Summary

Анализ активности протеинкиназы с радиоактивно меченым АТФ

Published: May 26, 2017
doi:

Summary

Протеинкиназы представляют собой высокоразвитые сигнальные ферменты и каркасы, которые являются критическими для меж- и внутриклеточной передачи сигнала. Мы представляем протокол для измерения активности киназы с использованием радиоактивно меченого аденозинтрифосфата ([γ- 32 P] ATP), надежного метода, помогающего выявлять регуляцию клеточной сигнализации.

Abstract

Протеинкиназы способны регулировать крупномасштабные клеточные изменения в ответ на сложные массивы раздражителей, и много усилий было направлено на выявление аллостерических деталей их регуляции. Киназы содержат сигнальные сети, дефекты которых часто являются признаками множественных форм рака и связанных с ними заболеваний, что делает платформу для анализа подходящей для манипулирования восходящими регуляторными факторами и валидации реакционных требований, критически важных для поиска улучшенных терапевтических средств. Здесь мы опишем базовый анализ киназы, который может быть легко адаптирован для удовлетворения конкретных экспериментальных вопросов, включая, но не ограничиваясь ими, тестирование эффектов биохимических и фармакологических агентов, генетических манипуляций, таких как мутация и делеция, а также условий культивирования клеток и методов лечения для зондирования Клеточные сигнальные механизмы. В этом анализе используется радиоактивно меченный [γ-32P] АТФ, который позволяет проводить количественные сравнения и четкую визуализацию результатов, и может быть модифицированнымДля использования с иммунопреципитированной или рекомбинантной киназой, специфическими или типизированными субстратами, во всем широком диапазоне условий реакции.

Introduction

Протеинкиназы являются сложными ферментами, критичными для передачи клеточных сигналов в соответствующие реакции 1 . Учитывая их роль в поддержании гомеостаза и предупреждении или развитии болезненных состояний 2 , биохимические методы оценки активности киназы продолжают оставаться мощным инструментом для определения особенностей передачи сигналов эукариот 3 . Хотя стратегии, использующие фосфоспецифические антитела, были в высшей степени информативными с точки зрения измерения влияния различных условий лечения на статус 4 передачи сигнала в клетке, анализ киназы позволяет измерять эффекты различных условий лечения непосредственно в терминах ферментативной активности киназы интерес. Хотя существует несколько вариантов аналогичных анализов, которые не используют радиоактивные материалы 5 , мы по-прежнему полагаемся на этот метод для надежного количественного определения результатов. ТамЯвляются двумя типичными применениями этого анализа, которые являются ценными по различным причинам: анализ иммунопреципитата (IP) киназы ( рисунок 1 ) и анализ рекомбинантной протеинкиназы ( рисунок 2 ).

Анализ киназы IP чрезвычайно полезен для идентификации факторов, способных активировать специфические протеинкиназы, а также для оценки условий ингибирующего лечения. Вкратце, интересующую киназу эпитопа, представляющую интерес, трансфицируют в культивируемые эукариотические клетки, подвергают множеству обработок, иммунопреципитируют и анализируют на способность включать радиоактивно меченный фосфат в модельный субстрат ( например, основной миелиновый белок (MBP)). Анализ киназы IP также может быть выполнен без использования избыточной экспрессии либо путем иммунопреципитации эндогенного белка, либо с использованием любого количества методов редактирования генома. Поскольку лечение проводится в культуре, этот метод может обнаруживать стимуляции, передаваемые через множественные восходящие факторыИли параллельных путей путем считывания in vitro . Одним из основных преимуществ этого метода является то, что он не требует предварительного знания прямых восходящих или нисходящих факторов или сайтов фосфорилирования в нем. Более того, как только определенные субстраты для представляющей интерес киназы были идентифицированы, такой же протокол анализа киназы может быть использован с рекомбинантными компонентами для измерения удельной активности в отношении природных субстратов и идентификации специфических сайтов фосфорилирования в сочетании с масс-спектрометрическим анализом. Сайты, идентифицированные таким образом, могут быть дополнительно подтверждены киназными анализами с использованием субстратных мутантов. Наконец, этот метод можно также использовать для обнаружения и измерения аутофосфорилирования.

Протокол, представленный здесь, предполагает либо оптимизированную схему очистки белка, либо способ трансфекции для экспрессии меченой сродства киназы, представляющей интерес в культивируемых клетках. Для более подробных описаний трансфекции, лизиса, иммунопреципитации и протеиновой очисткиОколей, мы предлагаем сослаться на протоколы Cold Spring Harbor 6 . Для получения дополнительной информации относительно разработки и модификации анализов, пожалуйста, обратитесь к Фосфорилированию белков: Избранные методы в энзимологии 7 .

Protocol

1. Ресурсы для очистки киназы и общий контур иммунопреципитации ПРИМЕЧАНИЕ. Киназы, используемые для этого анализа, могут быть получены из иммунопреципитатов культивируемых клеток или с помощью рекомбинантных средств, таких как очистка с аффинной меткой 6 . ?…

Representative Results

Анализы киназы IP WNK1 Myc-меченный WNK1 трансфицировали в клетки HEK293 и иммунопреципитировали антителом против Myc11. Иммунопреципитат проявлял киназную активность по отношению к модельному субстрату МВР, а также к себе ( рисунок 1А ). З…

Discussion

Киназы представляют собой разнообразное семейство белков, которые развили обширную функциональность в многочисленных контекстах, и киназные анализы были невероятно полезны при изучении нескольких сигнальных белков и в значительной степени способствовали нашему текущему пониманию…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы выражают благодарность всем нынешним и бывшим сотрудникам лаборатории Кобба за ценную работу и обсуждения, а Дион Уэр – за административную помощь. Эти исследования были поддержаны Национальным институтом здравоохранения Грант R37 DK34128 и грантом Фонда Уэлч I1243 для MHC

Materials

Protein A Sepharose CL-4B GE Healthcare Life Sciences 17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG035C010MC
Laemmli Buffer Bio-Rad #1610737
Radioactive shielding Research Products International BR-006
R-250 dye (Coomassie) Thermo Fisher 20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper Whatman 1003-917
Slab gel vacuum dryer Bio-Rad Model 583 Gel Dryer #1651745 
Autorad marker Agilent Technologies 420201
Phosphorescent ruler Sigma Aldrich R8133
Phosphorescent dots Sigma Aldrich L5149
Geiger counter Ludlum Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8×10" Carestream Health 107 2263
BioMax MS Film 8×10" Carestream Health 829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8×10" Carestream Health 851 8706
Medical/X-ray film processor Konica Minolta SRX-101A
Scintillation vials Research Products International 125500
Scintillation fluid MP Biomedicals 188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter Beckman LS 6500

References

  1. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
  2. Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).
  3. Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
  4. Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).
  5. Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).
  6. Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).
  7. . Autoradiography Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011)
  8. Walker, J. M. . The Protein Protocols Handbook. , (2009).
  9. Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).
  10. McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).
  11. Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).
  12. Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).
  13. Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).

Play Video

Cite This Article
Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. J. Vis. Exp. (123), e55504, doi:10.3791/55504 (2017).

View Video