Summary
(+/- M83 : GFAP의 -luc +/-)의 Tg는 복막 내로 또는 혀의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 가족적 A53T 돌연변이와 반딧불이 루시퍼 라제와 인간의 α- 시누 클레인 표현 마우스, 신경 염증을 포함한 신경 병리학을 유도 할 그들의 중추 신경계한다.
Abstract
잘못 접힌 알파 - 시누 클레인의 프리온 같은 동작을 연구하기 위해 마우스 모델은 중추 신경계 (CNS)에서 신경 병리학을 일으킬 알파 - 시누 클레인의 prionoids의 빠르고 간단하게 전송을 허용하는 것이 필요하다. 마우스, 프리온 단백질 프로모터로부터 A53T 돌연변이와 인간의 α- 시누 클레인 과발현과 반딧불에서 루시퍼 : 여기에서는 bigenic의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83 +/-)으로의 α- 시누 클레인 브릴의 intraglossal 또는 복강 내 주사를 설명 글 리아 섬유 성 산성 단백질 프로모터 (GFAP), 신경 병리학 적 질환을 유발하기에 충분하다. 동물 그들이 도달 할 때까지 자연 질환 무료 남아 8 개월 이형의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83 +/-)의 나이에 시작 심한 신경 학적 증상이 동형 접합의 Tg (M83 + / +) 마우스와 비교 22개월의 나이. 흥미롭게 intraperitone 통해 알파 시누 클레인 브릴 주입229 ± 십칠일의 중간 배양 시간과 마우스 : 알 경로가 다섯의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83 +/-) 네 마비와 신경 학적 질병을 유발. 병에 걸린 동물은 뇌와 척수에서 인산화 된 알파 - 시누 클레인의 심각한 예금을 보였다. 알파 시누 클레인의 축적은 sarkosyl 불용성이었고 유비퀴틴과 P62와 colocalized 및 성상 신경교 증 및 microgliosis 결과 염증 반응을 수반 하였다. 놀랍게도, 혀에 알파 - 시누 클레인 원 섬유의 접종 285 일 후에 알파 - 시누 클레인 병리를 보여주는 다섯 주입 동물의 한으로 질병을 일으키는 덜 효과적이었다. 우리의 연구 결과는 (+/- M83을 : GFAP의 -luc를 +/-) 복강 내 경로를 통해 intraglossal 노선과 더욱 그렇다 통해 접종의 Tg에 synucleinopathies의 관련 특징과 신경 학적 질병을 유도하기 적합하다는 것을 보여 쥐를. 이 유도 프리온 같은 기전 연구를위한 새로운 모델을 제공합니다보다 상세히의 α- 시누 클레인의 prionoids d 개의.
Introduction
알파 - 시누 클레인은 특히 자기 씨앗 용량에, 프리온 단백질의 것과 유사 세포 사이의 연결 경로를 따라 미스 폴딩을 전파 특성을 가지고 성장 증거가있다. 알파 - 시누 클레인의이 속성은 '프리온 같은'또는 'prionoid'라고, 새로 건강한 뉴런 1, 2를 이식하는 병에 걸린 뉴런에서 잘못 접힌 알파 - 시누 클레인의 전달률을 제안 이식 실험에서 관찰에 의해 지원됩니다 3, 4. 또한 뇌 또는 주변부, 예 뒷다리 근육이나 장벽의 말단 부분의 α- 시누 클레인 병리의 확산의 결과로 잘못 폴딩의 α- 시누 클레인의 직접 분사 CNS의 5, 6, 7, <SUP 클래스 = "외부 참조"> 8, 9, 10. 우리는 더 상세히 주변 경로를 통해 알파 시누 클레인의 prionoids의 송신을 분석 미스 폴딩의 α- 시누 클레인은 단일 intraglossal 또는 복강 내 주사 한 후 이전 프리온 위해 아니라 잘못 폴딩 알파 위해 도시되었던 기능을 CNS를 neuroinvade 수 있는지 질문을 해결 시누 클레인. 혀에 프리온 주입 후 CNS의 neuroinvasion는 뇌간 (11)에있는 설하 신경의 핵 리드 혀 설하 신경을 따라 전달을 통해 달성된다. 하여 성상 세포의 활성화를 모니터 프리온 프로모터, 인간의 α- 시누 클레인의 A53T 변이체를 과발현하고 반딧불이 GFAP 프로모터의 제어 하에서 루시페라아제 마우스 : 마우스 모델로 우리의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83를 +/-) 선택한 생물 발광, 이전의 뇌에서와 같이쥐 12 프리온은 감염. 우리의 손에 bigenic의 Tg (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) 다른 사람 (13)에 의해 도시 된 바와 같이 마우스는 시대의 23개월까지 질병을 개발하지 않았다. 뇌에서 병리학, Tg 및 척수와 intraglossal 또는 복강 내 경로 유도 된 신경 질환을 통해 인간의 α- 시누 클레인 브릴의 단일 주입 : 가설을지지 생쥐 (+/- +/- M83 GFAP의 -luc) 알파 - 시누 클레인의 prionoids 프리온 (14)와 중요한 특성을 공유합니다.
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Protocol
동물을 포함한 모든 절차는 노르 트라 인베스트 팔렌 주 환경청 (LANUV)의 동물 보호위원회의 승인을 수행 하였다. 동물을 수용하고, 12 시간 광 / 암주기 및 음식과 물에 자유롭게 접근하는 표준 조건에 따라 든다고 하였다.
1. 동물 모델
- Tg가 서로 엇 hemizygous (GFAP의 -luc +/-) hemizygous bigenic의 Tg (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) 생성 hemizygous의 Tg (M83 +/-) 마우스와 마우스 마우스 (15), (16).
- 개똥 벌레 루시퍼 라제 (12), (17)을위한 트랜스 코딩 인간의 α- 시누 클레인의 표준 PCR과 존재를 실시간 PCR과 자손의 유전자형.
- 여섯 - 투 - 8 주 시대에 동물을 접종한다.
2. 접종 제조
- 미주리 준비로되어있는 한 20 mM 트리스 - 염산 (pH를 7.2) 150 mM의 NaCl을 함유하는 TBS 버퍼 (TBS) 완충액에 A53T 돌연변이와 nomeric 재조합 인간의 α- 시누 클레인은 앞서 설명한 14.
- 800 rpm에서 5 일간 37 ℃에서 오비탈 진탕 단량체 재조합 인간의 α- 시누 클레인의 3 ㎍ / μL 교반하여 접종을 위해 섬유상의 α- 시누 클레인을 준비한다.
- intraglossal 접종에 대한 복강 내 또는 2 ㎍ / μL 1 개 ㎍ / μL의 최종 농도에 도달하기 위해 인산 완충 용액 (PBS)에 브릴 어셈블리 희석.
- 얼음 (각 펄스와 50 %로 설정된 진폭의 1 초 휴지 기간의 0.5 40 펄스)을 1 분 동안 초음파 처리와로드 알파 시누 클레인 브릴을 조각. 교차 접종에 의한 오염을 방지합니다. 다른 접종을 준비하는 깨끗한 초음파 프로브를 사용합니다.
3. Intraglossal 주사
- intrape과 동물을 마취100 ㎎ / ㎏의 케타민과 10 밀리그램 / kg의 자일 라진 ritoneal 주입. 동물의 발가락을 꼬집어하고 적절한 마취을 보장하기 위해 자사의 사지를 철회하지 않는 것을 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
- 신중 연구자 향 머리와 등쪽 누운 자세에서 가열 플레이트 상에 접착 테이프 narcotized 동물을 고정한다.
- 초음파의 α- 시누 클레인 브릴 또는 PBS 5 μL와 27 G 일회용 피하 주사기를 채우기.
- 동물의 입이 열려 개최 톱니 모양의 팁을 하나의 뭉툭한 코 엄지 손가락 집게를 사용하여 집게의 작은 제 2 쌍은주의 깊게 주입을위한 혀의 바닥면에 액세스 할 수 있도록하기 위해 혀를 당겨.
- 설하 신경 부근의 혀의 오른쪽 또는 왼쪽 하단 측에 주사기 바늘을 주입한다. 천천히 5 초 후 접종을 주입. 천천히 접종 있도록 5 초 후 바늘을 철회조직을 침투하고 바늘을 철회하면서 손실되지 않습니다.
- 그 고정물에서 동물을 해제하고 완전한 복구 될 때까지 지속적인 모니터링에서 가열 플레이트에 둡니다.
4. 복강 내 주사
- 복강 내 주사를 위해, 2 L / min의 유량으로 2 %로 설정 증발기를 사용하여 이소 플루 란 / 산소 흡입 마취 챔버 내에 곧 동물을 마취시키다. 동물의 발가락을 꼬집어하고 적절한 마취을 보장하기 위해 자사의 사지를 철회하지 않는 것을 확인합니다.
- 초음파의 α- 시누 클레인 브릴 또는 PBS 50 μL와 27 G 일회용 피하 주사기를 채우기.
- 직접 마우스의 복강에 주사하고, 조사원으로부터 떨어져 대면하는 헤드와 등쪽 위치 동물 잡고 하향으로 대략 45 °로 복부 벽 뒤에있는 소장 또는 맹장 관통 피한다. 그들이 회복 될 때까지 동물을 모니터링마취에서.
5. 생물 발광 영상
- 이미지의 Tg (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) 마우스 생물 발광 이미징 시스템을 사용하는 모든 2-4주.
- 곧 묘화 2 L / min의 유량으로 2 %로 기화기로 이소 플루 란 / 산소 챔버에서 쥐를 마취 전에. 동물의 발가락을 꼬집어하고 적절한 마취을 보장하기 위해 자사의 사지를 철회하지 않는 것을 확인합니다.
- 면도와 제모 크림 쥐의 머리를 털을 뽑다. 불특정 생물 발광을 차단하는 비 자극 마커와 블랙의 귀를 색상.
- 30 ㎎ / ㎖의 스톡 용액에 D-PBS 칼륨 염 루시페린, 루시 페라 제의 기판을 희석. -20 ° C에서 1 mL를 씩이 보관하십시오. 노광에서 용해 D-루시페린 보호.
- 주입하기 전에 동물의 무게를. 150 mg / kg (체중)의 주입을위한 D-루시페린의 정확한 양을 계산한다. 복강 주사 D-luciferin 및 마취 챔버에 동물을 반환한다.
- 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 이미징 시스템이 도달하면 작동 온도 제어판에서 '초기화'버튼을 클릭하여 시스템을 초기화합니다.
- 버튼 '발광'과 '사진'을 선택합니다. 60 초, '보통'의 F / 정지 '1'로 비닝 (binning)과 '끄기'로 EM 이득에 노출 시간을 설정합니다.
- 여기 필터 '열기'을 '차단'하고, 발광 필터로 설정되어 있는지 확인하고, 1.50 cm 피사체 높이를 설정.
- 텐 분 D-루시페린과 주사 후, 촬상 챔버 내의 가열 플레이트 상에 동물을 배치하고 그 총구 올바르게 마취 출구에 배치되도록. 흡입 챔버로부터 이소 플루 란 / 산소 유량을 닫고 0.25 L / min의 유량으로 2 %의 증착과 촬상 챔버에 대한 흐름을 연다. 이미징 챔버 홍보의 문을 닫습니다operly.
- 60 초 걸리는 생물 발광을 측정하기 위해 '획득'버튼을 클릭합니다. 이소 플루 란의 흐름을 중지하고 완전히 자신의 새장에 다시 반환 후 회복 될 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
- 생물 발광을 정량화하기 위해 이미징 소프트웨어를 사용합니다. '도구 팔레트'내에서의 투자 수익 (ROI) 도구 '를 선택합니다. 의 투자 수익 (ROI) 도구 '에서'유형 '에서'측정 투자 수익 (ROI) '를 선택합니다.
- 의 투자 수익 (ROI) 도구 '내에서 "원"도구를 클릭하고 풀다운 메뉴에서 그릴 로아의 수를 선택 - 이상적으로'3 '세 마우스에 대해.
- 이미지에서 각 ROI와 아래는 '속성'1.25 cm에 폭과 높이를 조정 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 정량화 뇌 영역에 걸쳐 각각의 투자 수익 (ROI)을 배치합니다.
- 화상의 상부 좌측에, "빛 (광자) '단위로 패널을 설정.
- '도구 팔레트'내 선택 '이미지 보정'최소를 조정하고0.20e6에서 1.00e6에 인스턴스의 '색 눈금'의 최대.
- '파일'에서 '저장'을 사용하여 데이터를 저장합니다.
6. 생화학 분석
- 설립 프로토콜 (18), (19)에 따라 뇌와 척수를 분리합니다.
- 조직 균질 기에서 6,000 rpm으로 30 초 두 사이클로 (PBS에 1 배 희석), 프로테아제 및 포스파타제 억제제의 존재하에 별도로 PBS에서 전체 뇌와 척수 전체 샘플 균질화. 뇌와 척수 시료를 20 % (중량 / 부피)의 최종 농도로 균질화되었는지 확인.
- 10 s의 일정한 펄스와 50 %로 설정된 진폭 얼음들을 유지하면서 두 샘플을 초음파 처리.
- PBS 중 1.5 M NaCl로 1 : 1 그들 희석 PBS 750 mM의 NaCl을 10 %의 균질을 조정한다.
- 세포 파편을 분리하기 위해 5 분으로 1,000 XG에서 균질 원심 분리4 ° C. 다음 단계의 상층 액을 유지하고 알약을 폐기합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 bicinchoninic 산 (BCA) 분석을 사용하여 균질의 단백질 농도를 측정한다. 얼음 위에서 15 분 동안 10 % (중량 / 부피)의 최종 농도에서 N-laurylsarcosyl 척수 균질의 뇌 균질 물에서 총 단백질 1.0 mg을 0.8 mg의 인큐베이션.
- 증류수 10 % (중량 / 부피)의 3 mL의 슈 크로즈 쿠션 상에 균질 오버레이, 4 ° C에서 1 시간 동안 465,000 XG 그들을 초 원심 분리기.
- 4 % 도데 실 황산나트륨 (SDS), 2 % β 메르 캅토 에탄올, 192 mM의 글리신, 25 개 mM 트리스, 5 % (중량 / 부피) 수 크로스를 함유하는 완충액에 재현 탁 펠릿.
- 5 분 동안 100 ℃에서 샘플을 비등하고 morpholineethanesulfonic 술폰산 (MES) 버퍼 시스템에 대한 전기 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 상에 로딩들을.
- 주사 전자 현미경 (SEM)으로 분리 된 폴리 비닐 리덴 디 플루오로 단백질 (PVDF) 멤브레인 전송시스템을 모래 바닥 idry.
- 가교 35 RPM으로 로터에 실온에서 30 분 동안 PBS에서 (부피 / 부피) 포르말린 용액 멤브레인 단백질 0.4 %의 막을 인큐베이션.
- 0.05 % (부피 / 부피의)을 포함하는 TBS 버퍼 트윈 20, 실온에서 1 시간 동안 5 % (중량 / 부피) 우유에서 막을 차단.
- 4 ℃에서 밤새 블로킹 완충액에 일차 항체로 블롯을 인큐베이션.
- TBS 버퍼 막 세 번 세척하고, 실온에서 1 시간 동안 TBS에서 페 록시 또는 형광 접합 된 이차 항체로 부화.
- 확립 된 프로토콜 20에 따라 화학 발광 또는 형광으로 결합 이차 항체를 시각화.
7. 면역 형광 분석
- 휴지 프로세싱 스테이션에서 해부 뇌 및 척수 탈수 및 파라핀 스테이션을 사용하여 파라핀에 그들을 삽입.
- 파라핀 포매 TIS 컷8 개 μm의 두께 코로나 섹션 마이크로톰으로 고소와 유리 슬라이드에 섹션을 탑재합니다.
- 10 분에서 5 개의 분리 크 실롤 조에이를 배양하여 조직 절편을 Deparaffinize 및 등급 에탄올 욕 (100 %, 90 %, 70 %, 50 %)의 시리즈를 통해 최종적으로 H 2 O로 재수
- 실온에서 5 분간 0.01 M 시트 레이트 완충액 (pH 6.0)의 섹션을 인큐베이션 추가적으로 마이크로파 오븐에서 10 분 동안 삶아.
- 섹션을 실온까지 냉각하고, 내인성 퍼 옥시 다제를 억제하는 30 분 동안 3 % 과산화수소로 부화하자.
- 20 % (부피 / 권) 정상 염소 혈청, 1 % (부피 / 부피) 소 혈청 알부민 (BSA), 0.5 % 트리톤 X-100을 실온에서 1 시간 동안 PBS에 함께 배양하여 조직 절편을 차단.
- 1 % (부피 / 부피) 정상 염소 혈청, 1 % (부피 / 부피) BSA, 0.25 % 트리톤 X-PBS에서 밤새 100에서 4 ℃로 희석 차 항체와 함께 인큐베이션 섹션. <리> 0.25 % (부피 / 부피의) 트리톤 X-100의 PBS 일단 PBS로 두 번 씻어 섹션.
- 해당 형광 접합 된 이차 항체를 실온에서 1 시간 동안 1 % 희석 핵 염색 DAPI (용적 / 권) 정상 염소 혈청, 1 % (부피 / 부피) BSA 및 PBS와 섹션 얼룩.
- 0.25 % (부피 / 부피의) 트리톤 X-100의 PBS 일단 PBS로 두 번 세척 한 후, 내장 미디어 슬라이드를 커버 슬립 및 공 초점 레이저 주사 현미경에 의한 염색을 시각화.
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Representative Results
마우스 (표 1 및도 1)은 혀 또는 bigenic의 Tg의 CNS (GFAP의 -luc +/- +/- M83)의 복막 유도 병리학 통해 알파 시누 클레인의 prionoids 주변의 주입. 알파 - 시누 클레인 섬유소와 하나의 복강 내 주사 한 후, 다섯 마우스의 네 229 ± 십칠일의 중간 배양 시간과 신경 학적 질환을 개발했다. 놀랍게도, 단지 1 ~ 5의 마우스 285 일 후 알파 - 시누 클레인 원 섬유와 intraglossal 주사 후 CNS 질환을 개발했다. PBS로 접종 실험의 420 일 이내에 질병이 발생하지 않았다.
웨스턴 블로 팅 및 알파 - 시누 클레인의 Ser129에 대한 인산화 특정 EP1536Y 항체 프로브에 의한 생화학 적 분석은 모두 전송 경로에 대한 병에 걸린 동물 인산화 및 sarkosyl의 집계를 축적 한 것으로 나타났습니다뇌 및 척수 (표 2 및도 2)에 -insoluble의 α- 시누 클레인. 대조적으로, 뇌와 PBS-주입 비 병에 걸린 동물의 척수는 인산화 된 알파 - 시누 클레인의 단량체 종을 포함.
포스 포 특이 pSyn # 64 항체를 복강 주사하고 병의 생쥐 뇌 조각의 면역 염색은 CNS 전반 인산화의 α- 시누 클레인 예금의 넓은 분포를 보여 (표 2 및도 3). 또한, 인산화 된 알파 - 시누 클레인 예금 유비퀴틴 및 P62 예금의 형성에 기여할 가능성이있는 비정상적인 단백질 항상성을 표시와 함께 colocalized.
병에 걸린 동물의 알파 - 시누 클레인 집계의 축적에 의해 감지 된 신경 염증성 변화, 동행했다GFAP 반응성 astrogliosis를 밝힐 수 성상 세포의 마커 (도 4)에 대한 면역 염색. 또한, 활성화 된 미세 아교 세포는 IBA-1 면역 염색으로 풍부한 알파 - 시누 클레인 병리 (이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1)과 영역에서 발견되었다. 따라서, 생물 발광 영상이 빛을 밝혀 증가 (> 2 × 106 P / S / cm 2 / SR)의 Tg의 뇌로부터 방출 (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-)의 α- 시누 클레인 브릴 주사 마우스, 그들은 신경 학적 질병의 징후를 개발 직전. 반대로, PBS 주사 한 마우스의 뇌는 빛의 증가를 나타내지 않았다. 루시퍼 라제의 발현은 프로모터 GFAP에서 구동되기 때문에 증가 된 빛은 반응성 astrogliosis, 신경 염증의 특징을 나타낸다.
도 2 : 마우스 : 둘레의 CNS에서 인산화의 α- 시누 클레인의 생화학 적 분석 (TG GFAP의 -luc +/- M83를 +/-) 주사. (A) 면역 블 롯팅은 EP1536Y 항체, α- 시누 클레인의 Ser129에서 인산화를 인식 복강 주입 병 쥐 뇌에서 인산화의 α- 시누 클레인의 sarkosyl 불용성 응집체의 고 분자량 종을 축적 것을 보여준D 척수. PBS와 도전 제어 마우스는 인산화 된 알파 - 시누 클레인의 집계를 축적 만의 단량체 양식 밴드를 보였다하지 않았다. 다른 intraglossally 접종 마우스의 α- 시누 클레인의 침착없이 건강을 유지하는 반면 알파 시누 클레인 브릴 하나만 마우스 동물 121와 intraglossal 공격 후 (B)는, 그 뇌 및 척수에서의 인산화의 α- 시누 클레인의 sarkosyl 불용성 응집체를 보였다. 분자 질량은 킬로 달톤에 표시됩니다. 각 레인의 샘플 로딩 액틴의 검출에 의해 표시된다. Breid 동부 등으로부터 변성. 2016 년 (14). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 면역 형광 분석의 것은 예금을 보여줍니다마우스 : 인산화의 α- 시누 클레인은 두뇌 질환의 Tg (GFAP의 -luc +/- +/- M83)의 척수에서 유비퀴틴과 P62와 colocalize. 시상 핵 (A) 및 척수에서 관찰 된 바와 같이 회백질 (B)에서 검출 된대로 EP1536Y 항체 검출 인산화의 α- 시누 클레인의 공동 염색 및 유비퀴틴은 뇌에 뚜렷한 colocalization을 밝혀의 알파 - 시누 클레인 원 섬유 복강 도전 후 병에 걸린 쥐. 마찬가지로 pSyn # 64 항체로 검출 인산화의 α- 시누 클레인은 또한 뇌 (C) 병든 동물 척수 (D)에서와 P62 colocalized. (D에 A)이 단백질의 보증금 colocalization을 보여주지 않았다 건강한 대조군을 PBS 주입. DAPI와 핵 염색은 파란색으로 표시됩니다. 스케일 바는 20 μm의 =. Breid 동부 등으로부터 변성. , 2016 (14). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4의 Tg (M83 +/- : GFAP의 -luc가 +/-) 마우스의 α- 시누 클레인의 피 브릴과 주변 공격 후 신경교 증을 개발 하였다. GFAP, 별아교 세포의 마커에 대한 항체와 병든 동물 뇌의 섹션 (A) 면역 형광 분석은 pSyn # 64 항체 뇌간에서 검출 인산화의 α- 시누 클레인의 예금 영역에서 반응성 astrogliosis 밝혀. 반대로, PBS가 주입 된 대조군 마우스의 뇌에서 더 반응성 astrogliosis 없었다. (B) 유사하게, IBA-1 항체로 염색, 미세 아교 세포의 마커는 microgliosis 입증병에 걸린 동물의 인산화 알파 - 시누 클레인의 예금을 가진 지역이다. 건강하고, PBS 주입 제어 쥐의 뇌는 microgliosis의 흔적을 보이지 않았다. 성상 세포의 활성화에 의해 발생 된 복강의 α- 시누 클레인 브릴 (왼쪽 패널)과 주사 마우스, (C) 생물 발광 영상은 뇌 및 (GFAP의 -luc +/- +/- M83)의 Tg의 척수에서 높은 빛 밝혀 생쥐가 신경 학적 증상을 개발 직전. PBS-주입 제어 쥐의 뇌와 척수에 기초 빛은 시간 (오른쪽 패널) 증가하지 않았다. 알파 - 시누 클레인 섬유소와 intraglossal 접종 한 후, 하나의 Tg (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) 마우스, 동물 (121)는,이 285일 (중앙 패널)에서 사망 직전 반응 astrogliosis의 흔적을 보여 주었다. Tg를 복강 내 접종 후 (D) (+/- M83 : GFAP의 -luc +/-)의 α- 시누 클레인 브릴을 increa 쥐생물 발광의 SED 수준 (> 2 × 10 6 P / S / cm 2 / SR)은 그들이 병의 신경 학적 증상을 개발 몇 주 전에 네 마우스 (파란색, 녹색, 갈색, 오렌지 원)의 뇌에서 측정 하였다. 다섯 가지 동물 중 하나는 또한 285일 알파 - 시누 클레인 원 섬유 (마젠타 원)와 intraglossal 주사 후 사망 직전 생물 발광의 높은 수준을 보였다. 건강, PBS가 주입 된 대조군 마우스 용 명암에서, 알파 - 시누 클레인 브릴 (적색 원)을 복강 내 주사 한 후 질병을 개발하지 않은 하나 개의 동물, 생물 발광 신호가 유지 (검은 동그라미 오차 막대는 SD은 [N = 4] 표시) 관찰 기간 내에서 2 × 106 P / S / cm 2 / SR의 임계치 이하. 스케일 바는 20 μm의 =. Breid 동부 등으로부터 변성. 2016 년 (14). 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림.
| 마우스 라인 | 접종 (μg의) | 접종 경로 | 질환을 가진 쥐의 번호 / 아니오. 마리 접종 | SD ± 평균 생존 기간 (일) |
| TG (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) | 인간 α-synuclein의 피 브릴 (50) | 복강 | 4/5 | 229 ± 4백20분의 17 |
| TG (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) | PBS | 복강 | 0/5 | 0/420 |
| TG (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) | 인간 α-synuclein의 피 브릴 (10) | intraglossal | 1/5 | 420분의 285 |
| TG (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) | PBS | intraglossal | 0/4 0/420 |
표 1 : 접종 실험. * Breid 등의 알에서 수정. 2016 14
| 타겟 [클론 항체] | 숙주 | 면역원 | IF에서 희석 | WB의 희석 |
| 액틴 [C4] | 쥐 | - | - | 1 : 1,000 |
| α-시누 클레인, 포스 S129 [pSyn 번호 64] | 쥐 | pSer129 | 1,200 : 1 | - |
| α-시누 클레인, 포스 S129 [EP1536Y] | 토끼 | pSer129 | 1 : 100 | 1 : 1,000 |
| glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) | 토끼 | - | 1 : 200 | - |
| IBA-1 | 토끼 | - | 1 : 500 | - |
| Sequestosome -1- (P62) | 토끼 | - | 1 : 100 | - |
| 유비퀴틴 [유비 1] | 쥐 | - | 1 : 500 | - |
표 2 : 면역 형광 (IF)과 서양의 블로 팅 (WB)에 사용되는 항체. * Breid 등의 알에서 수정. 2016 14
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Discussion
Tg는 (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-)의 복막 내로의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 마우스 synucleinopathies의 중요한 특성 요점을 되풀이하는 신경 염증을 동반 신경 질환을 유발하는 용이 한 방법을 나타낸다. 마찬가지로, 혀 주입 트랜스 제닉 마우스에서의 α- 시누 클레인의 prionoids 의해 neuroinvasion 대한 다른 경로를 나타내고 있지만, 덜 효율적이다. 우리는 주사 후 420일에서 실험을 종료하기로 결정했습니다 우리는 더 많거나, 피 브릴 주입 마우스의 모든 이후의 시점에서 질병을 개발 할 수있는 가능성을 배제 할 수 없다. 또한, (+/- M83 : GFAP의 -luc +/-)의 Tg의 사용 마우스 astrogliosis의 비 침습성 시각화를 가능하게하고, 전체 수명 동안의 α- 시누 클레인의 neuroinvasion에 의한 염증 반응을 모니터링하기위한 간단한 방법을 나타낸다 쥐.
중요한 단계이다 조제접종의. 집합 시간, 초음파 시간, 독소의 풍요 로움, 또는 잘못 접힌 알파 - 시누 클레인 (21)의 시드 성향에 영향을 미치는하여 실험의 결과에 영향을 미칠 수 주입에 사용되는 섬유소의 양처럼 겉으로는 사소한 요인. 그러므로 주사 접종을 준비 할 때 항상 같은 조건을 사용하는 것이 중요합니다. intraglossal 주사의 경우 그것은 설하 신경뿐만 아니라 설인 신경과 같은 다른 뇌신경뿐만 아니라 혀를 신경을 분포시키다 뇌에 알파 - 시누 클레인의 prionoids의 interneuronal 수송에 관여 할 수있을 것으로 예상 할 수있다. 따라서 뇌 상이한 확산 동역학을 초래할 수 혀의 상이한 영역을 표적. 우리는 직접 설하 신경에 주입하지 않았고 설하 신경을 대상으로하는 알파 - 시누 클레인의 prionoids의 CNS 전송을 향상시킬 수있는 가능성이있다. 알파 시누 클레인 브릴 복강 내 주사제 인 것이 criti접종이 제대로 복막에 주입이 아닌 실수 부정적인 neuroinvasion에 영향을 미칠 수있는 장 또는 맹장과 같은 내부 장기에있다 칼. D-루시페린 주입 때도 생물 발광 이미징을 위해 중요하다. 내부 장기에 D-루시페린의 Mistargeting은 뇌에 유통 속도가 느려지고 낮은 생물 발광 될 수 있습니다. 이를 영상화하는 동안 균일 한 결과를 얻기도 항상 신선 전에 주입하고 정확하게 촬상 전에 복강 내 주사 후 10 분 동안 배양하도록하는 D-루시페린 용액을 제조하는 것이 중요하다.
생물 발광 촬상 시간 경과 astrogliosis 비 침습적으로 측정 변화에 유용한 방법이다 예컨대, 뇌내 또는 정맥 주사를 위해, 단지 intraglossal 복강 주사 한 후뿐만 아니라, 처리를 포함한 모든 유형의 후 적용될 수있다. CN으로 외주로부터의 α- 시누 클레인의 prionoids 확산 모니터하려면S 및 우리 bigenic Tg가 사용 이어지는 신경 염증 (+/-를 M83 : GFAP의 -luc +/-) 마우스. 이 동물의 알파 - 시누 클레인의 hemizygous 표현은 시대의 최대 22 개월 동안 자연 질환 무료 남아 알파 - 시누 클레인 전송에 적합한 유전 적 배경 (13) 연구가 동형 접합 동물 40 % 낮은 상대이기 때문이다. 그러나, 생물 발광 영상의 마우스 모델의 선택에 대한 수정이 바람직 할 수있다. 흥미로운 옵션은 야생형 본질적까지 그대로 배경에 알파 - 시누 클레인 섬유소의 prionoid 행동에 대한 평가를 할 수있는 유전자로 루시 페라만을 표현하는 쥐 (+/- GFAP의 -luc) 단일 유전자의 Tg의 사용이다 알파 시누 클레인은 14 관한 것이다. 게다가, 이러한 Tg를 (SOD1 G93A) 근 위축성 측삭 경화증 또는 (TG APP23) m에 마우스와 같은 다른 트랜스 제닉 마우스에의 Tg (GFAP의 -luc +/-) 마우스 건너알츠하이머 병에 대한 얼음, 23, 다른 질병 모델 (22)에 신경 염증의 이미징을 할 수 있습니다.
이 프로토콜의 제한은 주사 부위에 기초하여 주사 접종이 특정 양을 초과 할 수 있다는 것이다. 따라서, 혀에 주사 만 CNS에 전송 시간에 영향을 미칠 수있는 복막으로 이들보다 작은 볼륨으로 수행 될 수있다. 또 다른 한계는 GFAP -luc 유전자 만 아니라 신경 염증에 마찬가지로 중요 microgliosis의 astrogliosis 검출 할 수 있다는 점이다. 마지막으로,이 모델은 알파 - 시누 클레인 prionoids은 복강 내 주사 후 중추 신경계에 도달하는 방법에 관한 통찰력을 제공하지 않습니다.
주입을 통해 외인성의 α- 시누 클레인의 prionoids의 적용 synuclei recapitulating의 특성에 중요한 역할을하는 전송 경로를 연구하는 유용한 방법으로 밝혀졌다nopathies. 동물 모델에 재조합 알파 - 시누 클레인 원 섬유 또는 질병 관련 마우스 또는 인간 알파 - 시누 클레인 종의 뇌내 주사 시간 5, 7, 17, 24, 25, 26 일에 걸쳐 파종 특성 및 전송 효율을 분석하기 위해 여러 연구에 사용되었다. 뇌에 정위 주사는 항상 수술 직후 로컬 염증 반응을 유도하기 때문에,이 전송 경로가 확산 뇌 항상성의 변화에 의한 접종의 감염에 영향을 미칠 수 있습니다. 최근의 연구는 주로 수술을 피하기 위해 오히려 CNS에 neuroinvasion 공동 수있는 곳에서 초기 지점으로, 주변, 장벽, 골격근, 또는 혈액을 분석하지, 주변 또는 전신 응용 프로그램에 초점을 변경 한mmence 6, 9, 14, 27. 프리온 것이 복막을 통해 그 송신을 도시 한 내용이나 혀 neuroinvasion 및 신경 학적 질환을 초래; 혀 감염 후 뇌에서 설하 핵에만 2 주 이내에 확산 프리온은 11 줄기. 알파 시누 클레인은 프리온 등 neuroinvasive 시드 및 특성을 갖는 것으로 설명 되었기 때문에, 우리는 혀 및 복막을 통한 전송이 CNS 14 침공의 α- 시누 클레인의 prionoids 대한 상기 입구 지점을 나타내는 것으로 나타났다. 생물 발광 이미징에 의해 정량 astrogliosis 시간 동안 신경 염증성 과정의 추적을 용이하게하고 조직 학적 분석에 비 침습적 대안을 나타낸다.
중추 신경계는 알파 - 시누 클레인의 prionoids의 neuroinvasion에 응답하는 방법에 대한 깊은 통찰력을 얻으려면및 신경 염증의 원인이 다른 치료에, 또한 미세 아교 세포에서의 단백질 발현에 특이 프로모터로부터 루시 페라 제 발현을 구동하는 유전자와 microgliosis의 비 침습적 모니터링, 예를 허용 마우스 모델을 생성하는 데 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 올가 샤르마, 테레사 헌트 및 기술 지원에 대한 DZNE 현미경과 동물 시설의 직원을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
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