रेडियोलैलेड एटीपी के साथ प्रोटीन किनास गतिविधि पर काबू पाने
Summary
प्रोटीन की किस्में अत्यधिक सिग्नलिंग एंजाइम और स्कॉफॉल्ड्स विकसित होती हैं जो अंतर- और इंट्रासेल्युलर सिग्नल ट्रांसडक्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं। हम रेडियोलैलेबेड एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट ([γ- 32 P] एटीपी) के उपयोग के माध्यम से किनीज गतिविधि को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, सेलुलर सिगनल विनियमन की व्याख्या के लिए एक विश्वसनीय तरीका है।
Abstract
प्रोटीन कीइजिजियां उत्तेजनाओं के जटिल सरणियों के जवाब में बड़े पैमाने पर सेलुलर परिवर्तनों को नियंत्रित करने में सक्षम हैं, और उनके विनियमन के सबोटेरिक विवरणों को उजागर करने के लिए बहुत प्रयास किया गया है। किनासेस में सिग्नलिंग नेटवर्क शामिल होते हैं जिनके दोष अक्सर कैंसर और संबंधित बीमारियों के कई रूपों की पहचान करते हैं, जो एक उन्नत प्लेटफॉर्म को अपस्ट्रीम नियामक कारकों के हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी बनाते हैं और बेहतर चिकित्सीयताओं की तलाश में प्रतिक्रिया की आवश्यकताओं के सत्यापन के लिए महत्वपूर्ण हैं। यहां, हम एक बुनियादी किनाज परख का वर्णन करते हैं जो आसानी से विशिष्ट प्रयोगात्मक सवालों के अनुरूप हो सकते हैं जिनमें जैव रासायनिक और औषधीय एजेंटों के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए सीमित है, लेकिन आनुवंशिक जोड़ों जैसे कि उत्परिवर्तन और विलोपन, साथ ही साथ सेल संस्कृति की स्थिति और जांच के उपचार सेल सिग्नलिंग तंत्र इस परख रेडियोलैलेड [γ- 32 P] एटीपी का उपयोग करता है, जो मात्रात्मक तुलना और परिणामों के स्पष्ट दृश्य के लिए अनुमति देता है, और आधुनिक हो सकता हैप्रतिदीप्त या पुनः संयोजक केनेज, विशिष्ट या विशिष्ट सब्सट्रेट्स के साथ उपयोग की जाने वाली इत्तफाक, सभी विस्तृत प्रतिक्रियाओं की स्थिति में
Introduction
प्रोटीन केन्या परिष्कृत एंजाइम हैं जो उचित प्रतिक्रियाओं में सेलुलर संकेतों के प्रसारण के लिए महत्वपूर्ण हैं 1 । होमोस्टेसिस को बनाए रखने और रोग की रोकथाम या बढ़ावा देने में उनकी भूमिकाओं को देखते हुए, किनाज गतिविधि का आकलन करने के लिए जैव रासायनिक विधियां यूकेरियोटिक सिग्नलिंग के विवरणों को चित्रित करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। हालांकि फ़ॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करने वाली रणनीति सेल सिग्नलिंग स्टेटस 4 पर विभिन्न उपचार की स्थितियों के प्रभाव को मापने के मामले में बेहद जानकारीपूर्ण रही है, एक कीनेस परख अलग-अलग उपचार की स्थिति के प्रभावों को सीधे मापने के लिए अनुमति देता है। ब्याज। जबकि इसी तरह के एशेज के लिए कई विकल्प हैं जो कि रेडियोधर्मी सामग्री का उपयोग नहीं करते 5 , हम इस विधि पर भरोसा करते हैं कि परिणामों की मात्रा बहुत अधिक है। क्या आप वहां मौजूद हैंइस परख के दो विशिष्ट अनुप्रयोग हैं, जो अलग-अलग कारणों के लिए मूल्यवान हैं: प्रतिरक्षा प्रत्यारोपण (आईपी) कीनेस परख ( चित्रा 1 ) और पुनः संयोजक प्रोटीन कीनेज परख ( चित्रा 2 )।
आईपी कीनेस परख विशिष्ट प्रोटीन केनेज को सक्रिय करने और साथ ही निरोधात्मक उपचार की स्थिति का अनुमान लगाने में सक्षम कारकों की पहचान करने के लिए काफी उपयोगी है। संक्षेप में, ब्याज के एक मिलान टैग किनेज़ को संवर्धित यूकेरियोटिक कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया जाता है, विभिन्न उपचारों के अधीन, रेडियोलैबैड फॉस्फेट को एक मॉडल सब्सट्रेट ( जैसे मैलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी)) में शामिल करने की क्षमता के लिए immunoprecipitated, और assayed। आईपी किनेज परख भी ओवर एक्सप्रेशन का सहारा लेने के बिना किया जा सकता है, या तो अंतर्जात प्रोटीन के इम्युनोप्रेएबैग या जीनोम-संपादन तकनीकों की किसी भी संख्या के द्वारा। क्योंकि उपचार संस्कृति में किया जाता है, यह विधि कई अपस्ट्रीम कारकों के माध्यम से संचारित उत्तेजनाओं का पता लगा सकता हैया इन विट्रो वाचआउट द्वारा समानांतर मार्ग। इस पद्धति का एक बड़ा फायदा यह है कि इसमें प्रत्यक्ष अपस्ट्रीम या डाउनस्ट्रीम कारकों या फोस्फोराइलेशन साइटों के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता नहीं है। इसके अतिरिक्त, एक बार ब्याज की एक किनेज के लिए विशिष्ट सबस्ट्रेट्स की पहचान हो चुकी है, उसी प्रकार कीइज अभेद्य प्रोटोकॉल को पुनः संयोजक घटकों के साथ प्रयोग किया जा सकता है जिससे कि प्राकृतिक सबस्ट्रेट्स की ओर विशिष्ट गतिविधि का पता लगाया जा सके और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ मिलकर विशिष्ट फास्फोरेटेशन साइटों की पहचान की जा सके। सब्सट्रेट म्यूटेंट का उपयोग करने वाले किनेज एलेसेस के साथ इस तरीके में पहचाने जाने वाली साइट्स को और अधिक मान्य किया जा सकता है। अन्त में, इस पद्धति का उपयोग ऑटोफॉस्फोरायरेलेशन का पता लगाने और मापने के लिए भी किया जा सकता है।
यहां उपलब्ध प्रोटोकॉल में सुसंस्कृत कोशिकाओं में रुचि के एक आत्मीयता टैग कीज़ को व्यक्त करने के लिए या तो एक अनुकूलित प्रोटीन शुद्धि योजना या अभिकलन विधि है। अभिकर्मक, विश्लेषण, immunoprecipitation, और प्रोटीन शोधन प्रोट के अधिक विस्तृत व्याख्याओं के लिएओकोल, हम कॉल्ड स्प्रिंग हार्बर प्रोटोकॉल 6 का संदर्भ देते हैं। परख विकास और संशोधन के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया प्रोटीन फास्फोरायलेशन का संदर्भ लें: एंजाइमोलॉजी में चयनित तरीके 7
Protocol
Representative Results
Discussion
किनेसेस प्रोटीन के एक विविध परिवार हैं, जिन्होंने कई संदर्भों में व्यापक कार्यक्षमता विकसित की है, और कई सिग्नल प्रोटीनों का अध्ययन करने के लिए किनेज अभिकरण अविश्वसनीय रूप से उपयोगी हैं और सेलुलर संच…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक मूल्यवान काम और चर्चा के लिए कोब्ब प्रयोगशाला के सभी वर्तमान और पूर्व सदस्यों का धन्यवाद करते हैं, और प्रशासनिक सहायता के लिए डायोन वेयर इन अध्ययनों को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान R37 DK34128 और वेल्च फाउंडेशन ग्रांट I1243 MHC
Materials
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector |
| BioMax Cassette 8×10" | Carestream Health | 107 2263 |
| BioMax MS Film 8×10" | Carestream Health | 829 4985 |
| BioMax MS Intensifying Screen 8×10" | Carestream Health | 851 8706 |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
References
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