Dosage de l'activité des protéines kinase avec ATP radiomarqué
Summary
Les protéines kinases sont des enzymes de signalisation hautement évoluées et des échafaudages qui sont essentiels pour la transduction du signal inter et intracellulaire. Nous présentons un protocole pour mesurer l'activité de la kinase par l'utilisation d'adénosine triphosphate radiomarqué ([γ- 32 P] ATP), une méthode fiable pour faciliter l'élucidation de la régulation de la signalisation cellulaire.
Abstract
Les protéines kinases sont capables de gouverner les changements cellulaires à grande échelle en réponse à des séries complexes de stimuli, et beaucoup d'efforts ont été dédiés à la découverte des détails allostériques de leur réglementation. Les kinases comprennent des réseaux de signalisation dont les défauts sont souvent caractéristiques de multiples formes de cancer et de maladies apparentées, ce qui rend possible une manipulation des facteurs de régulation en amont et la validation des exigences de réaction critiques pour la recherche de thérapies améliorées. Ici, nous décrivons un dosage basique de la kinase qui peut être facilement adapté aux questions expérimentales spécifiques, y compris, mais sans s'y limiter, le test des effets des agents biochimiques et pharmacologiques, des manipulations génétiques telles que la mutation et la suppression, ainsi que les conditions de culture cellulaire et les traitements pour sonder Mécanismes de signalisation cellulaire. Ce dosage utilise l'ATP [γ- 32 P] radiomarqué, qui permet des comparaisons quantitatives et une visualisation claire des résultats, et peut être modPour utilisation avec de la kinase immunoprécipitée ou recombinante, des substrats spécifiques ou typés, dans toute une large gamme de conditions de réaction.
Introduction
Les protéines kinases sont des enzymes sophistiquées critiques pour la transmission de signaux cellulaires en réponses appropriées 1 . Étant donné leur rôle dans le maintien de l'homéostasie et la prévention ou la promotion des états pathologiques 2 , les méthodes biochimiques pour évaluer l'activité kinase continuent d'être des outils puissants pour délimiter les particularités de la signalisation eucaryote 3 . Bien que les stratégies utilisant des anticorps spécifiques de phospho aient été très informatives en termes de mesure des effets de différentes conditions de traitement sur l'état de signalisation cellulaire 4 , un dosage de kinase permet de mesurer directement les effets de différentes conditions de traitement en termes d'activité enzymatique d'une kinase de intérêt. Bien qu'il existe plusieurs options pour des analyses similaires qui n'utilisent pas de matières radioactives 5 , nous continuons de compter sur cette méthode pour une quantification robuste des résultats. LàSont deux applications typiques de ce dosage, à la fois précieuses pour différentes raisons: l'essai immunoprécipité (IP) kinase ( figure 1 ) et le dosage recombinant de la protéine kinase ( figure 2 ).
Le test de la kinase IP est extrêmement utile pour identifier les facteurs capables d'activer des protéines kinases spécifiques ainsi que d'évaluer les conditions de traitement inhibiteur. En bref, une kinase marquée par un epitope d'intérêt est transfectée dans des cellules eucaryotes cultivées, soumise à une variété de traitements, immunoprécipitée et testée pour pouvoir incorporer un phosphate radiomarqué dans un substrat modèle ( par exemple, une protéine basique de myéline (MBP)). Le test de la kinase IP peut également être effectué sans recourir à une surexpression, soit par immunoprécipitation de protéines endogènes, soit par n'importe quel nombre de techniques de modification du génome. Parce que les traitements sont administrés en culture, cette méthode peut détecter les stimulations transmises par plusieurs facteurs en amontOu des chemins parallèles par lecture in vitro . L'un des principaux avantages de cette méthode est qu'il ne nécessite pas une connaissance préalable des facteurs directs en amont ou en aval ou des sites de phosphorylation. En outre, une fois que des substrats spécifiques pour une kinase d'intérêt ont été identifiés, le même protocole de dosage de kinase peut être utilisé avec des composants recombinants pour mesurer une activité spécifique vis-à-vis des substrats naturels et identifier des sites de phosphorylation spécifiques lorsqu'ils sont combinés avec une analyse par spectrométrie de masse. Les sites identifiés de cette manière peuvent encore être validés avec des dosages de kinase en utilisant des mutants de substrat. Enfin, cette méthode peut également être utilisée pour détecter et mesurer l'autophosphorylation.
Le protocole fourni ici suppose soit un schéma de purification de protéine optimisé, soit un procédé de transfection pour exprimer une kinase marquée par une affinité intéressant dans des cellules cultivées. Pour des expositions plus détaillées de la transfection, de la lyse, de l'immunoprécipitation et de la purification des protéines protOcols, nous suggérons de se référer aux protocoles Cold Spring Harbor 6 . Pour plus d'informations sur le développement et la modification des analyses, veuillez consulter la Phosphorylation des protéines: Méthodes choisies en Enzymologie 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Les kinases sont une famille variée de protéines qui ont développé une fonctionnalité étendue dans de nombreux contextes, et les analyses de kinase ont été incroyablement utiles dans l'étude de plusieurs protéines de signalisation et ont largement contribué à notre compréhension actuelle de la communication cellulaire. Notamment, le même dosage de base a été utilisé pour caractériser deux kinases disparates en dépit de grandes différences de structure et d'activité. La kinase WNK1 contient u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient tous les membres actuels et anciens du laboratoire Cobb pour des travaux et des discussions précieux, et Dionne Ware pour l'assistance administrative. Ces études ont été appuyées par les National Institutes of Health Grant R37 DK34128 et Welch Foundation Grant I1243 au MHC
Materials
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector |
| BioMax Cassette 8×10" | Carestream Health | 107 2263 |
| BioMax MS Film 8×10" | Carestream Health | 829 4985 |
| BioMax MS Intensifying Screen 8×10" | Carestream Health | 851 8706 |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
References
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