Summary
Injection périphérique de fibrilles d'alpha-synucléine dans le péritoine ou de la langue de Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) des souris qui expriment l' alpha-synucléine humaine avec la mutation A53T familiale et la luciférase de luciole, peut induire une neuropathologie, y compris la neuroinflammation , dans leur système nerveux central.
Abstract
Pour étudier le comportement de prion de l'alpha-synucléine mal repliées, les modèles de souris sont nécessaires qui permettent une transmission rapide et simple de prionoids alpha-synucléine, qui provoquent neuropathologie dans le système nerveux central (SNC). Nous décrivons ici que intraglossal ou injection intrapéritonéale de fibrilles de l' alpha-synucléine dans Tg bigéniques (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) chez la souris, qui surexpriment l' alpha-synucléine humaine avec la mutation A53T à partir du promoteur de la protéine prion et de la luciférase de luciole le promoteur de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), est suffisante pour induire une maladie neuropathologique. Par rapport à Tg homozygote (M83 + / +) de souris qui développent des symptômes neurologiques sévères commençant à l'âge de 8 mois, Tg hétérozygote (+/- M83: GFAP -Luc +/-) les animaux restent indemnes de la maladie spontanée jusqu'à ce qu'ils atteignent un âge de 22 mois. Fait intéressant, l'injection de fibrilles d'alpha-synucléine via le intraperitoneitinéraire al maladie neurologique induite par la paralysie dans quatre des cinq Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) chez la souris avec un temps d'incubation médiane de 229 ± 17 jours. Les animaux malades ont montré des dépôts sévères de l'alpha-synucléine phosphorylée dans leur cerveau et la moelle épinière. L'accumulation d'alpha-synucléine ont été Sarkosyl insolubles et colocalisés avec l'ubiquitine et p62, et étaient accompagnées d'une réaction inflammatoire entraîne une gliose astrocytaire et microgliose. De manière surprenante, l'inoculation de fibrilles alpha-synucléine dans la langue était moins efficace dans la maladie avec seulement l'un des cinq animaux injectés présentant une pathologie alpha-synucléine après 285 jours. Nos résultats montrent que l' inoculation par voie intraglossal et plus encore par la voie intrapéritonéale convient pour induire une maladie neurologique avec caractéristiques pertinentes de synucléinopathies Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) souris. Cela fournit un nouveau modèle pour l'étude de la pathogenèse comme prion induireD par prionoids alpha-synucléine plus en détail.
Introduction
Il existe des preuves de plus en plus que l'alpha-synucléine a des caractéristiques similaires à celles de la protéine prion, en particulier dans sa capacité à se ressème et se propagent entre les cellules et le mauvais repliement le long des voies neuronales. Cette propriété de l' alpha-synucléine est aussi appelée « prion » ou « prionoid », et est soutenu par des observations dans des expériences de transplantation, ce qui suggère la transmissibilité de l' alpha-synucléine mal repliées de neurones malades aux nouveaux neurones sains transplantés 1, 2 , 3, 4. En outre l' injection directe d'alpha-synucléine dans le cerveau mal repliée ou de la périphérie, par exemple , le muscle du membre postérieur ou de la paroi intestinale, conduit à une propagation de la pathologie alpha-synucléine aux parties distales du système nerveux central 5, 6, 7, <classe sup = "xref"> 8, 9, 10. Nous avons analysé la transmission de prionoids alpha-synucléine, par des voies périphériques plus en détail et a abordé la question de savoir si l'alpha-synucléine peut neuroinvade misfolded le système nerveux central après une seule injection intrapéritonéale ou intraglossal, une fonction qui avait été montré précédemment pour prion mais pas pour misfolded alpha- synucléine. Après l' injection des prions dans la langue, neuroinvasion du système nerveux central est réalisée par propagation le long du nerf hypoglosse de la languette qui mène vers le noyau du nerf hypoglosse qui se trouve dans le tronc cérébral 11. En tant que modèle de souris , nous avons choisi Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) des souris qui surexpriment le mutant A53T d'alpha-synucléine humaine à partir du promoteur de prion, et la luciférase de luciole sous le contrôle d'un promoteur GFAP pour surveiller l' activation astrocytaire par bioluminescence, comme indiqué précédemment dans le cerveaudes souris infectées par le prion-12. Dans nos mains Tg bigéniques (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) des souris n'a pas développé la maladie jusqu'à 23 mois comme cela a été démontré par d' autres 13. Une seule injection de fibrilles d'alpha-synucléine de l' homme par voie intrapéritonéale ou intraglossal induite par une maladie neurologique avec la pathologie dans le cerveau et la moelle épinière des Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) des souris soutenant l'hypothèse que prionoids alpha-synucléine importantes caractéristiques avec 14 prion.
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Protocol
Toutes les procédures y compris les animaux ont été effectuées avec l'approbation du comité de protection des animaux de l'Agence de l'environnement du Nord-Westphalie État de Rhénanie (LANUV). Les animaux ont été logés et soignés en fonction des conditions standard avec une 12 h cycle lumière / obscurité et l'accès libre à la nourriture et de l'eau.
1. Modèle animal
- Intercross Tg hémizygotes (GFAP -Luc de +/-) de souris hémizygotes avec Tg (M83 +/-) pour générer des souris Tg hémizygotes bigéniques (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) chez la souris 15, 16.
- Génotype la descendance avec la PCR en temps réel pour la présence du transgène codant pour l' alpha-synucléine humaine et de PCR standard pour la luciférase de luciole 12, 17.
- Inoculer les animaux à l'âge de six à huit semaines.
2. Préparation Inoculum
- préparer moalpha-synucléine humaine recombinante nomeric avec la mutation A53T dans du tampon du tampon Tris salin (TBS) contenant 150 mM de NaCl dans 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) comme cela a été décrit précédemment 14.
- Préparer l'alpha-synucléine fibrillaire pour inoculations en agitant 3 ug / ul d'alpha-synucléine humaine recombinante monomère dans un agitateur orbital à 800 tpm et 37 ° C pendant 5 jours.
- Diluer assemblages de fibrilles dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour atteindre une concentration finale de 1 pg / pl pour intraperitoneale ou 2 ug / ul pour inoculations intraglossal.
- Fragmenter les fibrilles de l'alpha-synucléine avec un sonicateur à tige pendant 1 min (40 impulsions d'une durée de 0,5 avec une pause d'une seconde entre chaque impulsion et une amplitude réglée à 50%) sur de la glace. Pour éviter la contamination croisée par ensemencement. Utiliser des sondes de sonication propres pour préparer un inoculum différent.
3. Injections Intraglossal
- Anesthésier les animaux avec un intrapeinjection ritoneal de 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine. Pincez l'orteil de l'animal et confirmer qu'il ne retire pas sa patte arrière pour assurer une anesthésie appropriée. Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux de l'animal pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Fixer les animaux anesthésiés avec soin avec du ruban adhésif sur une plaque chauffante dans une position couchée dorsale avec leurs têtes tournées vers l'investigateur.
- Remplir une 27 seringue hypodermique jetable G avec 5 ul de fibrilles d'alpha-synucléine ou soniquée PBS.
- Utilisez une pince pouce-nez émoussé avec des pointes en dents de scie pour maintenir la bouche de l'animal ouvert, et une seconde plus petite paire de pinces pour tirer délicatement la langue pour faire la partie inférieure de la langue accessible pour l'injection.
- Injecter l'aiguille de la seringue dans la partie inférieure droite ou gauche de la languette à proximité du nerf hypoglosse. Injecter lentement l'inoculum après 5 s. rétracter lentement l'aiguille après 5 s pour assurer que l'inoculuma pénétré dans le tissu et ne soit pas perdu pendant la rétraction de l'aiguille.
- Libérer l'animal de ses fixations et laissez-le sur la plaque chauffante sous surveillance constante jusqu'à la récupération complète.
4. intrapéritonéale Injections
- Pour les injections intraperitoneales, narcotiser les animaux peu de temps dans une chambre d'anesthésie par inhalation avec de l'isoflurane / oxygène en utilisant un débit de 2 L / min et le vaporisateur fixé à 2%. Pincez l'orteil de l'animal et confirmer qu'il ne retire pas sa patte arrière pour assurer une anesthésie appropriée.
- Remplir une 27 seringue hypodermique jetable G avec 50 ul de fibrilles d'alpha-synucléine ou soniquée PBS.
- Injecter directement dans le péritoine de la souris et éviter la pénétration de l'intestin grêle ou le caecum situé derrière la paroi abdominale en tenant l'animal dans une position dorsale avec la tête tournée à l'opposé de l'investigateur et vers le bas à environ 45 °. Surveiller les animaux jusqu'à ce qu'ils aient récupéréde l'anesthésie.
5. bioluminescence Imaging
- Tg image (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) chez la souris toutes les 2-4 semaines en utilisant un système d'imagerie par bioluminescence.
- Avant imagerie peu anesthésier les souris dans une chambre isoflurane / oxygène avec un débit de 2 L / min et le vaporisateur fixé à 2%. Pincez l'orteil de l'animal et confirmer qu'il ne retire pas sa patte arrière pour assurer une anesthésie appropriée.
- Rasez et épilé les têtes des souris avec une crème épilatoire. Colorer les oreilles en noir avec un marqueur non irritant pour bloquer non spécifique bioluminescence.
- Diluer le sel de potassium de D-luciférine, le substrat de la luciférase, dans du PBS à une solution mère à 30 mg / mL. Conservez ce dans 1 ml aliquotes à -20 ° C. Protéger la D-luciférine dissous de l'exposition à la lumière.
- Peser les animaux avant l'injection. Calculer le volume exact de D-luciférine pour l'injection de 150 mg / kg de poids corporel. Injecter par voie intraperitoneale D-luciferin et retourner l'animal à la chambre d'anesthésie.
- Démarrez le logiciel d'imagerie. Après que le système de formation d'images a atteint sa température de fonctionnement initialiser le système en cliquant sur le bouton « Initialiser » dans le panneau de commande.
- Sélectionnez les boutons de la luminescentes »et « Photo ». Réglez le temps d'exposition à 60 s, le binning à 'moyen', le F / Stop à '1', et le gain EM sur 'Off'.
- Vérifiez que le filtre d'excitation est réglée sur « bloc » et le filtre d'émission pour « Open » et régler la hauteur de l'objet de 1,50 cm.
- Dix minutes après l'injection de D-luciférine, placer les animaux sur la plaque de chauffage dans la chambre d'imagerie et de veiller à ce que leurs museaux sont correctement placés dans la sortie de l'anesthésie. Fermer la isoflurane / débit d'oxygène de la chambre d'inhalation et d'ouvrir l'écoulement de la chambre de formation d'image avec un débit de 0,25 L / min et une évaporation de 2%. Fermer la porte de la chambre d'imagerie properly.
- Cliquez sur le bouton « Acquire » pour mesurer la bioluminescence, qui prend 60 s. Arrêter le flux de isoflurane et de surveiller les animaux jusqu'à ce qu'ils aient complètement récupéré après les retourner à leurs cages.
- Utiliser le logiciel d'imagerie pour quantifier la bioluminescence. Au sein de la « palette d'outils » sélectionner « Outils de retour sur investissement ». Sous « Type » dans les « Outils de retour sur investissement », sélectionnez « ROI Mesure ».
- Dans les « Outils de retour sur investissement » cliquez sur l'outil « cercle » et sélectionnez le nombre de régions d'intérêt à tirer dans le menu déroulant - idéalement « 3 » pour trois souris.
- Dans l'image, cliquez droit sur chaque ROI et sous « Propriétés » ajuster la largeur et la hauteur à 1,25 cm. Placez chaque ROI sur la zone du cerveau qui est quantifié.
- Dans le coin supérieur gauche de l'image, définir le panneau d'unités de « rayonnement (photons) ».
- Au sein de la « palette d'outils », sélectionnez « Réglage de l'image » et régler le minimum etle maximum de la « échelle de couleur », par exemple, de 0.20e6 à 1.00e6.
- Sous « Fichier » enregistrer les données avec « Save ».
6. Analyse Biochemical
- Isoler le cerveau et la moelle épinière selon des protocoles établis 18, 19.
- Homogénéiser ensemble du cerveau et des échantillons de moelle épinière séparément dans du PBS en présence d'inhibiteurs de protease et de phosphatase (dilué dans du PBS à 1x) en deux cycles de 30 s à 6000 tours par minute dans un homogénéisateur de tissus. Assurez-vous que le cerveau et les échantillons de la moelle épinière sont homogénéisés à une concentration finale de 20% (poids / volume).
- Soniquer les échantillons deux fois tout en les maintenant sur la glace avec une impulsion constante de 10 s et une amplitude réglée à 50%.
- Ajuster les homogénats à 10% dans du PBS et 750 mM de NaCl par dilution 1: 1 avec du NaCl 1,5 M dans du PBS.
- Pour séparer les débris cellulaires, centrifuger les broyats à 1000 g pendant 5 min à4 ° C. Gardez les surnageants pour les prochaines étapes et jeter les granulés.
- Mesurer la concentration en protéine dans les homogénats utilisant le dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) selon les instructions du fabricant. Incuber 1,0 mg de protéine totale à partir des homogénats de cerveau ou de 0,8 mg à partir d'homogénats de la moelle épinière dans le n-laurylsarcosyl à une concentration finale de 10% (poids / volume) pendant 15 min sur de la glace.
- Superposer les homogénats sur un coussin de saccharose à 10% (poids / volume) de 3 ml dans de l'eau distillée et les ultracentrifugation à 465000 g pendant 1 h à 4 ° C.
- Remettre en suspension les pastilles dans un tampon contenant 4% de dodécylsulfate de sodium (SDS), 2% β-mercaptoéthanol, 192 mM de glycine, 25 mM de Tris, et 5% (poids / volume) de saccharose.
- Faire bouillir les échantillons à 100 ° C pendant 5 min et les charger sur des gels de SDS-polyacrylamide pour l'électrophorèse dans un système de tampon acide morpholineethanesulfonic (MES).
- Transférer les protéines séparées vers des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF) dans un MEBiDry système buvard.
- Incuber les membranes dans 0,4% (vol / vol) une solution de formaline dans du PBS pendant 30 min à température ambiante sur un rotor à 35 tours par minute pour réticuler les protéines avec la membrane.
- Bloquer les membranes dans du tampon TBS contenant 0,05% (vol / vol) de Tween 20 et 5% (poids / volume) de lait pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber les blots avec l'anticorps primaire dans du tampon de blocage pendant une nuit à 4 ° C.
- Laver les membranes trois fois dans du tampon TBS et de les incuber avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase ou fluorophores dans du TBS pendant 1 h à température ambiante.
- Visualiser les anticorps secondaires liés par chimioluminescence ou fluorescence selon des protocoles établis 20.
7. Analyse de Immunofluorescence
- Déshydrater les cerveaux disséqués et la moelle épinière dans une station de traitement des tissus et de les incorporer dans de la paraffine en utilisant une station de paraffine.
- Couper le tis dans la paraffinepoursuit en justice avec un microtome à 8 um d'épaisseur des coupes coronales et monter les sections sur des lames de verre.
- Déparaffiner les coupes de tissu par incubation dans deux bains de xylol séparés pendant 5 à 10 min et de les réhydrater à travers une série de bains d'éthanol à gradient (100%, 90%, 70%, 50%) et finalement avec H 2 O.
- Incuber les sections dans 0,01 M de tampon citrate (pH 6,0) pendant 5 min à température ambiante et les faire bouillir pendant 10 minutes de plus dans un four à micro-ondes.
- Laissez les sections refroidir à la température ambiante et de les incuber avec une solution de peroxyde d'hydrogène à 3% pendant 30 min pour inhiber les peroxydases endogènes.
- Bloquer les coupes de tissu par incubation avec 20% (vol / vol) de sérum de chèvre normal, 1% (vol / vol) de sérum-albumine bovine (BSA) et 0,5% de Triton X-100 dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber les sections avec l'anticorps primaire dilué dans 1% (vol / vol) de sérum de chèvre normal, 1% (vol / vol) de BSA et 0,25% de Triton X-100 dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C. <li> Laver les sections deux fois avec 0,25% (vol / vol) de Triton X-100 dans du PBS et une fois avec du PBS.
- Colorer les sections avec les anticorps secondaires fluorophores conjugués correspondants et le DAPI colorant nucléaire dilué dans 1% (vol / vol) de sérum de chèvre normal, 1% (vol / vol) de BSA et PBS pendant 1 h à température ambiante.
- Après avoir lavé deux fois avec 0,25% (vol / vol) de Triton X-100 dans du PBS et une fois avec du PBS, les lames couvre-objet avec un support d'encastrement et de visualiser la coloration avec un microscope à balayage laser confocal.
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Representative Results
Injection périphérique de prionoids alpha-synucléine par la langue ou la neuropathologie péritoine induite dans le système nerveux central de Tg bigéniques (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) chez la souris (Tableau 1 et Figure 1). Après une seule injection intraperitoneale avec des fibrilles d'alpha-synucléine, quatre des cinq souris ont développé une maladie neurologique avec un temps d'incubation médiane de 229 ± 17 jours. De façon surprenante, seule l'une des cinq souris ont développé une maladie du système nerveux central après injection intraglossal avec des fibrilles d'alpha-synucléine après 285 jours. Ensemencement avec PBS n'a pas causé la maladie dans le délai de 420 jours de l'expérience.
L'analyse biochimique par Western Blot et en sondant avec l'anticorps phospho-spécifique EP1536Y contre Ser129 de l'alpha-synucléine a révélé que les deux voies de transmission des animaux malades avaient accumulé des agrégats de phosphorylé et sarkosyll' alpha-synucléine -insoluble dans leur cerveau et la moelle épinière (tableau 2 et figure 2). En revanche, le cerveau et la moelle épinière des animaux ayant reçu une injection de PBS et non malades ne contenaient que des espèces monomères d'alpha-synucléine phosphorylée.
La coloration par immunofluorescence de coupes de cerveau de souris injectées par voie intraperitoneale et malades avec le pSyn phospho-spécifique anticorps n ° 64 a révélé une large distribution des dépôts alpha-synucléine phosphorylés dans tout le SNC (Tableau 2 et Figure 3). De plus, les dépôts alpha-synucléine phosphorylée colocalisés avec l'ubiquitine et p62 indiquant une homéostasie protéique aberrant qui pourrait contribuer à la formation de dépôts.
L'accumulation d'agrégats alpha-synucléine chez les animaux malades a été accompagnée par des changements neuro-inflammatoires, qui a été détectée parla coloration par immunofluorescence pour la GFAP, un marqueur des astrocytes qui peuvent révéler astrogliosis réactif (Figure 4). En outre, les microglies activées ont également été trouvés dans les régions présentant une pathologie alpha-synucléine abondante par coloration par immunofluorescence pour IBA-1 (ionisé molécule d'adaptateur de liaison au calcium 1). Conformément, l' imagerie par bioluminescence a révélé une augmentation rayonnement (> 2 × 10 6 p / s / cm 2 / sr) émis par le cerveau de Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) des souris injectées avec des fibrilles d'alpha-synucléine, peu de temps avant qu'ils ont développé des signes de maladie neurologique. En revanche, les cerveaux de souris injectées avec du PBS ne présentaient aucune augmentation de l'éclat. Augmentation de rayonnement est indicative d'astrogliose réactif, une caractéristique de la neuroinflammation, étant donné que l' expression de la luciférase est induite par le promoteur GFAP.
Figure 1: Injection de fibrilles d'alpha-synucléine par voie intrapéritonéale ou intraglossal provoque la maladie chez Tg bigéniques (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) chez la souris. (A) Micrographie électronique de recombinants fibrilles d'alpha-synucléine humaines qui ont été traitées aux ultrasons injectée par voie intrapéritonéale à des souris et intraglossally. coloration négative avec de l'acétate d'uranyle a révélé de multiples grappes d'agrégats courtes, en forme de tige. Les barres d'échelle = 100 nm. (B) Courbes de survie de Kaplan-Meier montre que , après injection intra - péritonéale avec des fibrilles alpha-synucléine quatre des cinq Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) souris ont développé une maladie neurologique dans 229 ± 17 jours ( en violet carrés pleins), alors qu'aucun des souris témoins ayant reçu une injection de PBS a développé des signes de dysfonctionnement neurologique à l'intérieur de 420 jours (carrés ouverts violets). Après inoculation intraglossal avec fibrilles alpha-synucléine une souris de cinq ans sont morts après 285 jours (vertcercles pleins). En revanche, aucune des souris témoins ayant reçu une injection de PBS a développé une maladie neurologique ou mort spontanément (vert cercles vides). Modifié de Breid et al. , 2016 14. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Analyse biochimique de l' alpha-synucléine phosphorylée dans le SNC de périphériquement injecté Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) chez la souris. (A) Immunoblot avec l'anticorps EP1536Y, reconnaissant la phosphorylation à Ser129 de l' alpha-synucléine, a montré que les souris injectées par voie intrapéritonéale et malade accumulé des espèces de haut poids moléculaire d'agrégats de Sarkosyl insolubles dans l' alpha-synucléine dans le cerveau phosphorylée und moelle épinière. Les souris témoins provoqués avec du PBS ne pas accumuler des agrégats de l'alpha-synucléine phosphorylée et a présenté des bandes seulement pour sa forme monomère. (B) Après défi intraglossal avec des fibrilles d'alpha-synucléine seule souris, animal 121, a montré des agrégats Sarkosyl insolubles de l' alpha-synucléine phosphorylée dans son cerveau et la moelle épinière, tandis que toutes les autres souris inoculées intraglossally sont restés en bonne santé sans dépôts d'alpha-synucléine. Les masses moléculaires sont présentés dans kilodaltons. chargement de l'échantillon dans chaque voie est indiquée par la détection de l'actine. Modifié de Breid et al. , 2016 14. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: L' analyse montre que Immunofluorescence dépôts dephosphorylé alpha-synucléine colocalisent avec l' ubiquitine et p62 dans le cerveau et la moelle épinière de Tg malade (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) chez la souris. Co-coloration de l' alpha-synucléine, détecté avec l'anticorps EP1536Y phosphorylée, et l' ubiquitine ont révélé une colocalisation distinct dans le cerveau, comme on l' observe dans le noyau thalamique (A), et la moelle épinière, comme détecté dans la substance grise (B), de souris malades après provocation intraperitoneal avec des fibrilles d'alpha-synucléine. De même, l' alpha-synucléine phosphorylé, détecté avec l'anticorps n ° 64 pSyn, également colocalisé avec p62 dans le cerveau (C) et la moelle épinière (D) des animaux malades. (A à D) PBS-injecté animaux témoins sains ne présentent pas des dépôts ou colocalisation pour l' une de ces protéines. coloration nucléaire avec DAPI est en bleu. Les barres d'échelle = 20 pm. Modifié de Breid et al. , 2016 14. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) souris ont développé une gliose périphérique après provocation avec des fibrilles d' alpha-synucléine. (A) Analyse par immunofluorescence de coupes de cerveau d'animaux malades avec un anticorps contre la GFAP, un marqueur des astrocytes, a révélé astrogliosis réactif dans les zones où les dépôts de l' alpha-synucléine phosphorylée, qui ont été détectés dans le tronc cérébral avec le pSyn anticorps n ° 64. En revanche, il n'y avait pas astrogliosis réactif dans le cerveau des souris témoins ayant reçu une injection de PBS. (B) De même, la coloration avec un anticorps dirigé contre IBA-1, un marqueur de la microglie, a démontré microgliosedans les zones où les dépôts d'alpha-synucléine phosphorylée chez les animaux malades. Les cerveaux de souris témoins en bonne santé injecté PBS, n'a pas montré des signes de microgliose. (C) l' imagerie par bioluminescence a révélé rayonnement élevée à partir des cerveaux et moelles épinières de Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) souris injectées par voie intraperitoneale avec des fibrilles d'alpha-synucléine (panneau de gauche), qui a été provoqué par l'activation des astrocytes , peu de temps avant que la souris a développé des symptômes neurologiques. Dans le cerveau et la moelle épinière des souris témoins injectés PBS le rayonnement de base n'a pas augmenté avec le temps (à droite). Après inoculation intraglossal avec des fibrilles d'alpha-synucléine, une Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) souris, animal 121, a montré des signes de astrogliosis réactif peu de temps avant qu'il ne meurt à 285 jours (panneau central). (D) Après défi intraperitoneale de Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) chez la souris avec des fibrilles d' alpha-synucléine, Increased niveaux de bioluminescence (> 2 × 10 6 p / s / cm 2 / sr) ont été mesurés à partir des cerveaux de souris (quatre cercles de bleu, vert, brun, orange) et quelques semaines avant qu'ils ont développé des signes neurologiques de la maladie. L'un des cinq animaux ont également montré des niveaux élevés de bioluminescence peu avant la mort de 285 jours après l'injection intraglossal avec fibrilles alpha-synucléine (cercles magenta). En revanche, pour la santé, les souris témoins ayant reçu une injection de PBS (cercles noirs, les barres d'erreur indiquent SD [n = 4]) et un animal qui n'a pas développé la maladie après l' injection intraperitoneale avec des fibrilles d'alpha-synucléine (cercles rouges), le signal de bioluminescence est resté inférieure à un seuil de 2 x 10 6 p / s / cm 2 / sr dans la période d'observation. Les barres d'échelle = 20 pm. Modifié de Breid et al. , 2016 14. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cettefigure.
| souris ligne | Inoculum (pg) | route Ensemencement | Nombre de souris ayant la maladie / non. des souris inoculées | La durée moyenne de survie ± écart-type (jours) |
| Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) | fibrilles d'a-synucléine humaine (50) | intrapéritonéale | 4/5 | 229 ± 17/420 |
| Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) | PBS | intrapéritonéale | 0/5 | 0/420 |
| Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) | fibrilles d'a-synucléine humaine (10) | intraglossal | 1/5 | 285/420 |
| Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) | PBS | intraglossal | 0/4 0/420 |
Tableau 1: expériences inoculations. * Mise à jour de Breid et al., 2016 14
| Cible [clone anticorps] | Hôte | immunogène | Dilution IF | Dilution dans WB |
| Actin [C4] | Souris | - | - | 1: 1000 |
| α-synucléine, phospho S129 [pSyn n ° 64] | Souris | pSer129 | 1: 1200 | - |
| α-synucléine, phospho S129 [EP1536Y] | lapin | pSer129 | 1: 100 | 1: 1000 |
| Gliale fibrillaire protéine acide (GFAP) | lapin | - | 1: 200 | - |
| IBA-1 | lapin | - | 1: 500 | - |
| Sequestosome-1 (p62) | lapin | - | 1: 100 | - |
| Ubiquitin [Ubi-1] | Souris | - | 1: 500 | - |
Tableau 2: Les anticorps utilisés pour immunofluorescence (IF) et Western blot (WB). * Mise à jour de Breid et al., 2016 14
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Discussion
Injection périphérique de fibrilles d'alpha-synucléine dans le péritoine de Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) chez la souris représente une méthode facile pour induire une maladie neurologique accompagnée d' une neuroinflammation de récapituler caractéristiques importantes des synucléinopathies. De même, l'injection de la languette représente une autre voie pour la neuroinvasion par prionoids alpha-synucléine dans les souris transgéniques, mais est moins efficace. Nous avons choisi de mettre fin à nos expériences à 420 jours après l'injection, et nous ne pouvons pas exclure la possibilité que plus ou toutes les souris injectées peuvent brilles ont développé une maladie à un moment ultérieur. En outre, l'utilisation de Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) permet la visualisation des souris non-invasive de l' astrogliose et représente une méthode simple pour le contrôle des réponses inflammatoires causées par la neuro - invasion de l' alpha-synucléine sur toute la durée de vie de la Souris.
Une étape critique est la préparationde l'inoculum. Les facteurs triviaux comme le temps d'agrégation, le temps de sonication, l'abondance des endotoxines, ou la quantité de fibrilles utilisée pour l' injection pourrait influencer le résultat d'une expérience en affectant la propension de l' ensemencement de l' alpha-synucléine 21. Misfolded il est donc important d'utiliser toujours les mêmes conditions lors de la préparation inoculums pour injection. Pour les injections intraglossal il doit être considéré que non seulement le nerf hypoglosse mais aussi d'autres nerfs crâniens comme le nerf glossopharyngien innervent la langue et pourraient être impliqués dans le transport interneuronale de prionoids alpha-synucléine dans le cerveau. Ainsi ciblant différents domaines de la langue pourrait se traduire par une cinétique différente propagation au cerveau. Nous n'injectez pas directement dans le nerf hypoglosse et il est possible que le ciblage du nerf hypoglosse pourrait améliorer la transmission du système nerveux central de prionoids alpha-synucléine. Pour les injections intra-péritonéales avec fibrilles alpha-synucléine est Critical qui est injecté correctement l'inoculum dans le péritoine et non accidentellement dans les organes internes comme l'intestin ou caecum, ce qui pourrait affecter négativement neuroinvasion. Cela est également important pour l'imagerie par bioluminescence lors de l'injection D-luciférine. De D-mauvais ciblage luciférine aux organes internes pourrait ralentir sa distribution au cerveau et entraîner une bioluminescence inférieure. Pour obtenir des résultats uniformes lors de l'imagerie, il est également essentiel de toujours préparer fraîchement la solution D-luciférine avant l'injection et de le laisser incuber exactement pendant 10 minutes après l'injection intrapéritonéale avant l'imagerie.
l'imagerie par bioluminescence est une méthode utile pour les changements de mesure non invasive en astrogliosis au fil du temps et peut être appliquée non seulement après les injections intrapéritonéale ou intraglossal mais aussi après chaque type de traitement, y compris, par exemple, des injections intracérébrales ou intraveineuse. Pour contrôler la propagation de prionoids alpha-synucléine de la périphérie vers le CNS et la neuroinflammation qui suit , nous avons utilisé Tg bigéniques (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) chez la souris. Parce que l' expression hemizygous de l' alpha-synucléine chez ces animaux est de 40% inférieure par rapport aux animaux homozygotes ils restent indemnes de la maladie spontanée jusqu'à 22 mois d'âge et ont un fond génétique adapté à la transmission alpha-synucléine études 13. Cependant, des modifications en ce qui concerne le choix du modèle de la souris pour l'imagerie par bioluminescence peut être souhaitable. Une option intéressante est l'utilisation de souris Tg monogénique (GFAP -Luc +/-) exprimant seulement luciférase en tant que transgène, ce qui permet une évaluation du comportement prionoid de fibrilles d'alpha-synucléine sur un fond qui est essentiellement de type sauvage dans la mesure où qui concerne l' alpha-synucléine 14. En outre, en traversant Tg (GFAP -Luc +/-) chez la souris à d' autres souris transgéniques telles que Tg (SOD1 G93A) chez la souris pour la sclérose latérale amyotrophique ou de Tg (APP23) mla glace pour la maladie d'Alzheimer, permet l' imagerie de la neuroinflammation dans d' autres modèles de la maladie 22, 23.
Une limitation de ce protocole est que sur la base de l'emplacement d'injection de l'inoculum injecté ne peut pas dépasser un certain volume. Ainsi injections dans la langue ne peuvent être réalisées avec des volumes plus petits que ceux dans le péritoine, ce qui peut affecter les temps de transmission du système nerveux central. Une autre limitation est que le transgène GFAP -Luc ne permet la détection de astrogliosis mais pas de microgliose, ce qui est tout aussi important dans la neuro - inflammation. Enfin, ce modèle ne fournit pas un aperçu de la façon dont prionoids alpha-synucléine atteignent le système nerveux central après l'injection intrapéritonéale.
L'application de prionoids alpha-synucléine exogènes par injection a été montré pour être une méthode utile pour étudier les voies de transmission qui jouent un rôle critique dans récapitulant les caractéristiques de synucleinopathies. Injections intracérébrales de fibrilles recombinant alpha-synucléine ou de souris associée à une maladie ou d' espèces d'alpha-synucléine humains dans des modèles animaux ont été utilisés dans plusieurs études pour analyser les propriétés de l' ensemencement et de l' efficacité de transmission dans le temps 5, 7, 17, 24, 25, 26. Depuis des injections stéréotaxiques dans le cerveau induisent toujours une réponse inflammatoire locale peu de temps après la chirurgie, cette voie de transmission pourrait influencer la propagation et l'infectiosité de l'inoculum causée par une altération de l'homéostasie du cerveau. Des études plus récentes ont changé la mise au point des applications périphériques ou systémiques, pas principalement pour éviter l'intervention chirurgicale, mais plutôt d'analyser la périphérie, la paroi intestinale, le muscle squelettique, ou dans le sang, comme point de départ d'où neuroinvasion au système nerveux central pourrait commence 6, 9, 14, 27. Pour prion il a été démontré que la transmission à travers le péritoine ou la langue conduit à la neuro-invasion et les maladies neurologiques; après l' infection de la langue, la propagation dans prion seulement deux semaines au noyau hypoglosse dans le tronc cérébral 11. Depuis a été discuté alpha-synucléine pour avoir des propriétés neuroinvasives et ensemencement comme prion, nous avons montré que la transmission par la langue et le péritoine représentent d' autres points d'entrée pour prionoids alpha-synucléine pour envahir le système nerveux central 14. Quantification de astrogliosis par imagerie par bioluminescence facilite le suivi du processus de neuroinflammatoire au fil du temps et représente une alternative non invasive pour l'analyse histologique.
Pour obtenir une idée plus précise sur la façon dont le système nerveux central répond à des neuroinvasion prionoids alpha-synucléineet à d' autres traitements qui provoquent neuroinflammation, il serait bénéfique pour générer des modèles de souris qui permettent également la surveillance non invasive de microgliose, par exemple avec un transgène qui conduit l' expression de la luciférase d'un promoteur spécifique pour l' expression des protéines dans la microglie.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Olga Sharma, Theresa Hundt, et le personnel des installations de microscopie DZNE et animales pour le soutien technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
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