерпретируемых как p44 или простая надстройка ДНК (класс 1),XPD (класс 2, черный кадр) и XPD / p44 (класс 3, серый кадр), основанные на их томах AFM (показаны справа). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Различные стратегии распознавания поражения прокариотных и эукариотических геликаз НЕР. Компетентная транслокация распознавания повреждения с помощью Helicases NER UvrB и XPD (в комплексе с его кофактором p44, активирующим геликаз) требует загрузки белков в непарную область ДНК (пузырь ДНК). Затем белки перемещаются в направлении 5'-к-3 'вдоль пряди оцДНК, на которую они загружены. Признание поражения ДНК (здесь: CPD) геликазами либо на транслоцированной нити (для загрузки при 5'-пузыре), либо на противоположной, неперемещенной нити (foR при 3'-пузыре) приводит к остановке транслокации ДНК. В распределении по положению это показано как пик (гауссова подгонка линий), что указывает на усиленное связывание в положении поражения (~ 30% длины ДНК для ДНК-субстратов, показанных здесь). Прокариотическая геликаза NER UvrB и ее эукариотическая двойная XPD демонстрируют различные стратегии распознавания поражения CPD, которые указывают разные предпочтения нитей ДНК. В частности, повреждения CPD распознаются в транслоцированной цепи UvrB, но преимущественно на противоположной, неперемещенной нити XPD. Рисунок изменен из ссылки 9 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4: Конформационные изменения в комплексах XPD-DNA при идентификации повреждений. Распределения углов изгиба ДНК, индуцированные XPD, указывают на конформационные изменения комплексов белок-ДНК при поражении флуоресцеина. Эти конформационные перегруппировки зависели от присутствия АТФ (B) или ATPƔS (C). ( A ) В отсутствие АТФ неспецифичные углы изгиба (серые) и изгибы на участке поражения (удельные углы изгиба, черный) подобны и подгоняются гауссовой кривой с центром в ~ 50 °. ( B , C ) При наличии ATP или ATPƔS удельное угловое распределение (черный) показывает значительный сдвиг (P = 2,5 × 10 -7 ) до среднего угла изгиба ~ 65 °. Этот изгиб ДНК на участке поражения не зависел от типа поражения (CPD или аддукта флуоресцеина) или наличия или отсутствия пузырька ДНК 5 . Рисунок воспроизведен по ссылке 5 . Вставка в (C) показывает, как определялись углы изгиба (180 ° -β).Ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55501/55501fig4large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

номер последовательность описание
1 GGTCGACTCTAGAGGATCAGATCT
GGTACCTCTAGACTCGAGGCATGC 		дно
2 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAGTCGFCC 		F / 5 'пузырь
3 / Phos / GCAFGCCTCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC 		F / 3 'пузырь
4 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAT-TCGACC 		CPD / 5'bubble
5 / Phos / GCATGCT-TCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC 		CPD / 3'bubble
6 / Phos / GCA TGCCTCGAGTCTAGACTCF
TTCCATCTGATCCTCTAGAGTCGACC 		F / Пузырь

Таблица 1: ДНК-олигонуклеотиды для приготовления ДНК-субстрата. Все олигонуклеотиды имеют длину 48 нуклеотидов, а верхние цепи (олигонуклеотиды 2-6) были получены фосфорилированным на 5'-конце для лигирования в ДНК с зазором (см. Протокол 1.1). F = фторзамещенный аддуктом тимина, TT = димер циклобутан пиримидин (тимин) (CPD), некомплементарные области (области формирования пузырьков ДНК). F, содержащие олигонуклеотиды, были получены из Integrated DNA Technologies (IDT), содержащие CPD олигонуклеотиды были любезно предоставлены лабораторией Томаса Карелла (Университет Людвига-Максимилиана в Мюнхене, Германия).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

AFM статистический анализ положения связывания белков на длинных фрагментах ДНК, которые содержат специфические сайты-мишени, может показать интересные подробности о конкретных стратегиях, используемых белком для распознавания этих сайтов 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Чтобы интерпретировать результирующие распределения позиций, положения мишеней в ДНК должны быть точно известны. Это достигается путем введения специфических сайтов в четко определенных позициях последовательностей в круговую плазмидную ДНК и вырезания фрагмента ДНК, включая этот специфический сайт, с использованием технологии рестрикционных ферментов. При анализе AFM изображений положения связывания белка могут быть включены только фрагменты ДНК с правильной длиной (согласующиеся с полной длиной вырезанного фрагмента), потому что только для них, положение целевого сайта известно. Это не стоитЧто описанная здесь методика получения приводит к линейным ДНК-субстратам с двумя неотличимыми концами фрагментов. Распределение положений можно, следовательно, измерять и наносить на график из длины 0х ДНК (белки, связанные с концами фрагментов ДНК) до 0,5 х длины ДНК (белки, связанные в центре фрагментов). Кроме того, для положений мишеней, которые не расположены точно в центре подложки, эти распределения всегда содержат небольшой фон белков, которые неспецифически связаны на одном расстоянии от другого конца ДНК. Однако для этих комплексов учитывается подгонка кривой Гаусса к распределению, расположенному на средней высоте фона (неспецифически связанные белки, рис. 3 ). Альтернативно, один из концов ДНК может быть помечен, например, небольшими пиками объема из вторичной структуры, формирующими осколки оцДНК 24 . Типичные пределы разрешения этих анализов положения находятся в диапазоне 100-кратного предпочтения целевого siTe над неспецифическим связыванием сайта. Кроме того, концы фрагментов ДНК не составляют неспецифические сайты dsDNA, а представляют собой разрывы dsDNA. Репарационные белки ДНК часто связываются с этими дестабилизированными осколками фрагментов, в дополнение к внутренне внедренным конкретным сайтам-мишеням. Связывание конца ДНК может быть выявлено с помощью анализа АСМ и может обеспечить важную информацию о функции белка. Если связывание конца ДНК не является фокусом, представляющим интерес, эти положения, однако, легко могут быть опущены из распределений позиций, начав графики в положении> 0 ( например , здесь 0.02 длины ДНК).

Одно из особых преимуществ и, фактически, определяющее, общее свойство методов с одной молекулой - это разрешение отдельных, различных состояний, присутствующих в образце, которые могут обладать значительно отличающимися свойствами и активностями. Даже в тех случаях, когда конкретные виды интересов могут быть только редкими в выборке, эти подходы позволяютОтдельный фокус на этом виде, вклад которого будет занижен в ансамблевом измерении. Например, для образцов белков визуализация АСМ позволяет прямое различие между различными типами белковых комплексов на основе комплексного объема, если размеры отдельных белков достаточно отличаются (типичные пределы разрешения составляют около 20 кДа) 1 , 4 , 6 , 7 , 9 , 12 . АСМ-системы могут быть откалиброваны для обеспечения перевода измеренных объемов в молекулярную массу белка (протокол 3.1.3.1) 4 , 8 , 19 , 20 . Альтернативно, стандарты белка с известными размерами использовались в качестве прямой ссылки на изображениях 1 , 6 . вСистема, сфокусированная здесь, положения связывания на ДНК могут, таким образом, быть определены отдельно для неактивных геликазных мономерных XPD и геликазных активных гетеродимерных комплексов XPD / p44. Предпочтительное связывание с участком поражения в четко определенном положении в ДНК указывает на распознавание поражения ДНК белковым комплексом. Поскольку места загрузки белка и повреждения были пространственно разделены, транслокация ДНК была необходимой предпосылкой для распознавания повреждения в используемых субстратах ДНК. Только гетеродимерные комплексы XPD / p44 способны к транслокации ДНК ( фиг.3 ), что согласуется с результатами анализа активности геликазы 9 . Таким образом, анализ объема АСМ может дать важную информацию о дифференциальной активности различных форм сложных белков.

Взаимодействие и распознавание повреждения активным геликазным комплексом XPD / p44 приводило к усиленному связыванию на сайте-мишени из-за остановки транслокации геликазы ( рис. 3 рис. 3 ) это открытие показывает, что фермент предпочтительно обнаруживает флуоресцеин преимущественно на транслоцированной цепи, но CPD предпочтительно на противоположной, неперемещенной нити. Наоборот, прокариотная геликаза NER UvrB, напротив, преимущественно распознает как флуоресцеиновые, так и CPD-повреждения при нагрузке 5 'от повреждения, т.е. на транслоцированной нити ( рис. 3 ). Эти отличительные различия в свойствах распознавания поражения можно понять из различных структурных свойств двух геликаз. UvrB взаимодействует с потенциальными мишенями iN ДНК через аминокислотные остатки на внутренней поверхности β-шпильки в ферменте, за которым транслоцированная прядь, вероятно, имеет резьбу 16 , 25 . С другой стороны, XPD содержит небольшую пору в непосредственной близости от железосерного (FeS) кластера 26 . Вероятно, транслоцированная ДНК-нить проходит через эту пору 26 . Более объемные повреждения, такие как флуоресцеин, могут замедлять транслокацию геликазы посредством взаимодействия с остатками внутри этой поры, в то время как более легкие более тяжелые повреждения ЦПД могут быть идентифицированы легче благодаря взаимодействию с кластером FeS. В прокариотической системе предполагается, что две молекулы UvrB участвуют в поиске целевого сайта в гетеротеррамером комплексе UvrA 2 -UvrB 2 , в котором каждый из двух мономеров UvrB способен исследовать другую цепь ДНК 27 . XPD в эукариотической NER, вероятно, существует как единый экземпляр вКомплекс распознавания поражения TFIIH. Следовательно, может потребоваться гибкость в подходах к взаимодействию поражения эукариотического фермента, чтобы можно было признать чрезвычайно большой целевой участок спектра системы восстановления НЭР.

Поскольку специфические (связанные с сайтом-участком) и неспецифические комплексы могут быть выделены в AFM-изображениях на основе их положения на ДНК, эти различные сложные типы можно проанализировать отдельно и сравнить. Одиночная молекула АСМ является одним из немногих подходов, которые обеспечивают доступ к структурным свойствам белковых комплексов, связанных неспецифически с ДНК из-за их частопреходящей или переменной природы. Здесь конформационные изменения при распознавании целевого сайта были визуализированы и охарактеризованы в археальных XPD, основанных на изгибе, введенном в ДНК ферментом. Данные AFM показали небольшой, но отчетливый, значительный сдвиг в углах изгиба ДНК для XPD, связанный в месте повреждения с XPD, связанным с неспецифической ДНК 5 . КонформационныйИзменения в ДНК-связанных белках при идентификации целевого сайта, вероятно, вызывают рекрутирование NER эндонуклеаз (XPG и XPF в эукариотических NER), которые осуществляют удаление короткого участка оцДНК, содержащей поражение. Интересно, что этот сдвиг и, следовательно, конформационная перегруппировка требовали связывания АТФ с ферментом (но не гидролизом). Подобный подход связывания АТФ при идентификации целевого сайта и последующем пополнении эндонуклеазы UvrC сообщался для UvrB в прокариотических NER 28 , 29 .

Таким образом, одномолекулярная визуализация АСМ выявила незначительные отличия в распознавании целевого сайта прокариотными и эукариотическими геликазами НЭР. Как только целевое поражение было идентифицировано ферментами, они имеют сходную стратегию рекрутирования эндонуклеаз NER посредством индуцированных ATP конформационных перестроек выборочно при поражении. Техника AFM в comБинация с тщательным дизайном ДНК-подложки для имитации основных свойств исследуемой системы может, следовательно, обеспечить понимание взаимодействий между сайтами-мишенями не только восстановления ДНК, но и ДНК-связывающих белковых систем в целом. Структурная информация как о специфических, так и о неспецифических комплексах с разрешением в диапазоне низких нанометров (на молекулярном уровне, ограниченном зондом AFM) может в значительной степени способствовать пониманию задействованных механизмов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

PUC19N, CPD-содержащие олигонуклеотиды и p44 были любезно предоставлены Сэмюэлем Уилсоном, Корбинианом Хейлом и Томасом Карелл, Гудрун Михельс и Кэролайн Кискер соответственно. Эта работа была поддержана грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 и TE-671/4 для ИТ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Force Probe (MFP) 3D Asylum Research N/A atomic force microscope (AFM)
Precision 390 DELL N/A computer
ThermoMixer and 1.5 mL block Eppendorf 5382000015 heat block for DNA preparation
Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 mL tubes Carl Roth GmbH Y264.1 & Y267.1 heat block for protein-DNA incubations
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad Laboratories GmbH 1704467 electrophoresis chamber with gel caster and power supply
Power Pac Basic Bio-Rad Laboratories GmbH 1645050 electrophoresis power supply
Centifuge 5415 D with rotor Eppendorf 2262120-3 table centrifuge
Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 Ultralum 900-1322-02 UV irradiation table
NanoDrop ND-1000 VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH N/A UV spectrophotometer
TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter Unity Lab Services N/A water deionization and filter unit
Name Company Catalog number Comments
Software
MFP software on Igor Pro Asylum Research N/A AFM software
ImageJ (open source Java image processing) NIH Image N/A Image analysis software
Excel (Microsoft Office) Microsoft Corporation N/A data analysis software
Origin9 / Origin2016 OriginLab Corporation N/A statistical data analysis and graphing software
Name Company Catalog number Comments
Material
OMCL-AC240TS Olympus OMCL-AC240TS AFM cantilevers
grade V-5 muscovite SPI Supplies 1805 mica sheets
Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell Millipore Ireland Ltd. UFC505096 centrifuge filters
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH 740 609.250 Agarose gel extraction kit
Rotilabo cellulose paper type 111A Carl Roth GmbH AP59.1 AFM deposition blotting paper
Anatop 25 (0.02 μm) Whatman GmbH 6809-2102 syringe filter
SSpI, BspQI New England Biolabs (NEB) R0132, R0712 restriction enzymes for DNA substrate preparation
XhoI, BglII R0146, R0144 restriction enzymes for DNA preparation controls
nicking restriction enzyme Nt.BstNBI New England Biolabs (NEB) R0607 nickase
T4 DNA ligase New England Biolabs (NEB) M0202S Ligase
Tris, HEPES Carl Roth GmbH 4855, 9105 buffer chemicals
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate Carl Roth GmbH 3957, HN03, HN02, P026 salt chemicals
NaAc Sigma-Aldrich Chemie GmbH 32318 salt chemicals
DTT, TCEP, EDTA 6908, HN95, 8040 chemicals/reagents
agarose, acetic acid, HCl Carl Roth GmbH 2267, 3738, K025 reagents
ATP Carl Roth GmbH K054 nucleotides
oligonucleotide #1 in Table 1 Biomers custom complementary DNA oligonucleotide
oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 Integrated DNA Technologies (IDT) custom fluorescein containing oligonucleotides
oligonucleotides #4  and #5 in Table 1 private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) CPD containing oligonucleotides
SafeSeal reaction tube 0.5 mL and 1.5 mL Sarstedt 72.704 and 72.706 incubation tubes
GeneRuler 1 kb Thermo Scientific SM0311 DNA ladder
6x concentrate gel loading dye purple New England Biolabs (NEB) 51406 DNA loading dye
Midori Green  Nippon Genetics Europe GmbH 999MG28055 DNA stain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
  2. Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
  3. Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
  4. Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
  5. Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
  6. Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
  7. Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
  8. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
  9. Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
  10. Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
  11. Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
  12. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
  13. Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
  14. Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  16. Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
  17. Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
  18. Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
  19. Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
  20. Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
  21. Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
  22. Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
  23. Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
  24. Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
  25. Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
  26. Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
  27. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
  28. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
  29. Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).

Tags

Генетика выпуск 123 атомно-силовая микроскопия (АСМ) взаимодействие белок-ДНК восстановление ДНК восстановление экспрессии нуклеотидов (NER) распознавание повреждений ДНК модификация ДНК подготовка образца АСМ объемный анализ АСМ анализ положения связывания ДНК.
Атомно-силовая микроскопия Исследования распознавания повреждения ДНК при восстановлении эксцизии нуклеотидов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I.… More

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I. Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair. J. Vis. Exp. (123), e55501, doi:10.3791/55501 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter