Summary
Периферийные инъекции альфа-синуклеина фибрилл в брюшину или языком Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей, которые экспрессируют человеческий альфа-синуклеина с наследственной мутации A53T и люциферазы светлячка, может вызвать невропатологии, в том числе нейровоспаления , в их центральной нервной системе.
Abstract
Для изучения прионов, как поведение неправильно свернутых альфа-синуклеина, мышиные модели необходимы, что позволяет быстро и просто передавать альфа-синуклеина prionoids, которые вызывают невропатологии в пределах центральной нервной системы (ЦНС). Здесь мы описываем , что intraglossal или внутрибрюшинную инъекцию альфа-синуклеина фибрилл в bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей, которым гиперэкспрессией человеческий альфа-синуклеина с мутацией A53T от промотора прионного белка и люциферазы светлячка из промотор для глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP), является достаточным , чтобы вызвать заболевание нейропатологического. По сравнению с гомозиготной Tg (M83 + / +) мышей , которые развиваются тяжелые неврологические симптомы , начиная в возрасте 8 месяцев, гетерозиготных Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) животные остаются свободными от спонтанного заболевания , пока они не достигнут возраст 22 месяцев. Интересно, что инъекция альфа-синуклеина фибрилл через intraperitoneаль маршрут индуцированное неврологическое заболевание с параличами в четырех из пяти Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей со средним временем инкубации 229 ± 17 дней. Пораженные животные показали серьезные отложения фосфорилированного альфа-синуклеина в мозге и спинном мозге. Скопление альфа-синуклеин было саркозили-нерастворимым и локализуется с убиквитиным и p62, и сопровождался воспалительной реакция, в результате чего астроцитов глиоза и microgliosis. Удивительно, но инокуляция альфа-синуклеина фибрилл в язык был менее эффективен в возникновении болезни только с одним из пяти инъецированных животных с альфа-синуклеина патологии после 285 дней. Наши результаты показывают , что прививка через intraglossal маршрута и тем более через внутрибрюшинно подходит для индукции неврологического заболевания с соответствующим клеймом синуклеинопатий в Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей. Это дает новую модель для изучения прионов-как патогенез индуцируютd с помощью альфа-синуклеина prionoids более подробно.
Introduction
Существует все больше доказательств того, что альфа-синуклеин имеет характеристики, которые аналогичны прионный белок, в частности, в его способности к самостоятельным семенам и распространяющихся неправильному фолдинг между клетками и вдоль нервными путями. Это свойство альфа-синуклеина также упоминается как «прионов типа» или «prionoid», и подтверждается наблюдениями в трансплантации экспериментов, которые предполагают трансмиссивности неправильно свернутых альфа-синуклеина из пораженных нейронов вновь пересаженные здоровые нейроны 1, 2 , 3, 4. Кроме того, прямая инъекция альфа-неправильно свернутых синуклеина в мозг или на периферии, например, мышцы задних конечностей или кишечной стенки, приводит к распространению альфа-синуклеина патологии в дистальных отделах ЦНС 5, 6, 7, <SUP класс = "Xref"> 8, 9, 10. Мы проанализировали передачу альфа-синуклеина prionoids через периферийных маршрутов более подробно рассмотрены на вопрос, может ли неправильно уложенный альфа-синуклеина neuroinvade ЦНС после однократного intraglossal или внутрибрюшинного введения, функцию, которая ранее была показана для прионов, но не для неправильно свернутых альфа- синуклеин. После инъекции прионов в язык, neuroinvasion ЦНС достигается с помощью распространения вдоль подъязычного нерва языка , что приводит к ядру подъязычного нерва, который расположен в стволе головного мозга 11. В мышиной модели мы выбрали Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей , которые сверхэкспрессируют A53T мутант человеческого альфа-синуклеина от промотора приона и люциферазы светлячка под контролем промотора GFAP астроцитов , чтобы контролировать активацию биолюминесценции, как ранее показано, в головном мозгеприон-инфицированных мышей 12. В наших руках bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей не развивается болезнь до 23 месяцев , как было показано , другие 13. Однократное введение альфа-синуклеина фибрилл человека через intraglossal или внутрибрюшинно индуцированных заболеваний неврологического с патологией в головном мозге и спинном мозге Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей , поддерживающих гипотезу о том, что альфа-синуклеина prionoids делиться важными характеристиками с прионов 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, включая животных, были проведены с одобрения комитета защиты животных Северного Рейна-Вестфалии Государственного агентства по окружающей среде (LANUV). Животных содержали и уход в соответствии со стандартными условиями с 12 ч цикл свет / темнота и свободный доступ к пище и воде.
1. Модель животных
- Интеркросс гемизиготный Тд (GFAP -luc +/-) мышей с гемизиготным Тдом (М83 +/-) мышеем генерировать гемизиготную bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей 15, 16.
- Генотип потомства с ПЦР в реальном времени на наличие кодирующего трансген человеческого альфа-синуклеина и со стандартной ПЦР для люциферазы светлячка 12, 17.
- Привить животное в возрасте от шести до восьми недель.
2. Приготовление инокулята
- Приготовьте моnomeric рекомбинантный человеческий альфа-синуклеина с мутацией A53T в трис-буферный солевой раствор (TBS) буфере , содержащем 150 мМ NaCl в 20 мМ Трис-HCl (рН 7,2) , как было описано ранее 14.
- Подготовьте фибриллярный альфа-синуклеина для прививок путем взбалтывания 3 мкг / мкл мономерного рекомбинантного человеческого альфа-синуклеина в орбитальном шейкере со скоростью 800 оборотов в минуту и 37 ° С в течение 5 дней.
- Развести фибрилл сборки в фосфатно-солевом буфере (PBS), чтобы достичь конечной концентрации 1 мкг / мкл для внутрибрюшинных или 2 мкг / мкл для intraglossal прививок.
- Фрагмент альфа-синуклеина фибриллы с ультразвуковую стержня в течение 1 мин (40 импульсов длительностью 0,5 с с одной секунды паузы между каждым импульсом и амплитудой, установленной на 50%) на льду. Для того, чтобы избежать загрязнения путем перекрестного посева. Используйте чистые зонды обработки ультразвука для подготовки различного инокулята.
3. Intraglossal Инъекции
- Обезболить животных с intraperitoneal инъекции 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина. Зажмите палец ноги животного и подтвердить, что он не отказывается от своей задней конечности для обеспечения надлежащей анестезии. Используйте ветеринарную мазь на глаза животного, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
- Устранить наркотизированные животное тщательно с помощью клейкой ленты на нагревательную пластину в дорсальном лежачем положении с их головами, обращенных к следователю.
- Заполните 27 G одноразового шприца для подкожных инъекций с 5 мкл альфа-обработанных ультразвуком фибрилл или синуклеиновых PBS.
- Используйте один тупой нос анатомического пинцета с зазубренными наконечниками, чтобы держать открытым рот животного, а второй меньше пары щипцов осторожно вытащить язык, чтобы сделать нижнюю часть языка доступна для инъекций.
- Вводят иглу шприца в правую или левую сторону нижней части языка в непосредственной близости от подъязычного нерва. Медленно вводят прививочный через 5 с. Медленно отведите иглу через 5 с, чтобы гарантировать, что инокулятпроникла в ткань и не теряется в то время втягивания иглы.
- Освободить животное от его фиксаций и оставить его на нагревательной плите под постоянным контролем до полного выздоровления.
4. внутрибрюшинных инъекций
- Для внутрибрюшинных инъекций, наркотизировать животное вскоре в камере анестезии путем ингаляции с изофлураном / кислородом с использованием скорости потока 2 л / мин и испарителя установлен на 2%. Зажмите палец ноги животного и подтвердить, что он не отказывается от своей задней конечности для обеспечения надлежащей анестезии.
- Заполните 27 G одноразового использования шприц с 50 мкл альфа-обработанных ультразвуком фибрилл или синуклеиновых PBS.
- Непосредственно вводят в брюшину мыши и избегать проникновения в тонкую кишку или слепую кишку, расположенную позади передней брюшной стенки, удерживая животное в дорсальном положении с головой, обращенной в сторону от исследователя и вниз при приблизительно 45 °. Монитор животных, пока они не восстановилисьот наркоза.
5. биолюминесценции изображений
- Изображение Тд (М83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей каждые 2-4 недель с использованием системы биолюминесценции визуализации.
- До начала формирования изображения в скором времени анестезию мышей в камере изофлуран / кислород с расходом 2 л / мин и испарителем, установленным на 2%. Зажмите палец ноги животного и подтвердить, что он не отказывается от своей задней конечности для обеспечения надлежащей анестезии.
- Бритье и депилировать головы мышей с депиляции кремом. Цвет ушей в черном с не раздражающим маркером, чтобы блокировать неспецифические биолюминесценции.
- Развести D-люциферин соль калия, субстрат люциферазы, в PBS до 30 мг / маточного раствора мл. Хранить это в 1 мл аликвот при -20 ° C. Защита растворенного D-люциферин от воздействия света.
- Взвешивание животных перед инъекцией. Вычислить точный объем D-люциферин для инъекции 150 мг / кг массы тела. Внутрибрюшинно вводят D-luciferin и вернуть животное к анестезии камеры.
- Запустите программное обеспечение визуализации. После того, как система формирования изображения достигла рабочей температуры инициализации системы, нажав на кнопку «ИНИЦИАЛИЗИРУЙТЕ» в панели управления.
- Выберите кнопок «люминесцентный» и «Фотография». Установите время экспозиции до 60 секунд, в биннинга к «Medium», на F / Stop на «1», и усиление ЭМ в «Off».
- Убедитесь, что фильтр возбуждения установлен в «Block» и фильтр эмиссии в «открытом», и установить предмет высоту до 1,50 см.
- Через десять минут после инъекции с D-люциферином, поместить животное на нагревательной пластину в камере формирования изображения, и гарантировать, что их морды расположены правильно на выходе анестезии. Закройте поток изофлурана / кислород из ингаляционной камеры и открыть поток для изображения камеры с расходом 0,25 л / мин и испарением 2%. Закройте дверцу камеры изображения прoperly.
- Нажмите на кнопку «Acquire» для измерения биолюминесценции, которая занимает 60 сек. Остановить поток изофлурана и следить за животными, пока они не полностью восстановились после возвращения их обратно в их клетки.
- Используйте программное обеспечение визуализации для количественной оценки биолюминесценции. В «Палитре» выберите «Инструменты» ROI. В разделе «Тип» в рамках «ROI Tools» выберите пункт «Измерение ROI».
- В «ROI Tools» нажмите на «круг» инструмент и выбрать количество трансформирования, чтобы извлечь из выпадающего меню - в идеале «3» для трех мышей.
- В изображении, щелкните правой кнопкой мыши каждый ROI и в разделе «Свойства» отрегулировать ширину и высоту до 1,25 см. Расположите каждый ROI над областью мозга, которая количественно.
- В верхней левой части изображения, установить панель единиц, чтобы «излучения (фотонов)».
- В «Палитре», выберите «Настройка изображения» и настроить минимальное имаксимум «Цветовая гамма», к примеру, от 0.20e6 к 1.00e6.
- В разделе «Файл» сохранить данные с «Сохранить».
6. Биохимический анализ
- Изолировать мозги и спинного мозга в соответствии с установленными протоколами 18, 19.
- Однородный весь мозг и целые образцы спинного мозга отдельно в PBS в присутствии протеазы и фосфатазы ингибиторов (разбавленного до 1 раза в PBS) в течение двух циклов 30 сек с 6000 оборотов в минуту в гомогенизаторе тканей. Убедитесь, что мозг и образцы спинного мозга гомогенизируют до конечной концентрации 20% (вес / объем).
- Разрушать ультразвуком образцов в два раза при сохранении их на льду с постоянным импульсом 10 с и амплитудой, установленной на 50%.
- Регулировка гомогенатах до 10% в PBS и 750 мМ NaCl путем разбавления их 1: 1 с 1,5 М NaCl в PBS.
- Для отделения клеточного дебриса, центрифугирование гомогената при 1000 х г в течение 5 мин при4 ° С. Держи супернатант для последующих шагов и отбросить гранулы.
- Измерение концентрации белка в гомогенатах с использованием анализа бицинхониновой кислоты (ВСА) в соответствии с инструкциями изготовителя. Инкубируйте 1,0 мг общего белка из гомогената мозга или 0,8 мг из спинного мозга в гомогенатах N-laurylsarcosyl при конечной концентрации 10% (вес / объем) в течение 15 мин на льду.
- Перекрытие гомогенат на подушку сахарозы 3 мл 10% (вес / объем) в дистиллированной воде и ультрацентрифуга их на 465000 х г в течение 1 ч при 4 ° С.
- Ресуспендируют гранул в буфере, содержащем 4% додецилсульфата натрия (SDS), 2% & beta; меркаптоэтанола, 192 мМ глицин, 25 мМ Трис и 5% (вес / объем) сахарозы.
- Кипение образцов при 100 ° С в течение 5 мин и загружать их на SDS-полиакриламидном геле для электрофореза в буферной системе morpholineethanesulfonic кислоты (MES).
- Передача разделенных белков на поливинилидендифторидную (PVDF) мембраны в РЭМidry промокательной системы.
- Инкубируйте мембраны в 0,4% (объем / объем) раствора формалина в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре на роторе с 35 оборотов в минуту для сшивания белков с мембраной.
- Блок мембраны в TBS буфере, содержащем 0,05% (об / об) Tween 20 и 5% (вес / объем) молока в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубируйте блоттинга с первичным антителом в блокирующем буфере в течение ночи при 4 ° С.
- Промыть мембраны три раза в буфере TBS и инкубировать их с пероксидазой или флуорофором конъюгированного с вторичными антителами в TBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Визуализация связанных вторичных антител с помощью хемилюминесценции или флуоресценции в соответствии с установленными протоколами 20.
7. Анализ Иммунофлуоресценции
- Обезвоживает расчлененный мозги и спинной мозг в обработке ткани станции и внедрение их в парафин с использованием парафиновой станции.
- Вырезать залитых парафином ТИСсудится с микротомом в толстых корональных секциях 8 мкм и смонтировать разделы на стеклах.
- Deparaffinize срезов тканей пути инкубации их в двух отдельных ксилоле ванн от 5 до 10 мин и регидратация их через серию ванн градуированного этанола (100%, 90%, 70%, 50%) и , наконец, H 2 O.
- Инкубируйте разделы в 0,01 М цитратного буфера (рН 6,0) в течение 5 мин при комнатной температуре и дополнительно сварить их в течение 10 мин в микроволновой печи.
- Пусть секции остыть до комнатной температуры и инкубировать их с 3% -ным раствором перекиси водорода в течение 30 мин для ингибирования эндогенных пероксидаз.
- Блок срезах тканей путем инкубации с 20% (об / об) нормальной козьей сыворотки, 1% (об / об) альбумина бычьей сыворотки (BSA) и 0,5% Тритон Х-100 в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубируйте участки с первичным антителом, разведенным в 1% (об / об) нормальной козьей сыворотки, 1% (об / об) БСА и 0,25% Тритон в PBS Х-100 в течение ночи при 4 ° С. <литий> Промыть секции в два раза с 0,25% (объем / объем) Triton X-100 в PBS и один раз с PBS.
- Пятно секции с соответствующими флуорофором-конъюгированного вторичными антителами и DAPI ядерной красителя, разведенного в 1% (об / об) нормальной козьей сыворотки, 1% (об / об) BSA и PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
- После промывки дважды с 0,25% (объем / объем) Triton X-100 в PBS и один раз с PBS, покровное слайды с вложения средств массовой информации и визуализировать окрашивание с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Периферийные инъекции альфа-синуклеина prionoids с помощью языка или брюшины индуцированной невропатологии в ЦНС bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей (таблица 1 и рисунок 1). После однократного внутрибрюшинного введения с альфа-синуклеина фибрилл, четыре из пяти мышей разработаны неврологическое заболевание со средним временем инкубации 229 ± 17 дней. Удивительно, но только один из пяти мышей развилась болезнь центральной нервной системы после того, как intraglossal инъекции с альфа-синуклеина фибрилл после 285 дней. Заражение PBS не вызывают заболевания в течение 420-дневного периода эксперимента.
Биохимический анализ с помощью Вестерн-блоттинга и зондированием с фосфо-специфические антитела против EP1536Y Ser129 альфа-синуклеина показал, что для обоих путей передачи заболевших животных было накоплено агрегаты фосфорилируется и саркозила-insoluble альфа-синуклеина в мозге и спинном мозге (Таблица 2 и Рисунок 2). В противоположность этому, мозг и спинной мозг ФБФР-инъецированных и не заболевших животных содержали только мономерные виды фосфорилированного альфа-синуклеина.
Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов головного мозга внутрибрюшинна и пораженный мышей с фосфо-специфического pSyn # 64 антителом показало широкое распространение фосфорилированных отложений альфа-синуклеина по всему ЦНСУ (Таблица 2 и фиг.3). Кроме того, фосфорилируется альфа-синуклеин отложение локализуется с убиквитиной и P62, указывающей аберрантных белком гомеостазом, которые могут способствовать образованию отложений.
Накопление альфа-синуклеина агрегатов в больных животных сопровождалось нейровоспалительных изменений, был обнаружениммунофлуоресценции окрашивание на GFAP, маркер астроцитов , который может выявить реактивный астроглиоз (рисунок 4). Кроме того, активированные микроглии были также обнаружены в районах с обильным альфа-синуклеина патологии методом иммунофлуоресценции окрашивания для IBA-1 (ионизируется кальций-связывающий адаптер молекулы 1). В соответствии, визуализация биолюминесценции показали увеличение сияния (> 2 × 10 6 р / с / см 2 / ср) , излучаемый из мозга Tg (М83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей , которым вводили альфа-синуклеина фибрилл, незадолго до того, что они развились признаки неврологического заболевания. В отличие от этого, мозг мышей, которым вводили PBS не показали увеличение сиянием. Увеличение сияние указует реактивный астроглиоз, отличительная черта нейровоспаления, так как экспрессия люциферазы приводится в движении от промотора GFAP.
Рисунок 1: Инъекции с альфа-синуклеина фибрилл через внутрибрюшинном или intraglossal маршрута вызывает заболевание в bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей. (А) Электронная микрофотография ультразвуком рекомбинантного человеческого альфа-синуклеина фибрилл , которые были внутрибрюшинно и intraglossally вводили мышам. Отрицательное окрашивание уранилацетата показало несколько кластеров коротких, палочковидные агрегатов. Шкала бар = 100 нм. Кривые выживаемости (В) Каплана-Мейера показывают , что после внутрибрюшинного введения с альфа-синуклеина фибрилл четырех из пяти Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мыши развивали неврологическое заболевание в 229 ± 17 дней (фиолетовый заштрихованные квадраты), в то время как ни один из ПБС-инъецированных мышей контрольной группы не развились признаки неврологической дисфункции в течение 420 дней (фиолетовые открытые квадраты). После intraglossal прививки с альфа-синуклеина фибрилл одна мышь из пяти умер после 285 дней (зеленыйзакрытые кружки). В противоположность этому, ни один из ПБС-инъецированных мышей контрольной группы не развилась неврологическое заболевание или спонтанно умерли (зеленые открытые кружки). Модифицированный из Breid и соавт. , 2016 14. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Биохимический анализ фосфорилированного альфа-синуклеина в ЦНС периферически вводили Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей. (А) иммуноблоттинг с антителом EP1536Y, распознавания фосфорилирование по Ser129 альфа-синуклеина, показал , что внутрибрюшинно вводили мышам и больных накопленное видов с высокой молекулярной массой из саркозила нерастворимых агрегатов фосфорилированного альфа-синуклеина в мозгег спинной мозг. Контрольные мыши опротестовали PBS не скапливались агрегаты фосфорилирования альфа-синуклеина и показал полосы только для мономерной формы. (B) После intraglossal вызов с альфа-синуклеина фибрилл только одна мышь, животных 121, показали саркозила-нерастворимые агрегаты фосфорилированного альфа-синуклеина в своем головном и спинном мозге, тогда как все другие intraglossally инокулированных мышей оставались здоровыми без отложений альфа-синуклеина. Молекулярные массы показаны в кД. Пример загрузки в каждой полосе показано обнаружение актина. Модифицированный из Breid и соавт. , 2016 14. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Анализ иммунофлуоресценции показывает , что депозитыфосфорилированный альфа-синуклеин колокализуется с убиквитиным и p62 в головном мозге и спинном мозге больного Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей. Со-окрашивание фосфорилированного альфа-синуклеина, обнаруживается с EP1536Y антителом, и убиквитин показали четкую колокализацию в головном мозге, как это наблюдалось в ядра таламуса (A), и спинной мозг, так как обнаружено в сером веществе (В), из больной мышей после внутрибрюшинного заражения альфа-синуклеин фибрилл. Точно так же, фосфорилируется альфа-синуклеина, обнаружено с антителом pSyn # 64, также локализуется с p62 в головном мозге (С) и спинного мозга (D) больных животных. ( От А до D) PBS-инъекции здоровых контрольных животных не показали депозиты или колокализацию для любого из этих белков. Ядерное окрашивание DAPI показаны синим цветом. Шкала бар = 20 мкм. Модифицированный из Breid и соавт. , 2016 14. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Тд (М83 +/-: GFAP -luc +/-) мыши развивали глиоз после периферического вызова с альфа-синуклеин фибриллами. (А) Анализ Иммунофлуоресценции участков мозга больных животными с антителами против GFAP, маркера астроцитов, показал реактивный астроглиоз в районах с месторождениями фосфорилированного альфа-синуклеин, которые были обнаружены в стволе мозга с pSyn # 64 антителом. В противоположность этому, не было никакого реактивного астроглиоз в мозге ПБС-инъецированных мышей контрольной группы. (В) Аналогичным образом , окрашивание с антителами к IBA-1, маркер микроглии, продемонстрировал microgliosisв районах с депозитами фосфорилирования альфа-синуклеина в больных животных. Мозги здорового, PBS-инжектированного контрольный мышей не показали признаки microgliosis. (С) биолюминесценцией изображения показали повышенный блеск от головного мозга и спинного мозга от Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей внутрибрюшинно вводил альфа-синуклеин фибрилл (левая панель), которое было вызвано активацией астроцитов , незадолго до того, как у мышей развились симптомы неврологического. В головном мозге и спинном мозге ПБС-инъецированных мышей контрольной группы базальный свечение не увеличивалось с течением времени (справа). После того, как intraglossal инокуляции с альфа-синуклеина фибрилл, один Тд (М83 +/-: GFAP -luc +/-) мыши, животных 121, показали признаки реактивного астроглиоза незадолго до этого умер в 285 дней (центральная панель). (D) , после внутрибрюшинного вызова Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей с альфа-синуклеина фибриллы, increaSED уровни биолюминесценции (> 2 × 10 6 р / с / см 2 / ср) были измерены из мозга четырех мышей (синий, зеленый, коричневый и оранжевые кружки) несколько недель , прежде чем они развитые неврологические признаки болезни. Один из пяти животных также показали повышенные уровни биолюминесценции незадолго до этого умер 285 дней после инъекции intraglossal с альфа-синуклеина фибрилл (пурпурные кружки). В противоположность этому , для здоровых, ПБС-инъецированных мышей контрольной группы (черные кружки; Столбики ошибок показывают SD [п = 4]) и одно животное , которое не развивалась болезнь после внутрибрюшинного введения с альфа-синуклеина фибрилл (красные кружки), сигнал биолюминесценции оставался ниже порогового значения 2 × 10 6 р / с / см 2 / стер в течение периода наблюдения. Шкала бар = 20 мкм. Модифицированный из Breid и соавт. , 2016 14. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этогофигура.
| линия мыши | Инокулята (мкг) | Прививка маршрут | Количество мышей с болезнью / нет. мышей инокулировали | Среднее время выживания ± SD (дней) |
| Тд (М83 +/-: GFAP -luc +/-) | альфа-синуклеина фибриллы человека (50) | внутрибрюшинный | 4/5 | 229 ± 17/420 |
| Тд (М83 +/-: GFAP -luc +/-) | PBS | внутрибрюшинный | 0/5 | 0/420 |
| Тд (М83 +/-: GFAP -luc +/-) | альфа-синуклеина фибриллы человека (10) | intraglossal | 1/5 | 285/420 |
| Тд (М83 +/-: GFAP -luc +/-) | PBS | intraglossal | 0/4 0/420 |
Таблица 1: инокуляции эксперименты. * Модифицированный из Breid и др., 2016 14
| Задача [антитела клон] | хозяин | Иммуноген | Разбавление в IF | Разбавление в ВБ |
| Актина [С4] | мышь | - | - | 1: 1000 |
| α-синуклеина, фосфо S129 [pSyn # 64] | мышь | pSer129 | 1: 1200 | - |
| α-синуклеина, фосфо S129 [EP1536Y] | Кролик | pSer129 | 1: 100 | 1: 1000 |
| Глиальные фибриллярный кислый белок (GFAP) | Кролик | - | 1: 200 | - |
| IBA-1 | Кролик | - | 1: 500 | - |
| Sequestosome-1 (P62) | Кролик | - | 1: 100 | - |
| Убиквитин [Ubi-1] | мышь | - | 1: 500 | - |
Таблица 2: Антитела , используемые для иммунофлуоресценции (ИФ) и Вестерн - блоттинга (ВБ). * Модифицированный из Breid и др., 2016 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Периферийные инъекции альфа-синуклеина фибрилл в брюшину Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей представляет собой метод , легкое , чтобы вызвать неврологическое заболевание , сопровождающееся нейровоспаления резюмировать важные характеристики синуклеинопатий. Аналогичным образом, инъекции язык представляет собой еще один маршрут для neuroinvasion альфа-синуклеина prionoids у трансгенных мышей, но менее эффективна. Мы решили прекратить наши эксперименты в 420 дней после инъекции, и мы не можем исключить возможность того, что более или все фибрилл вводили мышам, возможно, развилась болезнь на более позднем этапе. Кроме того, использование Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей позволяет неинвазивной визуализации астроглиоза и представляет собой простой способ мониторинга воспалительных реакций , вызванных neuroinvasion альфа-синуклеина в течение всего срока службы мышь.
Важным шагом является подготовкаинокулята. Казался бы , тривиальные факторы , такие как время агрегации, время обработки ультразвука, обилие эндотоксинов, или количество фибрилл , используемым для инъекций могут повлиять на результатах эксперимента путем воздействия на высев склонности альфа-неправильно свернутого синуклеин 21. Таким образом, важно всегда использовать одни и те же условия, при приготовлении инокулята для инъекций. Для intraglossal инъекций он должен считать, что не только подъязычный нерв, но и другие черепно-мозговые нервы, как языкоглоточный нерв иннервируют язык и может быть вовлечен в интернейронном транспорте альфа-синуклеин prionoids в мозг. Таким образом, предназначенные для различных областей языка может привести к различным распространяющимся кинетикам в мозг. Мы не сразу вводить в подъязычный нерв и вполне возможно, что нацеливание подъязычного нерва может улучшить передачу ЦНСА альфа-синуклеин prionoids. Для внутрибрюшинных инъекций с альфа-синуклеина фибрилл это critiкал, что прививочный правильно вводили в брюшину и не случайно во внутренние органы, как кишечник или слепую кишку, что может негативно повлиять на neuroinvasion. Это также важно для визуализации биолюминесценции при введении D-люциферина. Mistargeting из D-люциферина внутренних органов может замедлить его распространение в мозг и приводит к снижению биолюминесценции. Для того, чтобы получить однородные результаты во время съемки важно также, чтобы всегда свеже подготовить D-люциферин раствора перед инъекцией и позволить ей точно инкубировать в течение 10 мин после внутрибрюшинного введения до визуализации.
Биолюминесценции изображения являются полезным методом неинвазивны изменениям меры в астроглиоза с течением времени и могут быть применены не только после внутрибрюшинной или intraglossal инъекций, но и после каждого вида обработки, включая, например, внутримозговой или внутривенные инъекции. Для того, чтобы контролировать распространение альфа-синуклеина prionoids от периферии к CNS и последующего нейровоспаления мы использовали bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) мышей. Поскольку гемизиготная экспрессия альфа-синуклеин у этих животных на 40% ниже по сравнению с гомозиготными животными , которых они остаются свободными от спонтанного заболевания в течение до 22 месяцев возраста и имеют подходящий генетический фон для передачи альфа-синуклеин изучает 13. Однако, изменения, касающиеся выбора модели мыши для визуализации биолюминесценции может быть желательным. Интересным вариантом является использование моногенной Тд (GFAP -luc +/-) мышей , экспрессирующих только люциферазы в качестве трансгена, что позволяет провести оценку prionoid поведения альфа-синуклеина фибрилл на фоне , который является по существу дикого типа, насколько альфа-синуклеина обеспокоен 14. Кроме того, пересекая Тд (GFAP -luc +/-) мышей для других трансгенных мышей, таких как Tg (SOD1 G93A) мышей для бокового амиотрофического склероза или к Tg (APP23) млед для болезни Альцгеймера, позволяет визуализацию нейровоспаления в других моделях болезни 22, 23.
Ограничение этого протокола является то, что основано на месте инъекции вводили инокулят не может превышать определенный объем. Таким образом, инъекции в языке может быть выполнена только с меньшими объемами, чем те, в брюшину, которые могут повлиять на время передачи в ЦНС. Другим ограничением является то , что -luc трансген GFAP допускает только обнаружение астроглиоза но не microgliosis, что не менее важно в нейровоспаления. И, наконец, эта модель не дает представление о том, как альфа-синуклеине prionoids достигает ЦНС после внутрибрюшинного введения.
Применение экзогенных prionoids альфа-синуклеин через инъекцию, как было показано, чтобы быть полезным методом для изучения путей передачи, которые играют критическую роль в перепросмотре характеристики synucleinopathies. Внутримозговые инъекции рекомбинантных альфа-синуклеина фибрилл или ассоциированной с заболеванием мыши или человека альфа-синуклеина видов в моделях на животных, были использованы в ряде исследований , чтобы проанализировать их свойства Посевная и эффективность передачи с течением времени 5, 7, 17, 24, 25, 26. Поскольку Стереотаксические инъекции в мозг всегда вызывают местную воспалительную реакцию вскоре после операции, этот путь передачи может влиять на распространение и инфекционность инокулята, вызванное изменением гомеостаза мозга. Более поздние исследования изменили фокус на периферийные или системные приложения, а не в первую очередь, чтобы избежать хирургическую процедуры, а скорее проанализировать периферию, стенку кишечника, скелетные мышцы, или кровь, в качестве начальной точки, где neuroinvasion в ЦНС может взаимодействоватьmmence 6, 9, 14, 27. Для прионов было показано, что передача через брюшину или язык приводит к neuroinvasion и неврологических заболеваний; после заражения языка, прионы распространяются в течение всего двух недель до подъязычного ядра в головном мозге стволовые 11. Так как альфа-синуклеина было обсуждено , чтобы иметь Нейроинвазивные и посевные свойства , такие как прионы, мы показали , что передача через язык и брюшины представляют собой дополнительные входные точки для альфа-синуклеина prionoids вторжения в ЦНС 14. Количественный астроглиоз путем визуализации биолюминесценции облегчает отслеживание процесса нейровоспалительного с течением времени и представляет собой неинвазивную альтернативу гистологического анализа.
Для того, чтобы получить более глубокое понимание того, как центральная нервная система реагирует на neuroinvasion альфа-синуклеина prionoidsи на другие виды лечения , которые вызывают нейровоспаления, было бы полезно , чтобы генерировать модели мыши , которые также позволяют неинвазивного мониторинга microgliosis, например , с трансгена , который управляет экспрессией люциферазы из промотора , специфического для экспрессии белка в микроглии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Ольгу Шарма, Тереса Хандт, и персонал микроскопии и животных объектов DZNE для технической поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
