放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ
Summary
プロテインキナーゼは高度に進化したシグナリング酵素であり、細胞間および細胞内シグナル伝達にとって重要な足場である。本発明者らは、細胞シグナル伝達調節の解明を助ける信頼できる方法である放射性標識アデノシン三リン酸（[γ- 32 P] ATP）の使用によるキナーゼ活性を測定するためのプロトコールを提示する。
Abstract
プロテインキナーゼは、複雑な刺激配列に応答して大規模な細胞の変化を制御することができ、その調節のアロステリックな詳細を明らかにするために多くの努力が向けられている。キナーゼは、欠陥がしばしば複数の形態の癌および関連疾患の特徴であり、上流の調節因子の操作および改善された治療法の探索において重要な反応要求の検証に適したアッセイプラットフォームを形成するシグナルネットワークを含む。ここでは、生化学的および薬理学的作用物質の試験、突然変異および欠失などの遺伝子操作、ならびに細胞培養条件およびプローブに対する処理を含むが、これに限定されない特定の実験的問題に適合するように容易に適合させることができる基本キナーゼアッセイを記載する細胞シグナル伝達機構。このアッセイは、定量的な比較および結果の明確な視覚化を可能にする放射性標識[γ- 32 P] ATPを利用し、そしてmod広範囲の反応条件にわたって、免疫沈降または組換えキナーゼ、特異的または典型的な基質と共に使用することができます。
Introduction
プロテインキナーゼは、細胞シグナルの適切な応答への伝達に不可欠な洗練された酵素である1 。ホメオスタシスの維持と病態2の予防または促進における役割を考えると、キナーゼ活性を評価するための生化学的方法は、真核生物のシグナル伝達の詳細を描写するための強力なツールであり続けている3 。リン酸化特異的抗体を用いる戦略は、細胞シグナル伝達状態4に対する異なる治療条件の影響を測定する点で非常に有益であるが、キナーゼアッセイは、異なるキナーゼのキナーゼの酵素活性に関して異なる治療条件の影響を直接測定することを可能にする。関心放射性物質5を使用しない類似のアッセイにはいくつかの選択肢がありますが、我々は結果の堅牢な定量化のためにこの方法に引き続き依存しています。そこ免疫沈降（IP）キナーゼアッセイ（ 図1 ）および組換えタンパク質キナーゼアッセイ（ 図2 ）の2つの典型的な用途である。
IPキナーゼアッセイは、特定のプロテインキナーゼを活性化することができる因子ならびにゲノム阻害性の治療条件を同定するために非常に有用である。簡潔には、目的のエピトープタグ化キナーゼを培養真核細胞にトランスフェクションし、種々の処理を施し、免疫沈降させ、放射性標識ホスフェートをモデル基質（ 例えば、ミエリン塩基性タンパク質（MBP））に取り込む能力についてアッセイする。 IPキナーゼアッセイはまた、内因性タンパク質の免疫沈降または任意の数のゲノム編集技術のいずれかによって、過剰発現に頼らずに行うことができる。治療は培養で行われるので、この方法は複数の上流因子を介して伝達される刺激を検出することができるまたはインビトロでの読取りによる並行経路である 。この方法の1つの大きな利点は、直接的な上流または下流の因子またはその中のリン酸化部位の事前知識を必要としないことである。さらに、興味のあるキナーゼの特異的基質が同定されると、同じキナーゼアッセイプロトコールを組換え成分とともに使用して、天然基質に対する比活性を測定し、質量分析と組み合わせた場合の特異的リン酸化部位を同定することができる。このようにして同定された部位は、基質変異体を利用するキナーゼアッセイによってさらに検証することができる。最後に、この方法は、自己リン酸化を検出および測定するためにも使用することができる。
本明細書で提供されるプロトコルは、最適化されたタンパク質精製スキームまたは培養細胞における目的の親和性タグキナーゼを発現するためのトランスフェクション方法のいずれかを前提とする。トランスフェクション、溶解、免疫沈降、およびタンパク質精製のより詳細な解説については、Cold Spring Harbor Protocols 6を参照することをお勧めします。アッセイの開発および改変に関する詳細については、「タンパク質リン酸化：選択された方法in Enzymology」を参照してください。
Protocol
Representative Results
Discussion
キナーゼは、数多くの状況において広範な機能を発達させたタンパク質の多様なファミリーであり、キナーゼアッセイは、いくつかのシグナル伝達タンパク質の研究に非常に有用であり、細胞通信の現在の理解に大きく貢献しています。特に、同じ基本アッセイを、構造および活性の大きな違いにもかかわらず、2つの異種キナーゼの特徴付けに使用した。 WNK1キナーゼは、臨界リジンが独特?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は貴重な作業と討論のためにCobb研究所のすべての現メンバーと元メンバー、そして管理援助のためのDionne Wareに感謝します。これらの研究は、国立保健研究所R37 DK34128およびウェルチ財団グラントI1243によってMHCに支持された
Materials
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector |
| BioMax Cassette 8×10" | Carestream Health | 107 2263 |
| BioMax MS Film 8×10" | Carestream Health | 829 4985 |
| BioMax MS Intensifying Screen 8×10" | Carestream Health | 851 8706 |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
References
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