Summary
Proteinkinaser er høyt utviklede signalerende enzymer og stillaser som er kritiske for inter- og intracellulær signaltransduksjon. Vi presenterer en protokoll for måling av kinaseaktivitet ved bruk av radioaktivt merket adenosintrifosfat ([γ-32P] ATP), en pålitelig metode for å hjelpe til med å illustrere cellesignalregulering.
Abstract
Proteinkinaser er i stand til å styre storskala cellulære forandringer som respons på komplekse arrays av stimuli, og mye innsats har vært rettet mot å avdekke allosteriske detaljer i deres regulering. Kinaser omfatter signaleringsnettverk hvis defekter ofte er kjennetegn ved flere former for kreft og beslektede sykdommer, og gjør en analyseplan tilgjengelig for manipulering av oppstrøms regulatoriske faktorer og validering av reaksjonskrav som er kritiske i søket etter forbedrede terapeutiske midler. Her beskriver vi en grunnleggende kinaseanalyse som lett kan tilpasses for å passe spesifikke eksperimentelle spørsmål, inkludert, men ikke begrenset til, å teste effektene av biokjemiske og farmakologiske midler, genetiske manipulasjoner som mutasjon og deletjon, samt cellekulturbetingelser og behandlinger for å probe Celle signaleringsmekanismer. Denne analysen benytter radiomerket [y-32P] ATP, som muliggjør kvantitative sammenligninger og tydelig visualisering av resultater, og kan være modIfied for bruk med immunpresipitert eller rekombinant kinase, spesifikke eller typifiserte substrater, over et bredt spekter av reaksjonsbetingelser.
Introduction
Proteinkinaser er sofistikerte enzymer som er kritiske for overføring av cellesignaler til passende svar 1 . Gitt deres roller for å opprettholde homøostasis og forebygging eller forfremmelse av sykdomstilstander 2 , er biokjemiske metoder for vurdering av kinaseaktivitet fortsatt kraftige verktøy for å avgrense detaljene for eukaryotisk signalering 3 . Selv om strategier som benytter fosfospesifikke antistoffer har vært svært informative når det gjelder å måle virkningene av forskjellige behandlingsbetingelser på celle signaleringsstatus 4 , tillater en kinaseanalyse å måle virkningene av forskjellige behandlingsbetingelser direkte i form av enzymatisk aktivitet av en kinase av renter. Selv om det finnes flere alternativer for lignende analyser som ikke bruker radioaktive materialer 5 , fortsetter vi å stole på denne metoden for robust kvantitering av resultater. DerEr to typiske anvendelser av denne analysen, begge verdifulle av forskjellige grunner: den immunprecipiterte (IP) kinaseanalysen ( Figur 1 ) og rekombinante proteinkinaseanalysen ( Figur 2 ).
IP-kinaseanalysen er enormt nyttig for å identifisere faktorer som er i stand til å aktivere spesifikke proteinkinaser, så vel som målehemmende behandlingsbetingelser. Kort fortalt transfekteres en epitop-merket kinase av interesse i dyrkede eukaryote celler, underkastes en rekke behandlinger, immunutfellede, og analyseres for evnen til å inkorporere radioaktivt merket fosfat i et modellsubstrat ( f.eks. Myelinbasisk protein (MBP)). IP-kinaseanalyse kan også utføres uten å benytte overekspresjon, enten ved immunutfelling av endogent protein eller et hvilket som helst antall genom-redigeringsteknikker. Fordi behandlinger administreres i kultur, kan denne metoden oppdage stimuleringer overført gjennom flere oppstrømsfaktorerEller parallelle veier ved in vitro- avlesning. En stor fordel ved denne metoden er at den ikke krever tidligere kjennskap til direkte oppstrøms eller nedstrøms faktorer eller fosforyleringssteder deri. Videre, når spesifikke substrater for en interessekinase er blitt identifisert, kan den samme kinaseanalyseprotokollen brukes med rekombinante komponenter for å måle spesifikk aktivitet mot naturlige substrater og identifisere spesifikke fosforyleringssteder når kombinert med massespektrometrianalyse. Nettsteder som er identifisert på denne måten, kan ytterligere valideres med kinaseanalyser som benytter substratmutanter. Til slutt kan denne metoden også brukes til å oppdage og måle autofosforylering.
Protokollen gitt her antar enten et optimert proteinrensingsskjema eller transfeksjonsmetode for å uttrykke en affinitetsmerket kinase av interesse i dyrkede celler. For mer detaljerte utstillinger av transfeksjon, lysis, immunutfelling og proteinrensning protOcols, foreslår vi å referere til Cold Spring Harbour Protokoll 6 . For mer informasjon om analyseutvikling og modifikasjon, se Proteinfosforylering: Utvalgte metoder i enzymologi 7 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kinase Rensing Ressurser og Generell Immunprecipipitation Pipeline
MERK: Kinaser for bruk med denne analysen kan hentes fra immunpresipitater av dyrkede celler eller ved rekombinante midler, slik som affinitetsmerket rensing 6 . Nedenfor er en generell protokoll for flaggmerket immunutfelling, som kanskje må modifiseres avhengig av kinasen av interesse. Alt skal holdes på is når det er mulig.
- Tilsett 2 μL 1 mg / ml antistoff til 200 μl celle lysater (vanligvis ~ 1 mg / ml total proteinkonsentrasjon) og inkuber ved 4 ° C i 1 time mens du rocker.
- Vask protein En sepharose perler 2-3 ganger med lysisbuffer (se nedenfor) ved kort spinn ved 4 ° C i 30 s til 1 min ved 5000 xg ("touch spin"), fjern supernatanten med en pipette og resuspende perler i buffer .
- Forbered lysisbuffer: 50 mM HEPES pH 7,7, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% glyserol, 0,2 mM natriumortovanadat, 100 mM natriumfluorid, 50 mM p-glycerofosfat, 0,1% Triton X 100 eller 0,1% NP-40.
- Tilsett 30 μl 50% oppslemming av protein A sepharose perler i lysisbuffer til lysater; Inkuber ved 4 ° C i 1 time mens du rocker.
- Berør spinn ved 4 ° C for å pellere perlene og fjern supernatanten.
- Vask 3 ganger med 1 ml perlevaskbuffer (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,4).
- Vask en gang med 1 x kinase reaksjonsbuffer (10 mM HEPES pH 8,0, 10 mM MgCl2). Fjern så mye buffer som mulig uten å fjerne perler.
2. Initialisering av kinase-reaksjoner
MERK: For IP-kinase-analyser er ~ 15 μl av ikke-suspenderte perler en typisk startprøve. For rekombinante proteinkinaseanalyser varierer typiske utgangsmengder fra 0,1-1,0 μg i 1-10 for 25-50 μl endelige reaksjonsvolumer. Juster volumene av rekombinant proteinprøveS å være lik med bufferen de er lagret i før initialiseringen av analysen. Ved bruk av høye mengder kinase, inkludere et bærerprotein slik som BSA for å hjelpe til å opprettholde proteinstabilitet i løpet av analysen.
- Forbered 5x kinase reaksjonsbufferen gitt nedenfor:
50 mM HEPES pH 8,0
50 mM MgCl2
50 mM benzamidin (proteaseinhibitor)
50 mM DTT (reduksjonsmiddel)
250 μM ATP (umerket eller kaldt) - Hold kinaseprøver på is i 1,5 ml rør. Tilbered følgende reaksjonsblanding i separate, kjølte 1,5 ml rør:
21 ul H20
6 μl 5x kinasereaksjonsbuffer
1 μl radiomerket ("hot") ATP
2 μl substrat (~ 5 mg / ml)
MERK: For rekombinante kinaseanalyser kan volumet justeres for å imøtekomme renset protein. Beregn slik at det endelige reaksjonsvolumet er 30 ul. Bruk denne oppskriften til å forberede en mesterblande. Ved mottak av merket ATP, fortynnet lager i H20 til en spesifikk aktivitet på 0,01 mCi / μl før tilsetning til reaksjonsblanding. - For å initialisere analysen, tilsett hele reaksjonsblandingen til kinaseprøve og inkuber reaksjon ved 30 ° C i 5 minutter til 1 time avhengig av aktivitet av kinase som analyseres.
MERK: Når du arbeider med en kinase hvis aktivitet ikke har blitt analysert tidligere, utfør en tidskurs av kinaseaktivitet med 5 minutters mellomrom mellom tidspunkter.
3. Reaksjonsterminering og SDS-PAGE
- Stopp reaksjonen ved å sette på is og tilsette 7,5 μL 5x Laemmli prøvebuffer 6 .
- Varm ved 100 ° C i 30 s til 2 min i varmeblokk.
- Berør spinn og last 20 μL per brønn på 10-15% SDS-PAGE gel. Kjør gel lenge nok til å separere kinase og substrat (typisk 1 time ved konstant effekt på 5 W). Sørg for at du holder skjermen beskyttet for å begrense eksponeringen til 32
- Her bruker du hjemmelagde gelapparater, men standard kommersielt tilgjengelige mini-geler passer perfekt. Bruk dimensjonene som følger:
Geler: 8 cm bredde, 5,5 cm lengde (oppløsning), 1,5 mm tykkelse.
Kombiner: 15 brønner, 1,5 mm tykkelse, 2,9 mm bredde, 16 mm dybde
4. Gel-farging og tørking
Forsiktig: For alle trinn må du redusere personlig eksponering til 32 P ved bruk av radioaktive skjerming og bruk personlig verneutstyr. For mer informasjon om spesifikke trinn, er noen nyttige referanser inkludert.
- Fjern gelen fra glass / aluminiumoksydplater og plasser i 50 ml Coomassie-flekk (10% iseddik, 50% metanol, 0,25% R-250-fargestoff) i 1 time på en orbital shaker satt til 50 rpm. For dette trinnet bruk en beholder som er litt større enn selve gelen. 8
- Flytt gelen fra flekk til fikseringsløsning (10% iseddik aciD, 20% metanol) for å de-flekke. Rock gelen i 600-700 ml fikseringsoppløsning natten over på orbital shaker ved 50 rpm. Plasser biter av skum eller knyttede laboratorieservietter i beholderen med gelen for å absorbere Coomassie-fargestoffet 8 , 9 .
- Fjern gel fra fikseringsoppløsningen og suge i 200 ml metanol i 1-2 minutter med forsiktig omrøring til gelen blir melkaktig hvit. Dette vil forhindre sprekker under tørketrinnet.
- Våt et 14 cm x 14 cm stykke kvalitativt filterpapir med metanol og legg på en vakuumtørker med slabgel. Legg gelen ned på filterpapirets forsiden oppad.
- Dekk gelen med plastfolie forsiktig for å unngå rynker og luftbobler. Kjør tørketrommelen i 1,5 timer ved 80 ° C. Etter at vakuumet er oppnådd, åpne lokket og kast eventuelle luftbobler om nødvendig med en myk gummibroyer.
5. Autoradiogram og scintillation teller
- Fjern driEd gel og fest en autorad markør, fosforescerende linjal eller prikker til filterpapiret på siden av gelen. Hvis du bruker prikker, sørg for at de er i et asymmetrisk mønster. Dette vil justere gelen med filmen etter eksponering og utvikling.
- Bruk en Geiger-teller for å kontrollere signalets intensitet. For svakere signaler vil eksponering ved -70 ° C til -80 ° C med en intensiverende skjerm øke filmbåndets tetthet.
- I et mørkt rom legger du tørket gel i en filmkassett med film og en intensiverende skjerm i følgende rekkefølge fra topp til bunn: gel, film, intensiveringsskjerm.
- Fest intensiveringsskjermen til kassettens lokk og fest gelen på plass for å gjøre dette trinnet lettere. Den intensiverende skjermen utsender lys når det bestråles av beta-partiklene fra 32 P. Disse lysutslippene trenger inn i filmen mer effektivt enn beta-partiklene.
- Pass på at bølgelengden som sendes ut fra intensiveringsskjermen, korrespondererDammer til en bølgelengde filmen er mest følsom overfor.
- Bruk en Geiger-teller for å bestemme hvor lenge du skal forlate eksponeringen for: hvis cpm-tellingen er ~ 100 eller lavere, prøv natten over ved -70 ° C. Hvis tellingen er ~ 10.000, starter med en 1 time eksponering og optimaliserer derfra.
- Ved avslutningen av eksponeringen, fjern filmen og utvikle den i en medisinsk / røntgenfilmprosessor. Hvis eksponeringen ble utført ved -70 til -80 ° C, må du enten la kassetten varme opp til romtemperatur for å minimere kondens på filmen eller fjerne filmen umiddelbart før kondensformer 10 .
- Legg filmen over tørket gel / filterpapir og juster bildet av markøren / prikkene med markørene / prikkene på den tørkede gelen. Marker på båndene bandene som svarer til proteinstandardene. Merk proteinkravene og hvilke baner reaksjonene er for fremtidig referanse.
- Punk båndene fra gelen som samsvarer med bånd av interesse på filmen og plasser demI 7 ml scintillasjonsflaskene. Tilsett 4 ml scintillasjonsvæske og telle med væskescintillasjonsteller. Bekreft at telleren er innstilt for å overvåke det riktige energispektrumvinduet for 32 P.
MERK: Pass på at du også aksesserer båndet som svarer til substrat fra no-kinase kontrollbanen. Dette vil bli brukt til å beregne bakgrunnsstråling som vil bli trukket fra alle sample scintillation teller.
6. Analyse av resultater
MERK: Autoradiogrammet gir en kvalitativ visualisering av resultatene. For nøyaktig kvantifisering kan 32 P inkorporering måles med en scintillasjonsteller. Data uttrykkes vanligvis i forhold til relativ aktivitet, som vist i figur 1B . Så lenge uniforme forhold opprettholdes for alle prøver, er relative målinger av spesifikk aktivitet tilstrekkelig til å sammenligne behandlinger.
- Ved beregning av absolutt spesifikke aktivitetsverdier, utfør en strenghetOptimal optimalisering av alle reaksjonsbetingelser, inkludert kinase, substrat og kalde ATP-konsentrasjoner, for å sikre et lineært aktivitetsområde over et tidsforløp ( f.eks. 2 x [kinase] = 2 x spesifikk aktivitet). For kinaser med høy spesifikk aktivitet, utfør analyser med økt substratkonsentrasjon dersom kinaseaktivitet er begrenset av mengde substrat.
- Beregn spesifikk aktivitet av kinase av interesse i enheter av nanomolphosphat overført per minutt per mg kinase.
- Trekk mellannivåer fra cpm i de telle bandene.
- Beregn nedfallet av varmt ATP: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0,95 hvor t er antall dager siden referansedagen (skal leveres av leverandøren), t 1/2 er Halveringstiden på 32 P, som er 14,3 dager, og 0,95 reflekterer effektiviteten til scintillasjonstelleren. Eksempel: Hvis du bruker hot ATP som er 28 dager gammel, bør nedbrytingsverdien være 0,245.
- CalcPellomoler (pmol) av total ATP i analysen (vanligvis er dette lik mengden kald ATP i reaksjonen): analysevolum (μL) x [kald ATP] (μM) = total ATP (pmol). Eksempel: 30 μl x 50 μM = 1500 pmol
- Beregn cpm / pmol ATP: [μL varm ATP x (2,2 x 10 7 ) x forfallsfaktor] / pmol av kald ATP.
MERK: Verdien på 2,2 x 10 7 konverterer 0,01 mCi / μL ATP til cpm. - Beregn mengden kinase i analysen i mg. For både rekombinante kinaser og immunprecipiterte kinaser er standardmetoder som BCA-analyser egnede for å bestemme utgangskonsentrasjoner. Eksempel: wtERK2 0,0002 μg / μl i en 50 μl kinasereaksjon er 0,01 μg eller 1 x 10 -5 mg.
- Beregn totalt cpm i analysen. Monter 30 μl reaksjoner og løp 20 μl fra hver reaksjon på en gel. Multipliser cpm tellet (etter blank subtraksjon) med en faktor av totalt analysevolum / volum lastet. Fortsetter ovenståendeEksempel, multipliser alle teller med 1,5 eller 30/20.
- Beregn den spesifikke aktiviteten til den analyserte kinasen:
Total cpm i analyse) / (cpm / pmol ATP) / (analysetid i minutter) / (mengde kinase i mg)
MERK: Deling av oververdien med 1000 gir den spesifikke aktiviteten i nanomol / minutt / mg
- Beregn hvor mange mol fosfat er innlemmet i et substrat (så lenge molekylvekten er kjent). Dette brukes til å bestemme antall fosfositter på et bestemt protein når reaksjonen har gått til fullføring.
Totalt cpm i analysen) / (cpm / pmol ATP)] / (mengde substrat i pmoler)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
WNK1 IP kinase assays
Myc-merket WNK1 ble transfektert inn i HEK293-celler og immunpresipitert med et anti-Myc-antistoff 11 . Immunpræcipitatet viste kinaseaktivitet overfor modellsubstratet MBP så vel som mot seg selv ( Figur 1A ). WNK1-mutanter ble deretter testet for kinaseaktivitet mot MBP ved samme metode, denne gangen med bruk av GST-merkede konstruksjoner ( figur 1B ). Analyse av mutant kinaseatferd i forhold til villtype avslørte rester kritisk for optimal WNK1 aktivitet.
HEK293-celler ble eksponert for et panel av farmakologiske og biokjemiske behandlinger. Ved bruk av et antistoff opptatt mot et WNK1-N-terminalt peptid ble immunpresipitert endogen WNK1-kinaseaktivitet analysert ved å benytte MBP som substrat. Epidermal vekstfaktor (EGF), en kjent aktivatEller ERK1 / 2-signalering, nokodazol, et stoff som retter seg mot mikrotubuleldynamikk, anisomycin, en inhibitor av eukaryotisk oversettelse og lysofosfatidinsyre (LPA), et potent mitogen, kunne ikke fremkalle en robust økning i fosforylert MBP. I kontrast ble NaCl vist å være en regulator av WNK1-kinaseaktivitet.
ERK2 rekombinante proteinkinaseanalyser
Rotte ERK2 som bærer en N-terminal 6His-tag ble uttrykt i bakterielle celler og affinitetsrenset med nikkelharpiks 12 . Protein ble ytterligere renset ved ionebyttekromatografi på en MonoQ-kolonne, hvor flere elueringsfraksjoner ble testet for kinaseaktivitet ( figur 2A ). Fordi ERK2 krever dobbelt fosforylering av MEK for å oppnå maksimal kinaseaktivitet, er ERK2 renset fra bakterier i fravær av MEK i stor grad inaktiv. Derfor, for å teste fraksjoner av recomBinant ERK2 for aktivitet mot MBP, ble en konstitutivt aktiv form av MEK1 kalt MEK1R4F inkludert i kinasereaksjoner. MEKR4F har ikke særlig høy kinaseaktivitet på MBP ( figur 2 ).
Ved bruk av en analyse som ligner den som er vist i figur 2A , ble en MBP-kinaseaktivitet brukt til å måle aktivitet av rekombinante ERK2-mutanter renset fra bakteriekulturer i forhold til villtypeprotein ( figur 2B ). Selv om ERK2 er i stand til å fosforylere MBP når det stimuleres av MEKR4F, muterer den mutasjon av enten katalytisk lysin (K52R) eller en treonin proksimal til de kanoniske områdene av dobbeltfosforylering (T188D og T188E) dramatisk ERK2-kinaseaktivitet. ERK2-T188D og ERK2-T188E viser marginal kinaseaktivitet mot et lite, fleksibelt peptid ( figur 2C ), men de kan ikke robust fosforylere de kjente ERK2-substratene Nup153 og PDX1 ( figur 2 D).
Figur 1: Immunpresipitasjonskinaseanalyser av WNK1. ( A ) HEK293-celler ble transfektert med enten pCMV5-Myc uten en innsats eller pCMV5-Myc-WNK1, merkede proteiner immunpresipiterte med anti-Myc-antistoffet etterfulgt av kinaseanalyser under anvendelse av MBP som substrat. Autoradiografi er vist til venstre, og en immunblokk av immunpræcipitatene til høyre. ( B ) Ulike GST-WNK1-mutantproteiner ble anvendt i kinaseanalyser med MBP som substrat; MBP-fosforylering uttrykkes som aktivitet i forhold til wildtype WNK1. ( C ) Endogen WNK1 ble immunpresipitert fra HEK293-celler behandlet med forskjellige stimuli og analysert for autofosforylering. Denne figuren ble modifisert fra Xu et al. , 2000 11 .5504fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Rekombinant proteinkinaseanalyser av ERK2. ( A ) Renset ERK2-fraksjoner fra en MonoQ anion-utbyttekolonne ble anvendt i en kinaseanalyse med MBP i nærvær eller fravær av MEK1R4F, en konstitutivt aktiv stimulator av ERK2-kinaseaktivitet. ( B ) ERK2-mutanter ble testet for kinaseaktivitet på MBP. ( C ) Aktiveringssløyfemutanter ERK2-T188D og ERK2-T188E viser marginal kinaseaktivitet mot et lite typifisert peptidsubstrat. ( D ) Sammenligning av ERK2- eller T188D-kinaseaktiviteter etter aktivering av MEK1R4F med kjente ERK2-substrater nukleoporin-153 (Nup153) og bukspyttkjertel og duodenal homeobox 1 (PDX1). Fosforylerte substrater er betegnet med kiler og fosforylerTed ERK2 og T188 med stjerner. Reprinted (og modifisert) med tillatelse fra McReynolds et al. , 2016 12 (Copyright 2016 American Chemical Society). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kinaser er en mangfoldig familie av proteiner som har utviklet omfattende funksjonalitet i mange sammenhenger, og kinaseanalyser har vært utrolig nyttige i å studere flere signalproteiner og har sterkt bidratt til vår nåværende forståelse av mobilkommunikasjon. Spesielt ble det samme grunnleggende assay anvendt for å karakterisere to forskjellige kinaser til tross for store forskjeller i struktur og aktivitet. WNK1-kinase inneholder en atypisk katalytisk lomme der kritisk lysin har skiftet til en unik posisjon og er kjent for å spille roller i regulering av kationklorid-cotransportører gjennom både kinase- og stillasfunksjoner. Kinasaktiviteten til WNK1 er kjent for å ha et lavt omsetningsnummer, selv på de best karakteriserte substratene, proteinkinasen oksidativ stress responsiv 1 (OSR1) og SPS / STE20-relatert prolinalaninrik kinase (SPAK). I kontrast viser ERK2, sammen med nært beslektet kinase ERK1, robust kinasaktivitet når den aktiveres
Det mest kritiske aspektet ved analysen er reaksjonsmontering. For å gjøre nøyaktige tidspunktsmålinger, må det tas spesiell forsiktighet på å initialisere kinasereaksjoner. Det er fire grunnleggende krav til en kinaseanalyse for å fortsette: kinase, substrat, ATP og en metallion. For denne protokollen, som hovedsakelig brukes til eukaryotiske kinaser, blir MgCl2 anvendt som en kilde til magnesium. Begge rekombinante proteinkinaser og IP-kinasepreparater inneholder typisk magnesium, hvilket gjør MgCl2 utilstrekkelig som en reaksjonsstarter. På samme måte kan tilsetning av umerket ("kald") ATP før tilsetning av merket ("hot") ATP initiere en reaksjon utilstrekkelig tidlig. Vi anbefaler å forberede reaksjoner ved hjelp av en konsentrert kinasereaksjonsbuffer som muliggjør samtidig tilsetning av MgCl Selv om det er noen forskjell mellom IP-kinaseanalyser og rekombinante proteinkinaseanalyser, tHan eksperimentelle paradigme felles for begge demonstrerer hvor allsidig denne analysen kan være. Faktisk finnes det tilfeller der egenskaper av begge kinaseanalysetyper kan blandes, som med studier på signalmekanismen med mitogenaktivert proteinkinase / ekstracellulær signalregulert kinase (MAPK / ERK). I denne banen aktiveres ERK1 / 2 ved tofosforylering ved oppstrømsfaktoren MAPK / ERK kinase 1 (MEK1). Tidligere studier har vist at mens MEK1, samt en konstitutivt aktiv mutant betegnet MEK1R4F, er i stand til å aktivere ERK1 / 2, har den svært lav aktivitet mot MBP. Følgelig viser ERK1 / 2 renset fra bakterielle celler begrenset kinaseaktivitet mot MBP, med mindre det er behandlet med MEK1R4F, skaper en robust plattform for sammenligning av kinaseaktiviteten til wildtype ERK1 / 2 til mutantkonstruksjoner, som vist i figur 2 . Inkludering av immunprecipiterte komponenter kan legge til enda mer nyanse, fremheve kinaseanalysen som en svært tilpasningsbar metode for å sonde den mangesidede nAture av disse viktige signalmolekylene. Selv om noen kan finne arbeid med radioaktive materialer besværlig, er den kvantitative traktorbarheten til den radiomerkede kinaseanalysen en av sine store fordeler. Men de siste fremskritt innen naturproduktkjemi, genomforskning og massespektrometri har skapt en etterspørsel etter modifiserte kinaseanalyser Med readouts mer mottagelig for høy gjennomstrømningsapplikasjoner 15 . Fordi disse analysene utnytter forskjellige merkematerialer, blir kompromisser gjort med hensyn til nøyaktighet, men disse kan overvinnes ved å bruke en radiomerket analyse for å validere skjermresultater. Etter hvert som vår forståelse av proteinkinase-signalering øker, er det klart at teknikker som kan tette ut opplysninger om kinase-regulatoriske funksjoner, vil fortsette å hjelpe til med utvikling av verktøy og terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker alle nåværende og tidligere medlemmer av Cobb-laboratoriet for verdifullt arbeid og diskusjoner, og Dionne Ware for administrativ hjelp. Disse studiene ble støttet av National Institutes of Health Grant R37 DK34128 og Welch Foundation Grant I1243 til MHC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 | |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 | |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 | |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 | |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 | |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 | |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 | |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 | |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 | |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector | |
| BioMax Cassette 8 x 10" | Carestream Health | 107 2263 | |
| BioMax MS Film 8" x 10" | Carestream Health | 829 4985 | |
| BioMax MS Intensifying Screen 8" x 10" | Carestream Health | 851 8706 | |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A | |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 | |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 | |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
References
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).
- Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
- Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).
- Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).
- Cold Spring Harbor Protocols. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2016).
- Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).
- Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. , Available from: http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html (2007).
- Autoradiography. , Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011).
- Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. , 3 edn, Humana Press. (2009).
- Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).
- McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).
- Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).
- Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).
- Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).
