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Biochemistry

Analizzare l'attività della proteina con l'ATP radioattivato

doi: 10.3791/55504 Published: May 26, 2017

Summary

Le chinasi di proteine ​​sono enzimi e stadi di segnalazione altamente evoluti che sono critici per la trasduzione del segnale inter-e intracellulare. Presentiamo un protocollo per la misurazione dell'attività di chinasi mediante l'uso di trifosfato adenosina radiomarcato ([γ-32P] ATP), un metodo affidabile per aiutare a spiegare la regolazione cellulare di segnalazione.

Abstract

Le proteine ​​chinasi sono in grado di governare cambiamenti cellulari su vasta scala in risposta a complessi array di stimoli, e molto sforzo è stato indirizzato a scoprire dettagli allosterici della loro regolazione. Le cinasi comprendono reti di segnalazione i cui difetti sono spesso segni distintivi di molteplici forme di cancro e malattie correlate, rendendo una piattaforma di analisi suscettibile di manipolare i fattori regolatori a monte e di convalida dei requisiti di reazione critici nella ricerca di terapie migliorate. Qui descriviamo un esame di base di chinasi che può essere facilmente adattato a specifiche questioni sperimentali, tra cui ma non limitandosi a verificare gli effetti degli agenti biochimici e farmacologici, manipolazioni genetiche come la mutazione e la delezione, nonché le condizioni di coltura cellulare e trattamenti a sonda Meccanismi di segnalazione cellulare. Questo saggio utilizza l'ATP [γ- 32 P] radiomarcato, che consente confronti quantitativi e una chiara visualizzazione dei risultati e può essere modSe utilizzati con chinasi immunoprecipitati o ricombinanti, substrati specifici o tipizzati, in una vasta gamma di condizioni di reazione.

Introduction

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Le proteine ​​chinasi sono enzimi sofisticati critici per la trasmissione di segnali cellulari in risposte appropriate 1 . Considerati i loro ruoli nel mantenimento dell'omeostasi e nella prevenzione o promozione degli stati di malattia 2 , i metodi biochimici per la valutazione dell'attività di chinasi continuano ad essere strumenti potenti per delineare i particolari della segnalazione eucariotica 3 . Sebbene le strategie che utilizzino anticorpi specifici fosfo-specifici siano stati altamente informativi in ​​termini di misura degli effetti delle diverse condizioni di trattamento sullo stato di segnalazione cellulare 4 , un test di chinasi consente di misurare gli effetti di diverse condizioni di trattamento direttamente in termini di attività enzimatica di una chinasi di interesse. Mentre ci sono diverse opzioni per analisi simili che non utilizzano materiali radioattivi 5 , continuiamo a contare su questo metodo per una robusta quantità di risultati. LàSono due applicazioni tipiche di questo saggio, sia preziose per ragioni diverse: il dosaggio immunoprecipitato (IP) di chinasi ( Figura 1 ) e il test della chinasi della proteina ricombinante ( Figura 2 ).

Il dosaggio di IP chinasi è estremamente utile per identificare fattori capaci di attivare specifiche chinasi proteiche, nonché condizioni di trattamento inibitorie di misura. In breve, una chinasi di interesse etichettata con epitopo viene trasfettata in cellule eucariotiche colte, sottoposte a una varietà di trattamenti, immunoprecipitati e analizzati per la capacità di incorporare fosfato radiomarcato in un substrato di modello ( ad es. Proteina di base di mielina (MBP)). Il test di kinasi IP può anche essere eseguito senza ricorrere all'eccessiva espressione, sia mediante immunoprecipitazione della proteina endogena, o qualsiasi altro numero di tecniche di editing genomico. Poiché i trattamenti vengono somministrati in coltura, questo metodo può rilevare stimoli trasmessi attraverso più fattori a monteO percorsi paralleli mediante lettura in vitro . Un importante vantaggio di questo metodo è che non richiede una conoscenza preliminare di fattori diretti a monte oa valle o siti di fosforilazione in esso. Inoltre, una volta individuati substrati specifici per una chinasi di interesse, è possibile utilizzare lo stesso protocollo di analisi chinasi con componenti ricombinanti per misurare l'attività specifica nei confronti dei substrati naturali e identificare siti specifici di fosforilazione in combinazione con l'analisi di spettrometria di massa. I siti identificati in questo modo possono essere ulteriormente convalidati con i test di chinasi utilizzando mutanti del substrato. Infine, questo metodo può essere usato anche per rilevare e misurare l'autofosforilazione.

Il protocollo fornito qui presuppone uno schema di purificazione della proteina ottimizzata o metodo di trasfezione per esprimere una chinasi di affinità interessata nelle cellule colte. Per esposizioni più dettagliate di trasfezione, lisi, immunoprecipitazione e proteina purificazione protOcols, suggeriamo di riferirsi ai protocolli Cold Spring Harbour 6 . Per ulteriori informazioni riguardanti lo sviluppo e la modifica del test, consultare Proteine ​​Phosphorylation: Metodi selezionati in Enzimologia 7 .

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Protocol

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1. Risorse di depurazione delle chinasi e pipeline di immunoprecipitazione generale

NOTA: Le cinasi usate con questo dosaggio possono essere provenienti da immunoprecipitati di cellule colte o mediante mezzi ricombinanti come la purificazione affinità 6 . Di seguito è riportato un protocollo generale per l'immunoprecipitazione contrassegnata dalla bandiera che può essere necessario modificare a seconda della chinasi di interesse. Tutto dovrebbe essere mantenuto sul ghiaccio quando possibile.

  1. Aggiungere 2 μL di 1 mg / mL di anticorpi a 200 μL di lisati cellulari (di solito ~ 1 mg / ml di concentrazione totale di proteine) e incubare a 4 ° C per 1 ora durante il dondolo.
  2. La proteina di lavaggio Una seperarosa si perda 2-3 volte con il tampone di lisi (vedi sotto) brevettando brevemente a 4 ° C per 30 s a 1 min a 5.000 xg ("spin di tocco"), rimuovendo il surnatante con una pipetta e riutilizzando le perle in tampone .
    1. Preparare il tampone di lisi: 50 mM HEPES pH 7,7, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% glicerolo, 0,2 mM orthovanadato di sodio, 100 mM fluoruro di sodio, 50 mM β-glicerofosfato, 0,1% Triton X 100 o 0,1% NP-40.
  3. Aggiungere 30 μL di sospensione del 50% di branoli di seperarina di proteina A nel lysis buffer a lisati; Incubare a 4 ° C per 1 ora durante il dondolo.
  4. Toccare lo spin a 4 ° C per far pelliccare le perle e rimuovere il surnatante.
  5. Lavare 3 volte con 1 mL di tampone di lavaggio a goccia (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,4).
  6. Lavare una volta con tampone di reazione di chinasi 1x (10 mM HEPES pH 8,0, 10 mM MgCl2). Rimuove il maggior numero di tamponi possibile senza rimuovere le perle.

2. Inizializzare le reazioni della chinasi

NOTA: Per i dosaggi di IP chinasi, ~ 15 μL di branelli non sospesi è un tipico campione di partenza. Per i dosaggi ricombinanti della proteina chinasi, gli importi tipici di partenza sono compresi tra 0,1 e 1,0 μg in 1-10 per 25-50 μL di volumi di reazione finale. Regolare i volumi del campione proteico ricombinanteS per essere uguale al buffer che sono memorizzati prima di inizializzare il saggio. Quando si utilizzano alte quantità di chinasi, includere una proteina portante come BSA per aiutare a mantenere la stabilità proteica per la durata del saggio.

  1. Preparare il 5x reazione di reazione di chinasi sotto riportato:
    50 mM HEPES pH 8,0
    50 mM di MgCl2
    50 mM Benzamidina (inibitore della proteasi)
    50 mM DTT (agente di riduzione)
    250 μM ATP (non etichettati o "freddi")
  2. Tenere i campioni di chinasi su ghiaccio in tubi da 1,5 ml. Preparare la seguente miscela di reazione in tubi separati, refrigerati di 1,5 mL:
    21 μl H 2 O
    6 μL di tampone di reazione di chinasi 5x
    1 μl ATP radiomarcato ("caldo")
    2 μL di substrato (~ 5 mg / ml)
    NOTA: per i dosaggi ricombinanti di chinasi, il volume può essere regolato per contenere proteine ​​purificate. Calcolare tale che il volume di reazione finale è di 30 μL. Utilizza questa ricetta per preparare un maestromescolare. Al ricevimento di ATP etichettato, diluire la riserva in H 2 O ad un'attività specifica di 0,01 mCi / μl prima di aggiungere alla miscela di reazione.
  3. Per inizializzare il saggio, aggiungere tutta la miscela di reazione al campione di chinasi e incubare la reazione a 30 ° C per 5 minuti a 1 h a seconda dell'attività di chinasi in fase di analisi.
    NOTA: quando si lavora con una chinasi la cui attività non è stata precedentemente misurata, eseguire un tempo di attività di chinasi con intervalli di 5 minuti tra i punti di tempo.

3. Terminazione di reazione e SDS-PAGE

  1. Arrestare la reazione mettendo in ghiaccio e aggiungendo 7,5 μL di tampone di campione 5x Laemmli 6 .
  2. Scaldare a 100 ° C per 30 secondi fino a 2 minuti nel blocco termico.
  3. Toccare lo spin e caricare 20 μL per pozzetto sul 10-15% SDS-PAGE gel. Far eseguire gel sufficientemente a lungo per separare la chinasi e il substrato (tipicamente 1 h a potenza costante di 5 W). Assicurarsi di mantenere schermato l'apparecchiatura gel per limitare l'esposizione a 32
  4. Qui usi gli apparecchi di gelatina fatti in casa, ma i minigelchi standard commercialmente disponibili sono perfettamente adatti. Utilizzare le dimensioni come segue:
    Gel: 8 cm di larghezza, 5,5 cm di lunghezza (risolvendo), spessore 1,5 mm.
    Pettini: 15 pozzetti, spessore 1,5 mm, larghezza 2,9 mm, profondità 16 mm

4. Colorazione e asciugatura del gel

Attenzione: Per tutti i passaggi, assicurarsi di ridurre l'esposizione personale a 32 P utilizzando schermatura radioattiva e indossare dispositivi di protezione individuale. Per ulteriori informazioni su passaggi specifici sono inclusi alcuni riferimenti utili.

  1. Togliere il gel da lastre di vetro / allumina e mettere in 50 ml di colorante Coomassie (10% acido acetico glaciale, 50% metanolo, 0,25% R-250) per 1 ora su un agitatore orbitale impostato a 50 giri / min. Per questo passo utilizzare un contenitore leggermente più grande del gel stesso. 8
  2. Spostare il gel dalla macchia alla soluzione di fissaggio (10% acetato glaciale acciD, 20% metanolo) al fine di de-macchia. Far scivolare il gel in 600-700 ml di soluzione di fissaggio durante la notte su agitatore orbitale a 50 giri / min. Posizionare pezzi di spugna o salviette di laboratorio annodate nel contenitore con il gel per assorbire il colorante Coomassie 8 , 9 .
  3. Togliere il gel dalla soluzione di fissaggio e immergere in 200 mL di metanolo per 1-2 minuti con agitazione gentile fino a quando il gel si trasforma in bianco latteo. Ciò contribuirà a prevenire fessurazioni durante la fase di asciugatura.
  4. Bagnare un pezzo di carta filtrante qualitativa da 14 cm x 14 cm con metanolo e mettere su asciugatrice a vuoto a gel di lastre. Posare il gel sul lato frontale della carta filtrante rivolto verso l'alto.
  5. Coprire con cura il gel con un involucro di plastica per evitare le rughe e le bolle d'aria. Azionare l'asciugatrice per 1,5 ore a 80 ° C. Dopo aver raggiunto il vuoto, aprire il coperchio ed estrarre eventuali bolle d'aria, se necessario, con un soffietto in gomma morbida.

5. Autoradiogrammi e contatti di scintillazione

  1. Rimuovi driEd attaccare un indicatore di autoradio, righello fosforescente o punti sulla carta filtrante sul lato del gel. Se si usano i puntini verificare che siano in un modello asimmetrico. Questo allineerà il gel con il film dopo l'esposizione e lo sviluppo.
  2. Utilizzare un contatore Geiger per controllare l'intensità del segnale. Per un segnale più debole di esposizione a -70 ° C a -80 ° C con uno schermo di intensificazione aumenterà la densità della banda del film.
  3. In una stanza buia mettere il gel asciugato in una cassetta con film e uno schermo intensificante nel seguente ordine dall'alto verso il basso: gel, film, schermo intensificante.
  4. Fissare lo schermo di intensificazione al coperchio della cassetta e applicare il gel sul posto per facilitare questo passaggio. Lo schermo intensificante emette luce quando irradiato dalle particelle beta dal 32 P. Le emissioni di luce penetrano in modo più efficace del film rispetto alle particelle beta.
    1. Assicurarsi che la lunghezza d'onda emessa dallo schermo di intensificazione correscaStagni ad una lunghezza d'onda il film è più sensibile a.
    2. Utilizzare un contatore Geiger per determinare quanto tempo lasciare l'esposizione per: se il numero di cpm è di ~ 100 o inferiore, prova a notte a -70 ° C. Se il conteggio è di ~ 10.000, iniziare con un'esposizione di 1h e ottimizzare da lì.
  5. Alla conclusione dell'esposizione rimuovere il film e svilupparsi in un processore medico / a raggi X. Se l'esposizione è stata eseguita a -70 - -80 ° C, lasciare che la cassetta si riscaldi a temperatura ambiente per minimizzare la condensa sulla pellicola o rimuovere la pellicola immediatamente prima delle forme di condensazione 10 .
  6. Posare la pellicola sopra il gel essiccato / carta filtrante e allineare l'immagine del marker / punti con i marcatori / punti sul gel essiccato. Segna sul film le bande corrispondenti agli standard proteici. Etichettare le norme proteiche e quali corsie le reazioni sono per riferimento futuro.
  7. Incise le bande del gel che corrispondono a bande di interesse sul film e li piazzanoIn fiale di scintillazione da 7 ml. Aggiungere 4 ml di liquido di scintillazione e contare con contatore di scintillazione liquida. Confermare che il contatore sia impostato per monitorare la corretta finestra dello spettro di energia per 32 P.
    NOTA: Assicurarsi inoltre di accisciare la banda corrispondente al substrato dalla corsia di controllo non-chinasi. Questo verrà utilizzato per calcolare la radiazione di sfondo che verrà sottratta da tutti i conteggi di scintillazione del campione.

6. Analisi dei risultati

NOTA: L'autoradiogramma fornisce una visualizzazione qualitativa dei risultati. Per una quantificazione accurata, l'incorporazione di 32 P può essere misurata con un contatore di scintillazione. I dati sono di solito espressi in termini di attività relativa, come mostrato nella Figura 1B . Fintanto che vengono mantenute condizioni uniformi per tutti i campioni, le misure relative di attività specifiche sono sufficienti per confrontare i trattamenti.

  1. Nel calcolo di valori assoluti specifici di attività, eseguire un rigoreOttimizzazione di tutte le condizioni di reazione, inclusa la chinasi, il substrato e le concentrazioni di ATP fredde, al fine di garantire una gamma lineare di attività in un corso temporale ( es. 2 x [chinasi] = 2 x attività specifica). Per le chinasi con elevata attività specifica, eseguire test con concentrazione di substrato aumentato in caso di attività cinasi china è limitata dalla quantità di substrato.
  2. Calcolare l'attività specifica della chinasi di interesse in unità di nanomoli fosfato trasferito per min per mg chinasi.
    1. Sottrarre gli spazi dal cpm nelle bande contate.
    2. Calcola il decadimento di ATP caldo: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 dove t è il numero di giorni dalla data di riferimento (dovrebbe essere fornito dal venditore), t 1/2 L'emivita di 32 P, che è di 14,3 giorni e 0,95 riflette l'efficienza del contatore di scintillazione. Esempio: se si utilizza ATP caldo che è di 28 giorni, il valore di decadimento dovrebbe essere 0.245.
    3. CalcInserire il pikomole (pmol) del totale ATP nel saggio (di solito è uguale alla quantità di ATP freddo nella reazione): volume di analisi (μL) x [ATP freddo] (μM) = totale ATP (pmols). Esempio: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol
    4. Calcolare cpm / pmol ATP: [μL di caldo ATP x (2,2 x 10 7 ) x fattore di decadimento] / pmol di ATP freddo.
      NOTA: Il valore di 2,2 x 10 7 converte 0,01 mCi / μL di ATP a cpm.
    5. Calcola la quantità di chinasi nel dosaggio in mg. Per entrambe le chinasi ricombinanti e le chinasi immunoprecipitate, metodi standard come i test BCA sono idonei a determinare le concentrazioni di partenza. Esempio: wtERK2 0,0002 μg / μL in una reazione di chinasi di 50 μL è 0,01 μg, o 1 x 10 -5 mg.
    6. Calcolare il cpm totale nel saggio. Assemblare 30 μL di reazioni e eseguire 20 μL da ogni reazione su un gel. Moltiplicare il cpm contato (dopo la sottrazione di vuoto) per un fattore di volume / volume di dosaggio totale caricato. Proseguendo quanto sopraEsempio, moltiplicare tutti i conteggi di 1,5 o 30/20.
    7. Calcolare l'attività specifica della chinasi assayed:
      Totale cpm nel saggio) / (cpm / pmol ATP) / (tempo di analisi in minuti) / (quantità di chinasi in mg)
      NOTA: La suddivisione del valore sopra riportato per 1.000 rende l'attività specifica in nanomoli / minuto / mg
  3. Calcolare quanti moli di fosfato sono incorporati in un substrato (fino a quando il suo peso molecolare è noto). Questo viene utilizzato per determinare il numero di fosfosi su una particolare proteina una volta che la reazione è stata completata.
    Total cpm nel saggio) / (cpm / pmol ATP)] / (quantità di substrato in pmols)

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Representative Results

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WNK1 IP kinasi

Myc-tagged WNK1 è stato trasfettato in cellule HEK293 e immunoprecipitato con un anticorpo anti-Myc 11 . L'immunoprecipitato ha mostrato l'attività di chinasi verso il substrato del modello MBP e verso di sé ( Figura 1A ). I mutanti WNK1 sono stati quindi testati per l'attività di chinasi verso MBP con lo stesso metodo, questa volta impiegando costrutti con GST-tagged ( Figura 1B ). L'analisi del comportamento di mutanti chinasi rispetto a wildtype ha rivelato residui critici per l'attività ottimale WNK1.

Le cellule HEK293 sono state esposte a un gruppo di trattamenti farmacologici e biochimici. Utilizzando un anticorpo sollevato contro un peptide N-terminale WNK1, l'attività endogena WNK1 chinasi immunoprecipitata è stata analizzata usando MBP come substrato. Fattore di crescita epidermico (EGF), un attivo notoO di segnalazione ERK1 / 2, il nocodazolo, un farmaco che mira alla dinamica del microtubulo, l'anisomicina, un inibitore della traduzione eucariotica e l'acido lizofosfatidico (LPA), un potente mitogeno, non sono stati in grado di provocare un forte aumento del MBP fosforilato. Al contrario, NaCl è stato dimostrato di essere un regolatore dell'attività di WNK1 chinasi.

Esami ERK2 della proteina chinasi ricombinante

Il ratto ERK2 portante un tag N-terminale 6His è stato espresso in cellule batteriche e l'affinità è purificata con resina nichel 12 . La proteina è stata ulteriormente purificata mediante cromatografia a scambio ionico su una colonna MonoQ, in cui sono state testate diverse frazioni di eluizione per l'attività di chinasi ( Figura 2A ). Poiché ERK2 richiede la doppia fosforilazione da MEK per raggiungere l'attività chinasi massima, ERK2 purificata dai batteri in assenza di MEK è in gran parte inattiva. Pertanto, per testare le frazioni di recomBinant ERK2 per l'attività verso MBP, una forma costitutivamente attiva di MEK1 chiamata MEK1R4F è stata inclusa nelle reazioni di chinasi. In particolare, MEKR4F non ha un'elevata attività di chinasi su MBP ( Figura 2 ).

Utilizzando un dosaggio simile a quello mostrato nella figura 2A , un'attività di chinasi MBP è stata usata per misurare l'attività di mutanti ERK2 ricombinanti purificati da colture batteriche relative a proteine ​​di tipo selvatico ( Figura 2B ). Anche se ERK2 è in grado di fosforilizzare MBP quando stimolato da MEKR4F, la mutazione della lisi catalitica (K52R) o di una treonina prossimale ai siti canonici della doppia fosforilazione (T188D e T188E) drammaticamente abroga l'attività di ERK2 chinasi. ERK2-T188D e ERK2-T188E esprimono l'attività marginale di chinasi verso un piccolo peptide flessibile ( Figura 2C ), tuttavia, non sono in grado di fosforilazione robusta dei substrati noti di ERK2 Nup153 e PDX1 ( Figura 2 D).

Figura 1
Figura 1: Analisi di chinasi di immunoprecipitazione di WNK1. ( A ) Le cellule HEK293 sono state trasfettate con pCMV5-Myc senza un inserto o pCMV5-Myc-WNK1, le proteine ​​contrassegnate sono state immunoprecipitate con l'anticorpo anti-Myc seguito da saggi di chinasi utilizzando MBP come substrato. A sinistra è mostrata la autoradiografia e un immunoblot degli immunoprecipitati sulla destra. ( B ) Varie proteine ​​mutanti GST-WNK1 sono state usate nei dosaggi di chinasi con MBP come substrato; La fosforilazione di MBP viene espressa come attività relativa alla specie selvatica WNK1. ( C ) L'endogeno WNK1 è stato immunoprecipitato da cellule HEK293 trattate con vari stimoli e testati per autofosforilazione. Questa figura è stata modificata da Xu et al. , 2000 11 .5504fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Analisi della chinasi proteinica ricombinante di ERK2. ( A ) Le frazioni purificate ERK2 da una colonna di scambio di anioni MonoQ sono state usate in un esame di chinasi con MBP in presenza o in assenza di MEK1R4F, uno stimolatore costitutivamente attivo dell'attività ERK2-chinasi. ( B ) I mutanti ERK2 sono stati testati per l'attività di chinasi su MBP. ( C ) Le mutanti del loop di attivazione ERK2-T188D e ERK2-T188E esercitano l'attività marginale di chinasi verso un piccolo substrato peptidico tipizzato. ( D ) Confronto delle attività di chinasi ERK2 o T188D dopo l'attivazione da MEK1R4F con substrati ERK2 conosciuti nucleoporina 153 (Nup153) e homeobox 1 pancreatico e duodenale (PDX1). I substrati fosforilati sono indicati da cunei e fosforileERT2 e T188 con gli asterischi. Ristampato (e modificato) con autorizzazione di McReynolds et al. , 2016 12 (Copyright 2016 American Chemical Society). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Le cinasi sono una famiglia diversificata di proteine ​​che hanno evoluto un'ampia funzionalità in numerosi contesti e i dosaggi di chinasi sono stati incredibilmente utili nello studio di diverse proteine ​​di segnalazione e hanno contribuito notevolmente alla nostra attuale comprensione della comunicazione cellulare. In particolare, lo stesso test di base è stato utilizzato per caratterizzare due chinasi disparati nonostante le principali differenze nella struttura e nell'attività. La chinasi WNK1 contiene una tasca catalitica atipica in cui la lisin critica si è spostata in una posizione unica ed è nota per svolgere ruoli nella regolazione dei cotransportatori di cloruro di cationi attraverso le funzioni di chinasi e di ponteggio. L'attività di chinasi di WNK1 è nota per avere un basso numero di fatturato, anche sui suoi substrati meglio caratterizzati, le proteine ​​ricinusse ossigenine proteiche della chinasi delle proteine ​​(OSR1) e SPAS / STE20 correlate a proline alanina ricca di chinasi (SPAK). Al contrario, ERK2, insieme alla chinasi ERK1 strettamente correlata, mostra attivita robusta di chinasi quando viene attivata 13 , 14 .

L'aspetto più critico del dosaggio è l'assemblaggio della reazione. Per effettuare accurate misurazioni del tempo, è necessario prestare particolare attenzione all'inizializzazione delle reazioni di chinasi. Esistono quattro requisiti fondamentali per un procedimento di chinasi: chinasi, substrato, ATP e uno ione metallico. Per questo protocollo, che viene utilizzato principalmente per le chinasi eucariotiche, MgCl2 viene utilizzato come fonte di magnesio. Entrambe le proteine ​​chinasi ricombinanti e le preparazioni di chinasi di IP contengono tipicamente il magnesio, rendendo MgCl2 insufficiente come avviatore di reazione. Allo stesso modo, l'aggiunta di ATP non nominato ("freddo") prima dell'aggiunta di ATP etichettato ("caldo") può innescare una reazione inadeguata all'inizio. Si raccomanda di preparare reazioni utilizzando un tampone di reazione di chinasi concentrata che facilita l'aggiunta contemporanea di MgCl

Anche se esiste una certa distinzione tra i dosaggi di IP chinasi e i ricomponenti di proteina chinasi, tIl paradigma sperimentale comune a entrambi dimostra quanto sia versatile questo saggio. In effetti, esistono casi in cui le caratteristiche di entrambi i tipi di dosaggio di chinasi possono essere miscelati, come con gli studi sulla percorso di segnalazione della chinasi della proteina attivata mitogen-attivata / extracellulare (MAPK / ERK). In questo percorso ERK1 / 2 viene attivato dalla doppia fosforilazione da parte del fattore a monte MAPK / ERK chinasi 1 (MEK1). Precedenti studi hanno dimostrato che mentre MEK1, così come un mutante costitutivamente attivo denominato MEK1R4F, è in grado di attivare ERK1 / 2, porto attività molto bassa verso MBP. Di conseguenza, ERK1 / 2 purificato dalle cellule batteriche mostra l'attività limitata di chinasi verso MBP a meno che non venga trattata con MEK1R4F, creando una piattaforma robusta per confrontare l'attività di chinasi del tipo selvatico ERK1 / 2 con i costrutti mutanti, come mostrato in Figura 2 . L'inclusione di componenti immunoprecipitati può aggiungere ancora più sfumature, evidenziando il saggio di chinasi come metodo altamente adattabile per sondare il n multifacetedAtto di queste importanti molecole di segnalazione.

Mentre alcuni potrebbero trovare difficoltà a lavorare con materiali radioattivi, la tracabilità quantitativa del saggio di chinasi radiotelefile è uno dei suoi principali vantaggi. Tuttavia, i recenti progressi nei campi della chimica dei prodotti naturali, della genomica e della spettrometria di massa hanno creato una domanda di test di chinasi modificati Con letture più adattabili alle applicazioni ad alta velocità 15 . Poiché questi saggi usufruiscono di diversi materiali di etichettatura, i compromessi sono fatti in termini di precisione, ma questi possono essere superati utilizzando un saggio radiomarcato per convalidare i risultati dello schermo. Dato che la nostra comprensione della segnalazione di proteine ​​chinasi aumenta, rimane chiaro che le tecniche in grado di eliminare le particolarità delle funzioni di regolazione delle chinasi continueranno ad aiutare nello sviluppo di strumenti e terapie.

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Disclosures

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano tutti gli attuali e ex membri del laboratorio di Cobb per lavori e discussioni preziose e Dionne Ware per l'assistenza amministrativa. Questi studi sono stati sostenuti dal National Institutes of Health Grant R37 DK34128 e dalla Fondazione Welch Grant I1243 a MHC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein A Sepharose CL-4B GE Healthcare Life Sciences 17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG035C010MC
Laemmli Buffer Bio-Rad #1610737
Radioactive shielding Research Products International BR-006
R-250 dye (Coomassie) Thermo Fisher 20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper Whatman 1003-917
Slab gel vacuum dryer Bio-Rad Model 583 Gel Dryer #1651745 
Autorad marker Agilent Technologies 420201
Phosphorescent ruler Sigma Aldrich R8133
Phosphorescent dots Sigma Aldrich L5149
Geiger counter Ludlum Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8 x 10" Carestream Health 107 2263
BioMax MS Film 8" x 10" Carestream Health 829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8" x 10" Carestream Health 851 8706
Medical/X-ray film processor Konica Minolta SRX-101A
Scintillation vials Research Products International 125500
Scintillation fluid MP Biomedicals 188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter Beckman LS 6500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26, (22), 3100-3112 (2007).
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Analizzare l'attività della proteina con l'ATP radioattivato
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Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. J. Vis. Exp. (123), e55504, doi:10.3791/55504 (2017).More

Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. J. Vis. Exp. (123), e55504, doi:10.3791/55504 (2017).

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