Proteinkinaser er højt udviklede signalerende enzymer og stilladser, der er kritiske for inter- og intracellulær signaltransduktion. Vi præsenterer en protokol til måling af kinaseaktivitet ved brug af radioaktivt mærket adenosintrifosfat ([γ-32P] ATP), en pålidelig metode til at hjælpe med at tydeliggøre cellesignalregulering.
Proteinkinaser er i stand til at styre storskala cellulære forandringer som reaktion på komplekse arrays af stimuli, og en stor indsats har været rettet mod at afdække allosteriske detaljer i deres regulering. Kinaser omfatter signaleringsnetværk, hvis defekter ofte er karakteristika for flere former for cancer og beslægtede sygdomme, hvilket gør en analyseplan til rådighed til manipulation af opstrøms regulatoriske faktorer og validering af reaktionskrav, der er kritiske i søgen efter forbedrede terapeutiske midler. Her beskriver vi et grundlæggende kinase-assay, der let kan tilpasses til specifikke eksperimentelle spørgsmål, herunder men ikke begrænset til testning af virkningerne af biokemiske og farmakologiske midler, genetiske manipulationer såsom mutation og deletion såvel som cellekulturbetingelser og behandlinger til sonde Celle signaleringsmekanismer. Dette assay udnytter radiomærkede [y-32P] ATP, som muliggør kvantitative sammenligninger og klar visualisering af resultater og kan modIfied til brug med immunopræcipiterede eller rekombinante kinaser, specifikke eller typiske substrater, over en lang række reaktionsbetingelser.
Proteinkinaser er sofistikerede enzymer kritiske for transmissionen af cellulære signaler i passende svar 1 . I betragtning af deres roller i at opretholde homeostase og forebyggelse eller fremme af sygdomstilstande 2 , er biokemiske metoder til vurdering af kinaseaktivitet fortsat effektive værktøjer til at afgrænse oplysningerne om eukaryotisk signalering 3 . Selvom strategier, der benytter phosphospecifikke antistoffer, har været meget informative med hensyn til måling af virkningerne af forskellige behandlingsbetingelser på celle signaleringsstatus 4 , tillader et kinaseassay at måle virkningerne af forskellige behandlingsbetingelser direkte i form af enzymatisk aktivitet af en kinase af interesse. Mens der er flere muligheder for lignende analyser, der ikke bruger radioaktive materialer 5 , fortsætter vi med at anvende denne metode til robust kvantificering af resultater. derEr to typiske anvendelser af dette assay, begge værdifulde af forskellige årsager: det immunpræcipiterede (IP) kinaseassay ( Figur 1 ) og det rekombinante proteinkinase assay ( Figur 2 ).
IP-kinaseassayet er yderst nyttigt til at identificere faktorer, der er i stand til at aktivere specifikke proteinkinaser såvel som måling af inhiberende behandlingsbetingelser. I korte træk transfekteres en epitop-mærket kinase af interesse i dyrkede eukaryote celler, udsættes for en række behandlinger, immunpræcipiteres og analyseres for evnen til at inkorporere radioaktivt mærket phosphat i et modelsubstrat ( fx myelinbasisk protein (MBP)). IP-kinaseassay kan også udføres uden at ty til overekspression, enten ved immunpræcipitation af endogent protein eller et hvilket som helst antal genom-redigeringsteknikker. Fordi behandlingerne administreres i kultur, kan denne metode detektere stimuleringer transmitteret gennem flere opstrømsfaktorerEller parallelle veje ved in vitro- aflæsning. En stor fordel ved denne metode er, at den ikke kræver forudgående kendskab til direkte opstrøms eller nedstrøms faktorer eller phosphoryleringssteder deri. Når specifikke substrater for en interessekinase er blevet identificeret, kan specifikke kinasassayprotokoller anvendes med rekombinante komponenter til måling af specifik aktivitet over for naturlige substrater og identifikation af specifikke phosphoryleringssteder, når de kombineres med massespektrometrianalyse. Sites identificeret på denne måde kan valideres yderligere med kinaseanalyser under anvendelse af substratmutanter. Endelig kan denne metode også bruges til at detektere og måle autophosphorylering.
Den heri tilvejebragte protokol antager enten et optimeret proteinrensningsskema eller transfektionsmetode til ekspression af en affinitetsmærket kinase af interesse i dyrkede celler. Til mere detaljerede udstillinger af transfektion, lysis, immunpræcipitation og proteinrensning protOcols, foreslår vi at henvise til Cold Spring Harbor Protocols 6 . For yderligere information om analyseudvikling og modifikation henvises til Proteinphosphorylation: Selected Methods in Enzymology 7 .
Kinaser er en forskelligartet familie af proteiner, der har udviklet stor funktionalitet i mange sammenhænge, og kinaseanalyser har været utroligt nyttige til at studere flere signalproteiner og har i høj grad bidraget til vores nuværende forståelse af cellulær kommunikation. Navnlig blev det samme basiske assay anvendt til karakterisering af to forskellige kinaser på trods af store forskelle i struktur og aktivitet. WNK1 kinase indeholder en atypisk katalytisk lomme, hvor den kritiske lysin har skiftet til…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker alle nuværende og tidligere medlemmer af Cobb laboratoriet for værdifuldt arbejde og diskussioner, og Dionne Ware til administrativ bistand. Disse undersøgelser blev støttet af National Institutes of Health Grant R37 DK34128 og Welch Foundation Grant I1243 til MHC
Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 |
Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC |
Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 |
Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 |
R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 |
Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 |
Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 |
Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 |
Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 |
Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 |
Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector |
BioMax Cassette 8×10" | Carestream Health | 107 2263 |
BioMax MS Film 8×10" | Carestream Health | 829 4985 |
BioMax MS Intensifying Screen 8×10" | Carestream Health | 851 8706 |
Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A |
Scintillation vials | Research Products International | 125500 |
Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 |
Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |