방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정
Summary
단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- 32 P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
단백질 키나아제는 복잡한 자극 배열에 반응하여 대규모 세포 변화를 조절할 수 있으며, 조절에 대한 알로 스테 릭 세부 사항을 밝히기 위해 많은 노력이 기울여왔다. 키나아제는 결함이 종종 여러 형태의 암 및 관련 질병의 특징 인 신호 전달 네트워크를 포함하여 상향 조절 인자의 조작 및 개선 된 치료법을 찾는 데 필수적인 반응 요구 사항의 확인에 적합한 분석 플랫폼을 만든다. 여기서 우리는 생화학 및 약리학 적 약제의 영향, 돌연변이 및 결실과 같은 유전 조작, 세포 배양 조건 및 프로브에 대한 처리를 시험하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 특정 실험 문제에 쉽게 적응할 수있는 기본적인 키나아제 분석을 기술한다 세포 신호 메커니즘. 이 분석법은 방사성 표지 된 [γ- 32 P] ATP를 사용하여 정량적 비교와 결과의 명확한 가시화가 가능하며 mod광범위한 반응 조건에 걸쳐 면역 침전 또는 재조합 키나아제, 특이 적 또는 전형적 기질과 함께 사용하기에 적합하다.
Introduction
단백질 키나아제는 세포 신호를 적절한 반응으로 전달하는 데 중요한 정교한 효소입니다 1 . 항상성 유지와 질병 상태의 예방 또는 증진에있어 역할을 감안할 때, 키나아제 활성을 평가하는 생화학 적 방법은 진핵 세포 신호 전달의 세부 사항을 묘사하기위한 강력한 도구가되고있다. 포스 포 – 특이 적 항체를 이용하는 전략이 세포 신호 상태 4 에 대한 상이한 처리 조건의 영향을 측정하는 관점에서 매우 유익 하였지만, 키나아제 분석은 상이한 처리 조건의 영향을 직접적으로 다른 키나아제의 효소 활성의 관점에서 측정 할 수있게한다 관심. 방사성 물질을 사용하지 않는 유사한 분석법에 대한 몇 가지 옵션이 있지만, 우리는 결과의 견고한 정량화를 위해이 방법을 계속 사용합니다. 그곳에면역 침전 된 (IP) 키나아제 분석 ( 그림 1 )과 재조합 단백질 키나아제 ( 그림 2 )의 두 가지 일반적인 용도로 사용됩니다.
IP 키니 아제 분석은 특정 단백질 키나아제를 활성화 할 수있는 요인을 확인하고 측정 억제 조건을 측정하는 데 매우 유용합니다. 간단히 말하면, 관심있는 에피토프 – 표지 된 키나아제를 배양 된 진핵 세포에 형질 감염시키고, 다양한 처리를 실시하고, 면역 침강시키고, 방사성 표지 된 인산염을 모델 기질 ( 예를 들어, 미엘린 염기성 단백질 (MBP))에 혼입시키는 능력에 대해 분석한다. IP 키나아제 분석은 또한 내인성 단백질의 면역 침전 또는 임의의 수의 게놈 편집 기술에 의한 과발현에 의하지 않고 수행 될 수있다. 처리가 배양 물에서 수행되기 때문에,이 방법은 다수의 상류 인자를 통해 전달 된 자극을 검출 할 수있다또는 평행 경로 에 대한 정보를 제공합니다. 이 방법의 한 가지 주요 이점은 직접 상류 또는 하류의 인자 또는 인산화 부위에 대한 사전 지식이 필요 없다는 것이다. 또한 관심 키나아제에 대한 특정 기질이 확인되면 동일한 키나아제 분석 프로토콜을 재조합 성분과 함께 사용하여 천연 기질에 대한 특정 활성을 측정하고 질량 분석기와 결합 할 때 특정 인산화 부위를 식별 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 동정 된 부위는 기질 돌연변이 체를 이용하는 키나아제 검정으로 더 검증 될 수있다. 마지막으로,이 방법은 또한자가 인산화를 검출하고 측정하는데 사용될 수있다.
여기서 제공된 프로토콜은 배양 된 세포에서 관심있는 친 화성 태그 키나아제를 발현하기위한 최적화 된 단백질 정제 방법 또는 형질 감염 방법을 가정한다. 형질 감염, 용해, 면역 침전 및 단백질 정제에 대한보다 자세한 설명은ocols, 우리는 콜드 스프링 하버 프로토콜 6 을 추천하는 것이 좋습니다. 분석법 개발 및 변형에 관한 더 자세한 정보는 단백질 인산화 : 효소학의 선정 된 방법 7 을 참조하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
키나아제는 다양한 환경에서 광범위한 기능을 발휘하는 다양한 단백질 군으로 키나아제 분석법은 여러 가지 신호 전달 단백질을 연구하는데 매우 유용하며 세포 통신에 대한 현재의 이해에 크게 기여했습니다. 특히, 구조 및 활성의 주요한 차이에도 불구하고 2 개의 상이한 키나아제를 특성화하는데 동일한 기본 분석이 사용되었다. WNK1 키나아제는 중요한 리신이 독특한 위치로 이동 한 비정형 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 귀중한 업무 및 토론을 위해 Cobb 연구소의 모든 현재 및 전 회원들과 관리 지원을 담당 한 Dionne Ware에게 감사드립니다. 이러한 연구는 국립 보건원 R37 DK34128 및 웰치 재단 그랜트 I1243에 의해 MHC
Materials
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector |
| BioMax Cassette 8×10" | Carestream Health | 107 2263 |
| BioMax MS Film 8×10" | Carestream Health | 829 4985 |
| BioMax MS Intensifying Screen 8×10" | Carestream Health | 851 8706 |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
References
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