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Genetics

Microscopie de la force atomique Enquêtes sur la reconnaissance des lésions de l'ADN dans la réparation de l'excision des nucléotides

Published: May 24, 2017 doi: 10.3791/55501
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg
* These authors contributed equally

Introduction

La microscopie à force atomique (AFM) est une technique puissante pour l'analyse des interactions protéine-ADN 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Il ne nécessite que de faibles quantités de matériel d'échantillonnage pour visualiser directement des échantillons hétérogènes avec une résolution au niveau de la molécule unique. L'hétérogénéité peut résulter de différents états conformationnels ou oligomères d'une protéine. En particulier, dans le contexte des échantillons de protéines-ADN, les complexes de protéines peuvent présenter différentes stœchiométries et / ou conformations induites par la liaison de l'ADN en général ou se liant à un site cible spécifique dans l'ADN. Les échantillons hétérogènes peuvent également contenir deux (ou plus) différents types de protéines et différents complexes de protéinesLes formes ( par exemple , constituées d'un seul type de protéines par rapport aux complexes hétéromères) peuvent interagir différemment avec l'ADN. Les études décrites ici exploitent l'imagerie AFM dans l'air sur des échantillons statiques et secs de protéines de réparation d'ADN liées à des fragments d'ADN longs (~ 900 paires de bases, pb) qui contiennent une lésion, ce qui représente une cible de ces protéines. La haute résolution moléculaire de l'AFM permet la distinction entre différents types de complexes de protéines et de déterminer les positions de liaison des protéines sur les fragments d'ADN. Fait important, les lésions sont introduites dans les substrats d'ADN à des positions bien définies. Étant donné que la position du site de lésion dans l'ADN est connue, les distributions de protéines liées à l'ADN donnent un aperçu des propriétés (différentes) de reconnaissance de lésion des complexes protéiques (différents), par exemple , à quel point ils reconnaissent un type particulier de lésion (comparé À l'ADN non endommagé) 2 , 3 , , 5 , 6 . Leurs positions sur l'ADN permettent également la distinction entre les complexes de protéines liés spécifiquement aux lésions et aux complexes liés de manière non spécifique ailleurs sur l'ADN. La caractérisation séparée de ces différents types complexes (complexes liés spécifiquement à la lésion par rapport aux complexes non spécifiques) peut révéler des changements de conformation potentiels dans les complexes induits sur l'identification du site cible.

Les protéines de réparation d'ADN ciblées ici sont des hélicases qui sont responsables de la reconnaissance de lésion dans la voie de la réparation de l'excision nucléotidique (NER). Dans les bactéries, le NER est atteint par les protéines UvrA, UvrB et UvrC. UvrA est responsable de la détection initiale des lésions dans un complexe d'analyse d'ADN UvaA 2 / UvrB 2 . Lors de la vérification de la lésion par UvrB, ce complexe se convertit en UvrB monomérique lié au site de la lésion et ce complexe spécifique peut alors recruter le pEndonucléase NER rokaryote UvrC. UvrC excise un tronçon court (12-13 nt) d'ADN monocaténaire (ssDNA) contenant la lésion. L'étirement manquant est ensuite rempli par l'ADN polymérase. Enfin, l'ADN ligase scelle l'étirement nouvellement synthétisé avec l'ADN original 9 , 10 . Dans les eucaryotes, la plupart des protéines de la cascade de NER font partie du grand complexe de facteur de transcription multimérique II H (TFIIH). Après la détection initiale des lésions via le complexe trimerique CEN2-XPC-HR23B, TFIIH est recruté sur le site cible de l'ADN. Lorsque XPD dans le complexe vérifie la présence d'une lésion cible NER, les endocontases NER Eucaryotes XPG et XPF sont recrutés pour acciser un tronçon court (24-32 nt) d'ADN ssD contenant la lésion 9 , 10 . Ici, plus précisément, les hélicases UvrB et XPD provenant du NER procaryote et eucaryote, respectivement, ont été étudiés. Ces hélicases nécessitent une région non appauvrieL'ADN (une bulle d'ADN) pour filer sur l'un des deux filaments simples d'ADN et ensuite translater le long de ce brin alimenté par l'hydrolyse ATP. En plus des lésions d'ADN, une bulle d'ADN a donc été introduite dans les substrats qui fonctionnent comme site de chargement pour les protéines.

La procédure de préparation de substrats spécifiques d'ADN de lésion a été décrite précédemment 11 . Il nécessite une construction d'ADN circulaire (plasmide) avec deux sites de restriction étroitement espacés pour une nickase. Dans le cadre de cette étude, le plasmide pUC19N (2729 pb) a été utilisé (créé par le laboratoire de S. Wilson, NIEHS). Ce plasmide contient trois sites de restriction étroitement espacés pour la nickase Nt.BstNBI qui encadrent un étirement de 48 nucleotides (nt). Après incubation avec la nickase, le tronçon de ssDNA entre ces sites peut être éliminé et remplacé par un oligonucléotide contenant toute caractéristique cible. Après chaque étape, la digestion enzymatique complète est testée via un gel d'agaroseÉlectrophorèse. On peut distinguer l'ADN circulaire nickel en raison de sa mobilité électrophorétique inférieure par rapport au plasmide super-enroulé d'origine. Le dégagement de l'ADN et le remplacement de l'étirement enlevé par l'oligonucléotide spécifique du substrat peuvent être évalués par digestion avec une enzyme de restriction qui incarne le substrat exclusivement dans la région entre les nicks. La linéarisation du plasmide circulaire par l'enzyme sera donc supprimée pour l'ADN gapped et restaurée après insertion de l'oligonucléotide spécifique. Enfin, deux sites de restriction d'endonucléase (idéalement des coupeurs individuels) permettent la génération d'un substrat d'ADN linéaire, avec la longueur souhaitée et avec le site cible spécifique à une position définie ainsi qu'une bulle d'ADN à distance de la lésion soit en 5 'Ou 3' direction.

La reconnaissance des lésions par les hélicases NER peut être étudiée par imagerie AFM. Transfert d'ADN bloqué des hélicases à tLe site de lésion est visible comme un pic dans la distribution de la position de la protéine sur l'ADN et indique la reconnaissance de la lésion. Parce que la translocation de l'ADN de ces hélicases est en outre directionnelle, avec une polarité de 5 'à 3', la dépendance de la reconnaissance de la lésion sur la position du site de chargement (bulle d'ADN en amont ou en aval de la lésion) indique également si la lésion est préférentiellement reconnue Sur le brin translaté ou inversé, non translaté, ssDNA 5 , 9 . Dans les sections suivantes, les méthodes utilisées seront introduites et les résultats majeurs de ces expériences seront discutés brièvement. Il est important de noter que l'imagerie AFM peut être appliquée à l'étude de différents systèmes d'interaction de l'ADN, tels que la réplication ou la transcription de l'ADN 8 , 12 , 13 , 14 , analogue au travail exemplaire sur la réparation de l'ADN .

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Protocol

1. Préparation de l'échantillon

  1. Préparation de substrats d'ADN 11
    1. Générer un espace de ssDNA dans le plasmide
      1. Compléter complètement un échantillon du plasmide (ici: pUC19 modifié, pUC19N) dans un tube de réaction avec une nickase appropriée (ici: Nt.BstNBI) suivie d'une inactivation de la chaleur enzymatique, en utilisant des conditions selon le protocole du fabricant (voir la figure 1 pour un schéma présentation). Commencer par un plasmide de ~ 50 μL et ~ 500 nM pour un rendement suffisant.
      2. Vérifier la coupure du plasmide par électrophorèse sur gel d'agarose sur des échantillons dilués (~ 20 nM) 15 . Portez des gants pour la protection contre le colorant de liaison à l'ADN utilisé pour la visualisation de l'ADN.
        NOTE: Différentes mobilités électrophorétiques permettent de distinguer l'ADN plasmidique circulaire superposé (détendu) et super-enroulé ( figure 1 ).
      3. Supprimez l'étirement en ssDNA incisé (entre les sites nick) du plasmide parIncubation avec un excès de 10 fois de l'oligonucléotide complémentaire (oligonucléotide 1 dans le tableau 1 ), agitant à 300 tr / min pendant 30 minutes à proximité de la température de fusion de l'oligonucléotide (ici: 68 ° C pour pUC19N) dans un bloc de chaleur ( figure 1 ).
      4. Séparer le plasmide détourné des fragments d'ADN plus petits en utilisant un filtre à coupure de poids moléculaire de 50 kDa (MWCO) par centrifugation pendant 10 min à 10 000 xg dans une centrifugeuse à table ( Figure 1 ). Pour extraire l'ADN concentré du filtre, inverser le filtre et l'insérer dans un nouveau tube de réaction de 1,5 ml. Centrifuger pendant 3 min à 1000 x g.
      5. Remplir l'échantillon d'ADN concentré résultant à 500 μl avec de l'eau filtrée et désionisée, ajouter un excès supplémentaire de 5 fois d'oligonucléotide complémentaire et répéter les étapes 1.1.1.3 et 1.1.1.4 au moins 3 fois.
      6. Test pour un calage complet de l'ADN par incubation avec une enzyme de restriction appropriée (ici: XhoI ou BglII) à l'aide de conditiSelon la description du fabricant. Utiliser des échantillons d'ADN dilués (nickelés versus gapped) (~ 20 nM). Exécuter une électrophorèse sur gel d'agarose pour distinguer entre le plasmide linéarisé (ne contenant pas d'intervalle de ssDNA) et l'ADN non incisé (ADN gâché) en utilisant l'ADN coupé comme contrôle positif (inclure une échelle d'ADN pour référence, figure 1 ). Porter des gants.
    2. Recharger l'espace avec les oligonucléotides ssDNA modifiés
      1. Recuit le plasmide gapped par incubation avec un excès de 25 fois supérieur à un oligonucléotide phosphorylé 5 'qui contient le ou les sites cibles spécifiques de choix, incubant à ~ 45 ° C pendant 4 h ( Figure 1 ). Ici, utilisez un ssDNA de 48 nt contenant une lésion, soit une thymine adoucie à la fluorescéine, soit un dimère de cyclobutane pyrimidine (CPD), et en plus une séquence courte (8 nt) non complémentaire pour produire des bulles d'ADN (voir tableau 1 ).
      2. Lier de façon covalente l'insert recuit au plasmide par incubaAvec T4 ADN ligase pendant une nuit à température ambiante selon le protocole du fabricant ( Figure 1 ). Pour cette réaction, ajouter une solution stock de tampon concentrée contenant de l'ATP pour produire des conditions de tampon appropriées pour la ligase ( par exemple , utiliser un tampon de réaction UvrB: Tris-HCl 50 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, KCl 50 mM, DTT 5 mM, 1 mM ATP).
      3. Test pour l'insertion de l'oligonucléotide spécifique dans le plasmide gapped par digestion d'échantillons dilués avec une enzyme de restriction appropriée (identique à 1.1.1.6) selon le protocole du fabricant suivi d'une électrophorèse sur gel d'agarose (comme dans 1.1.1.6, figure 1 ).
    3. Préparation du substrat d'ADN linéaire
      1. Recréer l'ADN plasmidique modifié avec des enzymes de restriction (idéalement avec un seul site de restriction dans le plasmide) en utilisant les conditions recommandées par le fabricant ( figure 1 ). Cette étape produit des fragments linéaires contiennentLa modification insérée à une position définie. Ici, utilisez SspI et BspQI coupant aux positions 613 et 255 pb en amont et en aval de l'insert, respectivement, ce qui donne un fragment d'ADN de 916 pb contenant le site de lésion spécifique à ~ 30% de la longueur d'ADN.
        NOTE: Pour les expériences d'imagerie AFM telles que décrites ici, des fragments d'ADN avec des longueurs comprises entre ~ 200 pb et ~ 2 000 pb sont des substrats appropriés.
      2. Isoler le fragment cible par électrophorèse sur gel d'agarose et extraire le gel en utilisant un kit commercial. Portez des gants pour la protection.
      3. En option, couper le gel d'agarose avec un scalpel pour séparer l'échelle d'ADN et les voies d'échantillon diluées (les deux premières voies) des voies contenant l'ADN concentré à purifier. N'exposez que la partie gel avec les deux premières voies à l'irradiation UV en plaçant uniquement cette partie du gel sur une table UV.
        1. Découpez le groupe correspondant au fragment de choix avec un scalpel. Re-unir les deux parties de gel (hors onglet UVLe). Utilisez la position de la bande excisée à partir de l'échantillon dilué comme orientation pour la position de la bande du substrat d'ADN désiré. Compte tenu de la concentration plus élevée en coupant des tranches légèrement plus larges que pour le contrôle dilué.
          NOTE: Parce que, ici, la reconnaissance des lésions UV a été étudiée, l'introduction de lésions UV supplémentaires par irradiation UV a été soigneusement évitée dans le substrat d'ADN par cette approche.
      4. Calculer la concentration d'ADN c à partir de l'absorption à 260 nm mesurée par un spectrophotomètre UV-Vis en utilisant la loi de Lambert-Beer avec un coefficient d'extinction molaire moyen d'ADN double brin (dsDNA) de ε 260nm ~ 6,700 M - 1 cm - 1 par pb:
        Équation
        Où L est la longueur du trajet (longueur de la chambre de mesure, généralement 1 cm).
    </ Li>
  2. Expression et purification des protéines
    1. Exprimez de manière recombinante UvrB dans E. coli et purifiez la protéine par l' affinité standard 15 du cordon de chitine et la Chromatographie d'exclusion de taille 15 comme décrit précédemment 16 .
      NOTE: Le gène uvrB de Bacillus caldotenax a été clone dans le vecteur pTYB1.
    2. Exprimez XPD dans E. coli et purifiez la protéine par l'affinité IDA 15 de nickel standard et la Chromatographie d'exclusion de taille 15 suivie d'une Chromatographie 15 d'échange d'anions, comme décrit précédemment 17 .
      NOTE: Le gène de la protéine du groupe D de Chaetomium thermophilum Xeroderma pigmentosum (XPD) a été clone dans le vecteur pBADM11. C. thermophilum p44 était un cadeau génial du laboratoire de Caroline Kisker, exprimé et puriComme décrit 17 .

2. Expérience AFM

  1. La préparation des échantillons
    1. En option, pré-incuber le substrat d'ADN à 65 ° C pendant 10 minutes dans un bloc de chaleur pour éliminer les cristaux de micro-sel potentiels qui se sont formés lors du stockage dans le réfrigérateur.
    2. Préparer le (s) tampon (s) de réaction à une concentration de 10 fois (tampons 10x).
      NOTE: Le tampon de réaction XPD à 1x concentration contenait 20 mM de Tris-HCl pH 7,5, 10 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM de TCEP, 2 mM d'ATP; Le tampon de réaction 1x UvrB contenait Tris-HCl 50 mM pH 7,5, KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, TNT 5 mM et ATP 1 mM.
    3. Pré-incuber les protéines à une concentration plus élevée dans des conditions d'incubation appropriées pour améliorer la formation de complexes. Pré-diluer un petit volume ( par exemple , 1 μL) des protéines individuelles dans un tampon de réaction de 1x protéines à la concentration souhaitée et mélanger de petits volumes ( par exemple 1 μL) de tLes solutions de protéines individuelles dans un tube de réaction de 0,5 ml.
      1. Placez le tube dans un bloc de chaleur pour des températures d'incubation supérieures à la température ambiante. Choisissez un taux de concentration en fonction de la stoechiométrie complexe attendue, soit des concentrations équimolaires, soit correspondantes. Ici, incuber 1 μL de XPD (20 μM dans 1 x XPD tampon de réaction) et 1 μl de p44 (20 μM dans 1x 1xD réaction tampon) à 10 μM chacun pendant 10 minutes à 37 ° C.
    4. Incuber des échantillons à des concentrations appropriées de protéines et d'ADN dans un tampon de réaction protéique dans un tube de réaction de 0,5 ml. Ici, utilisez 500 nM UvrB ou 1 μM XPD + 1 μM p44 et 100 nM d'ADN. Pipettez de petits volumes pour économiser du matériel, p. Ex . 0,25 à 0,5 μl de protéine (pré diluée à une concentration d'incubation de 10 fois) et de l'ADN dans un volume total de 2,5-5 μL de tampon de réaction de 1x protéines. Ici, incuber pendant 30 min à 37 ° C dans un bloc de chaleur. Faire tourner brièvement dans un tube de réaction (~ 1 s) dans une centrifugeuse à tableE pour assurer le mélange de petits volumes.
  2. Dépôt d'échantillon
    1. Préparer un substrat de mica: couper un morceau d'environ 1 x 1 cm 2 de mica de bandes plus grandes à l'aide d'un scalpel. Déposer les couches supérieures de la matière minérale multi-couches de minéraux à l'aide d'un ruban adhésif pour révéler une surface de substrat propre, plat et atomiquement lisse.
      REMARQUE: La pièce de mica peut être réutilisée pour de multiples expériences en éliminant les autres couches.
    2. Préparer le tampon de dépôt AFM avec de l'eau filtrée désionisée, par exemple , 25 mM HEPES pH 7,5, 25 mM Na-acétate, 10 mM Mg-acétate. Filtrer par un filtre à seringue de 0,02 μm.
      NOTE: Les cations divalents dans le tampon de dépôt servent à chélater les molécules d'ADN chargées négativement sur la surface du mica, qui est également chargée négativement au pH neutre. Si la concentration d'ions Mg 2+ relativement élevée dans le tampon de dépôt pose un problème pour un système protéinique-ADN particulier, en variante,La surface du mica peut être préchargée avec des groupes amino en utilisant une chimie à base de silatrane pour fournir des charges de surface positives pour l'ancrage 18 . Le dépôt d'échantillon peut ensuite être effectué dans un tampon qui ne contient pas seulement des quantités faibles de cations divalents.
    3. Diluer l'échantillon (voir 2.1) pour le dépôt immédiat sur du mica dans un tampon de dépôt. Déposer un petit volume (ici: 20 μL).
      NOTE: Les facteurs de dilution dépendent de la concentration de l'échantillon. Ici, diluer les échantillons 50-100x. En règle générale, ~ 1 nM d'ADN entraîne une bonne couverture de surface pour ~ 1000 pb.
    4. Rincer immédiatement l'échantillon trois à quatre fois avec quelques millilitres d'eau filtrée et désionisée, nettoyer l'excès de liquide et sécher dans un courant doux d'azote. L'ensemble du processus, du dépôt d'échantillons à des échantillons séchés, peut être effectué en moins de 30 s.
    5. Fixez le morceau de mica sur un toboggan à microscope à l'aide d'un ruban adhésif sur ses bords.
      NOTE: Différents systèmes AFM ont dDes exigences minimales pour la fixation de l'échantillon sur la scène. D'autres AFM possèdent des étages magnétiques, et les morceaux de mica sont fixés sur des disques magnétiques, par exemple en utilisant de la colle thermique. Les détails du système AFM utilisé ici peuvent être trouvés dans la Table des matériaux.
  3. Imagerie AFM
    1. Placez l'échantillon (voir 2.2.5) centralement sur l'étage AFM et fixez le toboggan du microscope sur scène avec des plaquettes magnétiques.
    2. Insérez la pointe AFM dans le support de la pointe. Utiliser des cantilevers avec une sonde AFM (<10 nm) apte à une imagerie en mode intermittent oscillant et intermittent dans l'air. Utilisez les sondes AFM, par exemple, comme indiqué dans la table des matières . Ici (dépend de AFM), fixez la pointe dans le support sous une pince en serrant la vis de serrage (étanche aux doigts). Insérez le porte-pointe dans la tête de mesure AFM. Reposez la tête sur le dos pour cette étape.
    3. Placez la tête de mesure AFM en haut de l'échantillon. Les détails dépendent du modèle AFM. Ici, mAssurez-vous que la tête est stable avec ses jambes dans les indentations de la scène. Assurez-vous que le mica est situé sur la scène où la pointe de l'AFM se déplacera directement au-dessus. Les vis micrométriques à droite du plateau permettent un positionnement précis de l'échantillon.
    4. Alignez le laser AFM à l'arrière du porte-à-faux pour obtenir une puissance optimale du signal à partir du photodétecteur sensible à la position sur lequel le laser est réfléchi. Les détails dépendent du modèle AFM.
      1. Ici, tournez les roues sur le côté droit et en arrière de la tête de mesure AFM pour régler les positions x et y du laser AFM pour le diriger centralement sur la fin du porte-à-faux. Regardez le signal de réflexion dans la fenêtre vidéo AFM (si disponible, cliquez ici: appuyez sur l'icône de la caméra et choisissez Entrée: Svideo).
      2. Une fois positionné de manière grossière, optimisez le signal de somme du détecteur (Somme dans la fenêtre Somme et Déflecteur dans le logiciel AFM) en réglant finement la position du laser avec les deux roues (rester à la fin du porte-à-faux, le signe de sommeJe dépend du type AFM et en porte-à-faux, ici: viser la somme> 5).
    5. Cochez le signal de différence des diodes supérieure et inférieure du tableau des détecteurs (ici: Signal de déviation dans la fenêtre Somm et Deflection Meter) en dirigeant la réflexion laser AFM sur le centre du détecteur (ici: tournez la roue sur le côté gauche de la mesure AFM tête).
      REMARQUE: les écarts par rapport à zéro indiquent la déviation du porte-à-faux en raison des interactions de surface, qui sont traduites en informations de hauteur par l'AFM.
    6. Déterminer la fréquence de résonance en porte-à-faux par un accord de fréquence implanté dans le logiciel AFM (ici: commande syntoniser automatiquement la fenêtre du menu principal / syntoniseur). Choisissez une amplitude correspondant à une entrée de 1 V pour le piézo qui entraîne l'oscillation en porte-à-faux. Réglez la fréquence d'oscillation à légèrement (5%) inférieure à la fréquence de résonance et à zéro la phase de l'oscillation.
    7. Approchez la pointe de la surface de l'échantillon à l'aide du mod d'engagement brutE (ici: commande Engage dans la fenêtre du panneau maître) jusqu'à ce que le paramètre de protection (point de consigne) soit atteint. Utilisez ~ 2% de réduction de l'amplitude d'oscillation de niveau libre comme point de consigne (ici, entre Set Point 980 mV dans le panneau principal).
    8. Engagez bien le pointeur AFM avec la surface de l'échantillon en abaissant le point de consigne à l'aide du logiciel AFM. Viser l'imagerie en mode répulsif avec la phase d'oscillation en porte-à-faux (Phase dans la fenêtre de somme et de déflexion) juste en dessous de la phase de niveau libre (avant d'engager, ici généralement ~ 70). Ici, utilisez des points de consigne finaux typiques de l'ordre de 70 à 80% de l'amplitude du niveau libre (1 V).
    9. Avant de numériser, choisissez les signaux pour l'enregistrement dans le panneau de canal principal. Choisir la hauteur (Ht) et l'amplitude (Am).
    10. Commencez la numérisation d'échantillons (ici: la commande Do Scan in Master Panel). Utilisez une vitesse de balayage de, par exemple, 2,5 μm / s (commande Vitesse de numérisation dans le panneau principal) à des zones de surface d'image de 4 μm x 4 μm ou 8 μm x 8 μm (entrez la taille de numérisation dans le panneau maîtreL) avec des résolutions de pixels de 2 048 ou 4,096 (points de balayage et lignes de numérisation dans le panneau principal), respectivement.
    11. Enregistrez le fichier d'image (commande Enregistrer l'image dans le panneau principal) sans modifications appropriées (choisissez Aucun dans le panneau de canal principal / Ajustement de l'avion d'expiration).
    12. Pour une analyse plus approfondie, traiter l'image enregistrée. Chargez l'image (commande Parcourir les données enregistrées dans le menu Analyse AFM). Ouvrez le panneau de modification (appuyez sur M dans la partie supérieure de l'image). Appliquer un plantage en dimensions x et y à l'image haute (extension HtR) (commande XY dans la fenêtre Planefit dans Modify Panel, choisissez Planefit Order 3). Ensuite, aplatir l'image (commande Flatten in Flatten window dans Modify Panel) en choisissant Flatten Order 3.
    13. Exportez l'image sous la forme d'un fichier TIFF (appuyez sur Commandes dans la partie supérieure de l'image, choisissez TIFF Export 2x correspondant à une résolution de 2 048 pixels) pour une analyse plus approfondie.

3. Analyse AFM

  1. Volume complexe de protéines
    1. Pré-Sélectionnez des complexes protéiques-ADN appropriés par une inspection visuelle directe des images dans le logiciel AFM, en utilisant un schéma de couleur approprié pour maximiser les différentes apparences de différents complexes de taille (voir différentes couleurs et tailles de différents complexes dans la Figure 2 : ici: schéma de couleurs SeaLandAndFire en Le logiciel AFM). Pour les échantillons XPD, les complexes possibles incluent le ADN de XPD / p44 ainsi que l'ADN de XPD et l'ADN de p44, avec des tailles nettement différentes en raison des masses moléculaires relativement grandes et différentes de XPD (~ 95 kDa) et p44 (~ 40 kDa) .
    2. Mesurer les volumes de pics de protéines individuels sur l'ADN pour vérifier le type complexe. Cela peut être réalisé avec différents logiciels d'image (ici: l'outil de section du logiciel AFM).
      1. Mesurez la hauteur (h) et le diamètre (d) des sections des pics de protéines avec les curseurs de la fenêtre de section. Mesurez le diamètre près de la base de la section des particules.
      2. Déterminer le volume (V) du poisKs en utilisant des modèles mathématiques simples, par exemple , en utilisant la formule suivante, qui est basée sur un modèle de capuchon sphérique:
        Équation
    3. Traduire les volumes mesurés en une masse moléculaire approximative des protéines.
      1. Initialement, calibrez le système AFM pour la conversion du volume en masse moléculaire (MW) en utilisant une gamme de protéines avec un poids moléculaire connu (ici: un total de 12 expériences avec entre 25 et 851 points de données ont été réalisés sur 5 protéines différentes en monomère, dimère , Trimères ou tétramères) 4 , 19 , 20 . Déposer et protéines d'image (comme décrit ci-dessus, en 2.2 et 2.3) et mesurer leurs volumes comme décrit ci-dessus (3.1.2). Tracez les volumes sur leurs poids moléculaires connus. Le graphique résultant montrera une relation linéaire entre V et MW, dont l'équation peut être obtenue parUne ligne adaptée aux données. Pour le système AFM utilisé ici, la relation suivante a été obtenue 19 :
        Équation
        REMARQUE: cette étape ne doit pas être répétée avant chaque mesure, mais ne se fait qu'une seule fois. Le calibrage du volume au MW peut être appliqué aux images obtenues dans des conditions d'imagerie similaires en utilisant des sondes AFM avec des diamètres légèrement variables.
      2. Sur la base de leurs volumes mesurés (3.1.2) et de l'étalonnage V-à-MW (3.1.3.1), déterminer le MW approximatif des complexes protéiques 20 , qui fournit des informations sur sa teneur moléculaire. Par exemple , pour les échantillons XPD / p44, ~ 50 kDa, ~ 100 kDa et ~ 140 kDa ont été obtenus, en cohérence avec les complexes p44-ADN (ou les pics causés par la simple superstructure de l'ADN), les pics XPD seulement et les pics XPD / p44, respectivement .
  2. Positions complexes des protéines sur l'ADN
    1. Déterminer l'ADNLongueur des fragments.
      1. Tracez les fragments d'ADN dans les images AFM, par exemple , avec la fonction de ligne libre d'un logiciel d'analyse d'image approprié (voir par exemple Table of Materials) et mesurez la longueur de la ligne.
        REMARQUE: exclure les agrégats d'ADN ainsi que les fragments coupés par les marges de l'image.
      2. Stocker et tracer les longueurs d'ADN de toute l'expérience dans un histogramme, en utilisant des analyses de données et des logiciels graphiques appropriés ( p. Ex. , Voir le tableau des matériaux ).
      3. Ajustez les distributions de longueur avec une courbe gaussienne dans le logiciel d'analyse de données et de graphisme pour déterminer la longueur des fragments d'ADN. Pour connaître la position du site cible d'ADN inséré (voir 1.1), n'incluez que des fragments d'ADN avec la longueur correcte dans deux écarts types du centre de la courbe de Gauss (y = y 0 + z exp (-2 (xx c ) 2 / w 2 ), où z est un facteur de norme et x c et w sont le centre etLargeur maximale totale du gaussien) dans d'autres analyses.
        NOTE: La longueur d'ADN au centre de la courbe de Gauss doit être proche de la longueur théorique du fragment d'ADN (calculé en utilisant 0,34 nm / pb). Des longueurs allant jusqu'à 10% plus courtes que la valeur théorique sont typiques et sont probablement causées par les limites de résolution AFM.
    2. Déterminer les positions des pics de protéines sur les substrats d'ADN.
      1. Mesurez la distance des pics de protéines à partir du fragment d'ADN plus proche, comme décrit dans 3.2.1.1 et divisez par la longueur d'ADN totale pour obtenir des distances en unités de fraction de longueur d'ADN.
      2. Stocker et tracer les distances mesurées dans un histogramme à l'aide d'un logiciel d'analyse et de représentation de données approprié (voir par exemple , figure 3 ). En règle générale, choisissez une taille de bac qui donne environ än des bacs pour n points de données.
        NOTE: Étant donné que l'ADN ne peut être distingué ici, tracez seulement à la fraction de longueur d'ADN 0,5 (centre d'ADN fragMent). Étant donné que la liaison par l'extrémité de l'ADN n'est pas l'objet de l'étude, exclure les extrémités de l'ADN des analyses en commençant à régler les données de position légèrement après la position 0 ( par exemple , ici: binning à partir d'une fraction de longueur d'ADN de 0,02).
    3. Déterminer la spécificité du site cible à partir des distributions de position complexe de protéines.
      1. Ajuster le maximum (occurrences de liaison améliorées) dans la distribution de position avec une courbe de Gauss comme dans 3.2.1.3 mais sur la hauteur de la liaison de fond (voir la figure 3 ).
      2. Calculer la spécificité S pour le site spécifique par rapport au fond d'ADN non spécifique (molécules de protéines liées à des sites d'ADN non spécifiques) avec la formule suivante 21
        Équation
        A sp : Nombre de complexes spécifiques (zone sous la courbe gaussienne)
        A nsp : Nombre de complexes non spécifiques (zone de fond, 0 ); La fraction de longueur d'ADN recouverte ici est de 0,48 pour un histogramme à partir de 0,02 longueur d'ADN)
        N: nombre de sites possibles de liaison à l'ADN (ici: N = 914 excluant les extrémités de l'ADN)
  3. Angle de pliage de l'ADN
    1. En utilisant l'outil d'angle dans un logiciel d'analyse d'image approprié, mesurez l'angle β entre deux lignes placées centralement le long du squelette de l'ADN et le centrage au pic de la protéine (voir par exemple , encadré à la figure 4 ). Mesurez les angles pour un nombre statistiquement pertinent de complexes protéine-ADN (> 50, idéalement> 100) 2 , 3 , 5 .
      NOTE: L'angle de pliage de l'ADN est défini comme 180 °-β 2 , 3 , 5 .
    2. Utilisation de l'analyse des données et du logiciel graphique(Voir Tableau des matériaux) produisent un histogramme de répartition de l'angle de virage en regroupant les angles de courbure de l'ADN.
    3. Ajuster la distribution de l'angle de virage avec une courbe Gauss. Si plus d'un maximum est apparu dans la distribution, choisissez l'ajustement de Gauss à pointe multiple. Le (s) centre (s) de la (les) courbe (s) gaussienne (s) donnent (s) l'angle d'angle de virage moyen de l'espèce particulière.
    4. Si un changement dans l'angle (s) de pliage (maxima de Gaussian fit) est évident pour des distributions, par exemple, de différentes variantes de protéines ou de différentes espèces de protéines complexes, appliquez un test t d'étudiant pour évaluer le niveau de signification du changements.

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Representative Results

Distinction entre différents types complexes basés sur des volumes complexes de protéines

L'activité hélicase de l'hépatite NAR hépatite procaryote est stimulée par la liaison de l'ADN 22 , 23 . UvrB nécessite une région non appariée dans l'ADN (une bulle d'ADN) afin de charger correctement sur l'un des deux brins d'ADN unique. In vivo , cette structure d'ADN est fournie par des interactions ADN par une autre protéine de la cascade NER; Dans des expériences in vitro , la bulle peut être introduite artificiellement dans des fragments d'ADNc à proximité immédiate d'une lésion cible. Les interactions protéine-protéine augmentent également la liaison de l'ADN par UvrB 9 . Cependant, une fois que UvrB est chargé sur l'ADN, son activité ne semble pas dépendre des co-facteurs protéiques 9 . En revanche, l'hépatite NER eucaryote XPD nécessite une interactionAvec la protéine p44, qui, comme le XPD, fait partie du complexe de transcription de la sous-unité IIH (TFIIH) in vivo , pour l'activation de son activité d'hélicase, mais cette interaction n'affecte pas la liaison de XPD à l'ADN 17 . Le XPD seul devrait charger sur l'ADN à une bulle d'ADN, mais ne pas translate vers la lésion (en l'absence de son cofacteur activateur d'hélicase). Le XPD sans p44 ne devrait donc pas interagir avec et identifier la lésion lorsqu'elle est chargée à distance du site de la lésion. Les incubations de XPD avec p44 en présence d'un substrat d'ADN contenant une lésion entraînent un mélange de complexes XPD ou XPD / p44-ADN (et éventuellement une espèce mineure de p44 seule liée à l'ADN). Pour analyser séparément la reconnaissance de la lésion par XPD / p44 et XPD, ces différents types complexes peuvent être distingués en fonction de leurs volumes dans les images AFM ( Figure 2 ) 9 , comme décrit dans le Protocole 3.1 ci-dessus. Les systèmes AFM peuvent être calibrés en utilisant une gamme de pRotéines à masse moléculaire connue, pour révéler une relation linéaire entre le volume AFM et la masse moléculaire approximative d'une protéine (complexe) 20 , permettant une interprétation des volumes mesurés. Les positions de liaison sur l'ADN pourraient donc être déterminées séparément pour le XPD monomère inactif de l'hélicase (~ 95 kDa, compatible avec les espèces de la classe 2 ~ 100 nm 3 dans la Figure 2 ) et pour les complexes XPD / p44 hépatiques actifs (~ 135 kDa, ~ 150 nm 3 espèces de classe 3), en fonction de leurs différents volumes AFM.

Détermination de la reconnaissance des lésions à partir des positions de liaison des protéines sur l'ADN

Ici, des substrats d'ADN longs (916 pb) contenant une lésion à ~ 30% de la longueur d'ADN ont été utilisés. Le contrôle de la position exacte de la lésion dans le substrat d'ADN permet de distinguer entre spécifique (lié à la lésion, à ~ 30% de la longueur de l'ADN) et le nonspeCific (recherche de lésion) dépend de leur position sur l'ADN. Deux lésions différentes ont été choisies, qui visent le NER; Les substrats d'ADN contiennent soit un adduit de fluorescéine (F), soit un dimère de cyclobutane pyrimidine (CPD). En plus du site de lésion, l'ADN contenait une région non accompagnée (bulle d'ADN de 8 nt) qui servait de site de chargement pour les hélicases. Ce site de chargement était situé à une distance de 26 nt (pour les substrats d'ADN contenant de l'ADN) ou 23 nt (pour les substrats contenant le CPD) à 5 'ou 3' de la lésion (voir tableau 1 ). La reconnaissance de la lésion entraîne une translocation de l'ADN bloquée des hélicases UvrB et XPD sur le site cible, apparente dans la répartition de la position de la protéine AFM sur l'ADN comme pic à la position de la lésion. Les positions de lésion et de bulle dans ces substrats ne peuvent en soi être distinguées dans les limites de résolution de l'imagerie AFM (<10 nm de distance). Cependant, la fraction de complexes spécifiques qui représente le aLe montage de molécules bloquées à la lésion et indique la reconnaissance de la lésion dépend fortement de la présence ou non d'une lésion à 3 'ou 5' de la bulle ( Figure 3 ) 9 .

A partir de la fraction de complexes au site spécifique (zone sous le pic d'ajustement gaussien par rapport à l'aire de fond non spécifique), la spécificité, S, UvrB et XPD pour les deux types de lésions étudiées a été calculée (voir protocole 3.2 ci-dessus). Pour UvrB, le chargement de 5 'de la position de la lésion a entraîné des spécificités plus élevées (S B, F5 ~ 200 et S B, CPD5 ~ 400) que le chargement de 3' de la lésion (S B, F3 et S B, CPD3 ~ 100) pour Les deux types de lésions. Pour XPD, les complexes contenant seulement le XPD (classe 2 sur la figure 2 ) et les complexes contenant le XPD ainsi que la protéine de cofacteur activant l'hélicase p44 (classe 3 sur la figure 2 ) ont été distingués comme décrDans la section précédente. Les pics de protéines de classe 2 (XPD uniquement, hélicase inactive) ne se situaient pas de manière préférentielle sur les sites de lésion indépendamment du fait qu'ils étaient chargés 5 'ou 3' et indépendamment du type de lésion (données non présentées). En revanche, les distributions de position pour les complexes XPD / p44 (classe 3) ont montré une liaison améliorée aux lésions F pour le chargement de 5 'de la lésion (S XPD / p44, F5 ~ 300 versus S XPD / p44, F3 ~ 100) mais au CPD Lésions pour le chargement de 3 'de la lésion (S XPD / p44, CPD3 ~ 600 contre S XPD / p44, CPD5 ~ 100, Figure 3 ). Étant donné que UvrB et XPD sont des hélicases de 5'à 3 ', ces données fournissent des informations sur le fait que les complexes sont bloqués par des interactions avec la lésion dans le brin ssDNA qu'ils transmettent (le brin transféré, pour charger 5' de la lésion) Ou dans le flanc opposé, non translocé (pour charger 3 'de la lésion). Le concept est schématisé dans

Étude des changements conformationnels sur l'identification de la lésion par XPD

La mesure de la flexion introduite dans l'ADN sur le site des complexes liés à partir d'images AFM (voir le Protocole 3.3 ci-dessus) peut révéler des informations importantes sur les changements complexes de conformation. Les angles de courbure de l'ADN ont été mesurés pour le XPD 5 archaïque, qui ne nécessite pas d'interaction co-facteur de protéine pour l'activité de l'hélicase. Dans ces études, une lésion de fluorescéine était située directementDans le contexte d'une bulle d'ADN pour une charge améliorée de protéines à la lésion, à ~ 30% de la longueur du fragment d'ADN. La figure 4 montre des ajustements gaussiens aux distributions d'angle de courbure d'ADN obtenues pour des complexes de protéines à des positions d'ADN non spécifiques (non endommagées) et à 30% de longueur d'ADN, compatibles avec XPD lié à la position de la lésion de fluorescéine (complexes spécifiques). Les données démontrent un angle de virage moyen de ~ 50 ° pour des complexes non spécifiques versus ~ 65 ° pour des complexes spécifiques. Ce déplacement de l'angle de pliage de l'ADN dépendait de la présence d'ATP ou d'ATP, ce qui indique que l'ATP (ré) liant mais pas l'hydrolyse était nécessaire pour les réarrangements conformationnels 5 .

Figure 1
Figure 1: Préparation des substrats d'ADN. Un espace de ssDNA est introduit dans l'ADN plasmidique circulaire en coupant le plasmide (ici avec la nickase N.BstNBI) à cloDes sites espacés et enlevant le schéma d'ADNc fourni par filtration par centrifugation après déstabilisation de la chaleur en présence d'un excès d'oligonucléotide complémentaire. Un oligonucléotide spécifique contenant la caractéristique de choix peut ensuite être recuit et ligaturé dans la région d'intervalle. Enfin, la digestion avec des enzymes de restriction (ici avec SspI et BspQI) aboutit à un substrat d'ADN linéaire avec la caractéristique cible à une position précisément connue (ici à 30% de la longueur du fragment d'ADN). Les tests de contrôle permettent de tester les étapes individuelles (illustrées ci-dessous) par électrophorèse sur gel d'agarose (la flèche noire indique 3000 pb). Le nickage peut être testé par la mobilité électrophorétique altérée de l'ADN circulaire découpé et détendu (coupure de contrôle, voie 2) par rapport au plasmide super-enroulé (voie 1). La désactivation complète de l'ADN ainsi que l'insertion ultérieure de l'oligo spécifique peuvent être testées par digestion avec une enzyme de restriction qui coupe dans la région de l'intervalle (ici: XhoI, inLes voies 2, 4 et 6) de sorte que le manque d'incision de l'ADN indique la formation de l'espace (pistes 1, 2 pence d'ADN, pistes 3,4 gapped DNA) et l'incision ré-bloquée indique l'insertion de l'oligo spécifique (pistes 5,6) . Le substrat linéaire final qui contient la caractéristique spécifique peut être purifié à partir du gel après électrophorèse sur gel d'agarose et testé pour l'homogénéité et la pureté par imagerie AFM. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Distinguer différents types complexes de leurs volumes AFM. ( A ) image AFM des complexes XPD / p44-DNA (flèche gris) et XPD-DNA (flèche noire). ( B ) Des exemples de trois types différents de complexes liés à l'ADN, interprétés comme p44 ou une simple superstructure d'ADN (classe 1),XPD (classe 2, cadre noir) et XPD / p44 (classe 3, cadre gris) en fonction de leurs volumes AFM (montré à droite). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: Différentes stratégies de reconnaissance de lésion des hélicases NER procaryotes et eucaryotes. La reconnaissance de la lésion par la NER helicases UvrB et XPD (en complexe avec son cofacteur activateur hépatique p44) nécessite le chargement des protéines dans une région d'ADN non appariée (bulle d'ADN). Les protéines se déplacent ensuite en direction 5'-à-3 'le long du brin ssDNA sur lequel elles ont chargé. Reconnaissance d'une lésion d'ADN (ici: CPD) par les hélicases soit sur le brin translocado (pour le chargement à 5 'bulle) soit sur le brin opposé non translocé (foR à la bulle de 3 ') entraîne une translocation de l'ADN bloquée. Dans les répartitions de position, cela montre un pic (lignes d'ajustement gaussiennes), ce qui indique une liaison améliorée à la position de la lésion (à ~ 30% de la longueur d'ADN pour les substrats d'ADN présentés ici). Le procaryote NER helicase UvrB et son équivalent eucaryote XPD montrent différentes stratégies de reconnaissance de la lésion CPD qui indiquent différentes préférences de fil d'ADN. Plus précisément, les lésions de CPD sont reconnues sur le brin translocé par UvrB, mais préférentiellement sur le brin opposé, non traduit par XPD. Figure modifiée à partir de la référence 9 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Changements conformationnels dans les complexes XPD-ADN lors de l'identification de la lésion. Les distributions des angles de flexion de l'ADN induits par XPD indiquent des changements de conformation dans les complexes protéine-ADN à une lésion de fluorescéine. Ces réarrangements conformationnels dépendaient de la présence d'ATP (B) ou d'ATPƔS (C). ( A ) En l'absence d'ATP, les angles de pli non spécifiques (gris) et les angles de pli sur le site de la lésion (angles de pli spécifiques, noir) sont similaires et ajustés par une courbe gaussienne avec un centre à ~ 50 °. ( B , C ) En présence d'ATP ou d'ATPƔS, la distribution d'angle de pli spécifique (noir) montre un décalage significatif (P = 2,5 x 10 -7 ) à un angle de virage moyen de ~ 65 °. Cette ADN se penchant sur le site de la lésion était indépendante du type de lésion (DPC ou adduit de fluorescéine) ou de la présence ou de l'absence d'une bulle d'ADN 5 . La figure a été reproduite à partir de la référence 5 . L'insertion dans (C) montre comment les angles de pli (180 °-β) ont été déterminés.Ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55501/55501fig4large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

nombre séquence la description
1 GGTCGACTCTAGAGGATCAGATCT
GGTACCTCTAGACTCGAGGCATGC 		bas
2 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAGTCGFCC 		F / 5 'bulle
3 / Phos / GCAFGCCTCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC 		F / 3 'bulle
4 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAT-TCGACC 		CPD / 5'bubble
5 / Phos / GCATGCT-TCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC 		CPD / 3'bubble
6 / Phos / GCA TGCCTCGAGTCTAGACTCF
TTCCATCTGATCCTCTAGAGTCGACC 		F / bulle

Tableau 1: oligonucléotides d'ADN pour la préparation du substrat d'ADN. Tous les oligonucleotides sont de 48 nt de longueur et les brins supérieurs (oligonucléotides 2-6) ont été obtenus phosphorylés à leur extrémité 5 'pour la ligature dans l'ADN gapped (voir le Protocole 1.1). F = thymine adductée à la fluorescéine, TT = cyclobutane pyrimidine (thymine) dimère (CPD), régions non complémentaires (régions formant des bulles d'ADN) sont soulignées. F contenant des oligonucléotides ont été obtenus auprès de Integrated DNA Technologies (IDT), les laboratoires de Thomas Carell (Ludwig-Maximilian University Munich, Allemagne) ont fourni de manière amicale des oligonucléotides contenant du CPD.

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Discussion

Les analyses statistiques AFM des positions contraignantes des protéines sur des fragments d'ADN longs qui contiennent des sites cibles spécifiques peuvent révéler des détails intéressants sur les stratégies particulières employées par la protéine pour reconnaître ces sites 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Pour interpréter les distributions de position résultantes, les positions des cibles dans l'ADN doivent être précisément connues. Ceci est obtenu en introduisant des sites spécifiques dans des positions de séquence bien définies en ADN plasmidique circulaire et en découpant un fragment de l'ADN comprenant ce site spécifique, en utilisant la technologie des enzymes de restriction. Dans les analyses d'image AFM des positions de liaison aux protéines, seuls les fragments d'ADN avec des longueurs correctes (compatibles avec la longueur totale du fragment découpé) peuvent être inclus car seulement pour ceux-ci, la position du site cible est connue. Ça ne vaut pasEn ce que la procédure de préparation décrite ici résulte en des substrats d'ADN linéaire avec deux extrémités de fragment indiscernables. Les distributions de position ne peuvent donc être mesurées et tracées qu'à partir de 0 x longueur d'ADN (protéines liées aux extrémités du fragment d'ADN) à 0,5 x longueur d'ADN (protéines liées au centre des fragments). En outre, pour les positions cibles qui ne sont pas situées exactement au centre du substrat, ces distributions contiennent toujours un petit fond de protéines qui ne sont pas liées spécifiquement à la même distance de l'autre extrémité de l'ADN. Cependant, l'ajustement d'une courbe gaussienne à la distribution axée sur la hauteur d'arrière-plan moyenne (protéines non liées spécifiquement, figure 3 ) explique ces complexes. Alternativement, l'une des extrémités de l'ADN peut être marquée, par exemple avec des pics de petit volume provenant de la structure secondaire formant des surplombs ssDNA 24 . Les limites de résolution typiques de ces analyses de position se situent dans la gamme de 100 fois la préférence de cible siSur la liaison non spécifique au site. En outre, les extrémités du fragment d'ADN ne constituent pas des sites d'ADNd spécifiques non spécifiques, mais représentent plutôt des ruptures d'ADNc. Les protéines de réparation d'ADN se lient souvent à ces extrémités de fragments déstabilisés, en plus des sites ciblés spécifiques introduits par le fil. La liaison par extrémité d'ADN peut être révélée par les analyses AFM et peut fournir des informations importantes sur la fonction d'une protéine. Si la liaison de l'extrémité de l'ADN n'est pas le centre d'intérêt, ces positions peuvent cependant être facilement omises dans les distributions de position en commençant les parcelles à une position> 0 ( par exemple ici 0,02 longueur d'ADN).

L'un des avantages particuliers et, en fait, la propriété définissante et commune des techniques à une seule molécule est la résolution des états individuels et différents présents dans un échantillon, qui peuvent posséder des propriétés et des activités très différentes. Même dans les cas où les espèces particulières d'intérêt ne sont que peu fréquentes dans un échantillon, ces approches permettent ainsiL'accent est mis sur cette espèce dont les contributions seraient annihilées dans une mesure d'ensemble. Pour les échantillons de protéines, par exemple, l'imagerie AFM permet la distinction directe entre différents types de complexes protéiques basés sur le volume complexe, si les tailles des différentes protéines diffèrent suffisamment (les limites de résolution typiques sont d'environ 20 kDa) 1 , 4 , 6 , 7 , 9 , 12 . Les systèmes AFM peuvent être calibrés pour permettre la traduction des volumes mesurés en poids moléculaire protéique (Protocole 3.1.3.1) 4 , 8 , 19 , 20 . Alternativement, les normes de protéines avec des tailles connues ont été utilisées comme référence directe dans les images 1 , 6 . dans leSystème axé sur ici, les positions de liaison sur l'ADN pourraient donc être déterminées séparément pour le XPD monomère inactif de l'hélicase et pour les complexes hétérodimères XPD / p44 hélicase actifs. La liaison préférentielle à un site de lésion à une position bien définie dans l'ADN a permis de reconnaître la lésion de l'ADN par un complexe de protéines. Puisque les sites de chargement et de lésion des protéines ont été séparés spatialement, la translocation de l'ADN était une condition préalable nécessaire à la reconnaissance de la lésion dans les substrats d'ADN utilisés ici. Seuls les complexes hétérodromes XPD / p44 étaient capables de translocation de l'ADN ( figure 3 ), conformément aux résultats des essais d'activité hépatique 9 . L'analyse du volume AFM peut donc fournir des informations importantes sur les activités différentielles de différentes formes complexes de protéines.

L'interaction et la reconnaissance de la lésion par le complexe XPD / p44 actif de l'hélicase ont entraîné une liaison accrue sur le site cible en raison du décalage de la translocation de l'hélicase ( figure 3 figure 3 ), cette découverte indique que l'enzyme détecte préférentiellement la fluorescéine sur le brin translocé mais le DPC préférentiellement sur le brin opposé non translocé. En revanche, la NER helicase UvrB procaryote reconnaissait préférentiellement les lésions de la fluorescéine et de la DPC en chargeant 5 'de la lésion, c'est- à -dire sur le brin translocé ( figure 3 ). Ces différences distinctives dans leurs propriétés de reconnaissance de lésion peuvent être comprises à partir des différentes propriétés structurelles des deux hélicases. UvrB interagit avec des cibles potentielles iN l'ADN via des résidus d'acides aminés à l'intérieur d'une caractéristique β-hairpin dans l'enzyme derrière laquelle le brin translocé est probablement fileté 16 , 25 . XPD, d'autre part, héberge un petit pore à proximité immédiate d'un groupe de fer-soufre (FeS) 26 . Le fil d'ADN translocé est susceptible de traverser ce pore 26 . Des lésions plus volumineuses telles que la fluorescéine peuvent bloquer la translocation de l'hélicase grâce à des interactions avec des résidus dans ce pore, tandis que des lésions de CPD moins encombrantes peuvent être identifiées plus facilement par des interactions avec le groupe de FeS. Dans le système procaryote, on pense que deux molécules d'UvrB sont impliquées dans la recherche de sites cibles dans un complexe hétéro-tétramère d'UvrA 2 -UvrB 2 , dans lequel chacun des deux monomères UvrB peut étudier un brin d'ADN différent 27 . Le XPD dans le NER eucaryote existe probablement comme une seule copie dans leComplexe de reconnaissance de lésion TFIIH. La flexibilité dans les approches d'interaction de lésion de l'enzyme eucaryote peut donc être nécessaire pour permettre la reconnaissance du spectre de site cible extrêmement important du système de réparation NER.

Étant donné que les complexes spécifiques (liés au site cible) et les complexes non spécifiques peuvent être distingués dans les images AFM en fonction de leurs positions sur l'ADN, ces différents types complexes peuvent être analysés séparément et comparés. L'AFM à une seule molécule est l'une des très rares approches qui donnent accès aux propriétés structurales des complexes protéiques liés de manière non spécifique à l'ADN en raison de leur nature souvent transitoire ou variable. Ici, les changements de conformation sur la reconnaissance du site cible ont été visualisés et caractérisés en XPD archaïque sur la base de la flexion introduite dans l'ADN par l'enzyme. Les données de l'AFM ont révélé un déplacement faible, mais distinct, des angles de courbure de l'ADN pour le XPD lié à un site de lésion versus XPD lié à l'ADN 5 non spécifique. ConformationalLes changements dans les protéines liées à l'ADN sur l'identification du site cible provoquent probablement le recrutement des endonucléases NER (XPG et XPF dans le NER eucaryote) qui effectuent l'excision d'un court tronçon de ssDNA contenant la lésion. Fait intéressant, ce décalage et donc un réorganisme conformationnel ont nécessité une liaison de l'ATP à l'enzyme (mais pas à l'hydrolyse). Une approche similaire de l'ATP-rappel sur l'identification du site cible et le recrutement ultérieur de l'endonucléase UvrC a été signalée pour UvrB dans le NER 28 procaryote 29 .

En résumé, l'imagerie AFM à une seule molécule a révélé des différences subtiles dans la reconnaissance du site cible par les hélicases NER procaryotes et eucaryotes. Une fois qu'une lésion cible a été identifiée par les enzymes, elles partagent une stratégie similaire de recrutement sélectif des endonucléases du NER par réconciliation conformationnelle induite par la liaison ATP à la lésion. La technique de l'AFM en comLa bination avec une conception soigneuse du substrat d'ADN pour imiter les propriétés essentielles du système étudié peut donc donner un aperçu des interactions entre les sites cibles non seulement de la réparation de l'ADN mais des systèmes de protéines liées à l'ADN en général. Les informations structurelles sur des complexes spécifiques et non spécifiques avec des résolutions dans la gamme des nanomètres (au niveau moléculaire, limité par la sonde AFM) peuvent contribuer de manière significative à la compréhension des mécanismes impliqués.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

PUC19N, des oligonucléotides contenant du CPD et p44 ont été fournis par Samuel Wilson, Korbinian Heil et Thomas Carell, et Gudrun Michels et Caroline Kisker, respectivement. Ce travail a été soutenu par des subventions de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 et TE-671/4 à IT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Force Probe (MFP) 3D Asylum Research N/A atomic force microscope (AFM)
Precision 390 DELL N/A computer
ThermoMixer and 1.5 mL block Eppendorf 5382000015 heat block for DNA preparation
Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 mL tubes Carl Roth GmbH Y264.1 & Y267.1 heat block for protein-DNA incubations
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad Laboratories GmbH 1704467 electrophoresis chamber with gel caster and power supply
Power Pac Basic Bio-Rad Laboratories GmbH 1645050 electrophoresis power supply
Centifuge 5415 D with rotor Eppendorf 2262120-3 table centrifuge
Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 Ultralum 900-1322-02 UV irradiation table
NanoDrop ND-1000 VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH N/A UV spectrophotometer
TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter Unity Lab Services N/A water deionization and filter unit
Name Company Catalog number Comments
Software
MFP software on Igor Pro Asylum Research N/A AFM software
ImageJ (open source Java image processing) NIH Image N/A Image analysis software
Excel (Microsoft Office) Microsoft Corporation N/A data analysis software
Origin9 / Origin2016 OriginLab Corporation N/A statistical data analysis and graphing software
Name Company Catalog number Comments
Material
OMCL-AC240TS Olympus OMCL-AC240TS AFM cantilevers
grade V-5 muscovite SPI Supplies 1805 mica sheets
Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell Millipore Ireland Ltd. UFC505096 centrifuge filters
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH 740 609.250 Agarose gel extraction kit
Rotilabo cellulose paper type 111A Carl Roth GmbH AP59.1 AFM deposition blotting paper
Anatop 25 (0.02 μm) Whatman GmbH 6809-2102 syringe filter
SSpI, BspQI New England Biolabs (NEB) R0132, R0712 restriction enzymes for DNA substrate preparation
XhoI, BglII R0146, R0144 restriction enzymes for DNA preparation controls
nicking restriction enzyme Nt.BstNBI New England Biolabs (NEB) R0607 nickase
T4 DNA ligase New England Biolabs (NEB) M0202S Ligase
Tris, HEPES Carl Roth GmbH 4855, 9105 buffer chemicals
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate Carl Roth GmbH 3957, HN03, HN02, P026 salt chemicals
NaAc Sigma-Aldrich Chemie GmbH 32318 salt chemicals
DTT, TCEP, EDTA 6908, HN95, 8040 chemicals/reagents
agarose, acetic acid, HCl Carl Roth GmbH 2267, 3738, K025 reagents
ATP Carl Roth GmbH K054 nucleotides
oligonucleotide #1 in Table 1 Biomers custom complementary DNA oligonucleotide
oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 Integrated DNA Technologies (IDT) custom fluorescein containing oligonucleotides
oligonucleotides #4  and #5 in Table 1 private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) CPD containing oligonucleotides
SafeSeal reaction tube 0.5 mL and 1.5 mL Sarstedt 72.704 and 72.706 incubation tubes
GeneRuler 1 kb Thermo Scientific SM0311 DNA ladder
6x concentrate gel loading dye purple New England Biolabs (NEB) 51406 DNA loading dye
Midori Green  Nippon Genetics Europe GmbH 999MG28055 DNA stain

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References

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Génétique numéro 123 microscopie à force atomique (AFM) interaction protéine-ADN réparation d'ADN réparation d'excision de nucléotides (NER) reconnaissance de lésion d'ADN modification d'ADN préparation d'échantillons AFM analyse de volume AFM analyse de position de liaison ADN.
Microscopie de la force atomique Enquêtes sur la reconnaissance des lésions de l&#39;ADN dans la réparation de l&#39;excision des nucléotides
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Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I.… More

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I. Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair. J. Vis. Exp. (123), e55501, doi:10.3791/55501 (2017).

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