Proteinkinaser är högutvecklade signalerande enzymer och byggnadsställningar som är kritiska för inter- och intracellulär signaltransduktion. Vi presenterar ett protokoll för mätning av kinasaktivitet genom användning av radioaktivt märkt adenosintrifosfat ([γ-32P] ATP), en tillförlitlig metod som hjälper till att belysa cellsignalreglering.
Proteinkinaser kan styra storskaliga cellförändringar som svar på komplexa stimuleringsstammar, och mycket ansträngning har gjorts för att avslöja allosteriska detaljer i deras reglering. Kinaser innefattar signaleringsnät vars defekter ofta är kännetecken för flera former av cancer och besläktade sjukdomar, vilket gör en analysplattform möjlig för manipulation av uppströms reglerande faktorer och validering av reaktionskrav som är kritiska i sökandet efter förbättrade terapeutiska medel. Här beskriver vi en grundläggande kinasassay som enkelt kan anpassas för att passa specifika experimentella frågor inklusive men inte begränsat till testning av effekterna av biokemiska och farmakologiska medel, genetiska manipuleringar såsom mutation och deletion såväl som cellodlingsförhållanden och behandlingar för att sondra Cellsignaleringsmekanismer. Denna analys utnyttjar radiomärkt [y-32P] ATP, vilket möjliggör kvantitativa jämförelser och tydlig visualisering av resultat och kan vara modIfied för användning med immunprecipiterat eller rekombinant kinas, specifika eller typifierade substrat, över ett brett spektrum av reaktionsbetingelser.
Proteinkinaser är sofistikerade enzymer kritiska för överföring av cellulära signaler till lämpliga svar 1 . Med tanke på deras roller för att upprätthålla homeostas och förebyggande eller främjande av sjukdomstillstånd 2 fortsätter biokemiska metoder för att bedöma kinasaktivitet att vara kraftfulla verktyg för att avgränsa uppgifterna om eukaryotisk signalering 3 . Även om strategier som utnyttjar fosforspecifika antikroppar har varit mycket informativa när det gäller mätning av effekterna av olika behandlingsbetingelser på cellsignalstatus 4 möjliggör en kinasassay att mäta effekterna av olika behandlingsbetingelser direkt i termer av enzymatisk aktivitet hos en kinas av intressera. Även om det finns flera alternativ för liknande analyser som inte använder radioaktiva material 5 , fortsätter vi att förlita oss på denna metod för robust kvantifiering av resultat. därÄr två typiska tillämpningar av denna analys, båda värdefulla av olika skäl: den immunprecipiterade (IP) -kinasanalysen ( Figur 1 ) och den rekombinanta proteinkinasanalysen ( Figur 2 ).
IP-kinasassayen är oerhört användbar för att identifiera faktorer som kan aktivera specifika proteinkinaser såväl som mätningshämmande behandlingsbetingelser. I korthet transfekteras en epitopmärkt kinas av intresse i odlade eukaryota celler, utsätts för en mängd behandlingar, immunprecipiterade och analyseras för förmågan att införliva radiomärkt fosfat i ett modellsubstrat ( t.ex. myelinbaserat protein (MBP)). IP-kinasassay kan också utföras utan att tillgripa överuttryck, antingen genom immunutfällning av endogent protein eller något antal genom-redigeringstekniker. Eftersom behandlingar administreras i kultur kan denna metod detektera stimuleringar som överförs genom flera uppströmsfaktorerEller parallella vägar genom in vitro- avläsning. En stor fördel med denna metod är att den inte kräver förkunskaper om direkta uppströms eller nedströms faktorer eller fosforyleringsställen däri. Vidare, när specifika substrat för en intressant kinas av intresse har identifierats kan samma kinasassayprotokoll användas med rekombinanta komponenter för att mäta specifik aktivitet mot naturliga substrat och identifiera specifika fosforyleringsställen när de kombineras med masspektrometrianalys. Platser som identifieras på detta sätt kan valideras ytterligare med kinasassays med användning av substratmutanter. Slutligen kan denna metod också användas för att detektera och mäta autofosforylering.
Protokollet som tillhandahålls här förutsätter antingen ett optimerat proteinreningsschema eller transfektionsmetod för att uttrycka en affinitetsmärkad kinas av intresse i odlade celler. För mer detaljerade exponeringar av transfektion, lysis, immunutfällning och proteinreningsprotokollOcols, föreslår vi att vi hänvisar till Cold Spring Harbor Protocols 6 . För mer information om analysutveckling och modifiering hänvisas till Proteinfosforylering: Utvalda metoder i Enzymologi 7 .
Kinaser är en mångsidig familj av proteiner som har utvecklat en omfattande funktionalitet i många sammanhang och kinasanalyser har varit otroligt användbara vid studier av flera signalproteiner och har starkt bidragit till vår nuvarande förståelse av cellulär kommunikation. I synnerhet användes samma basanalys för att karakterisera två olika kinaser trots stora skillnader i struktur och aktivitet. WNK1-kinas innehåller en atypisk katalytisk ficka där den kritiska lysinen har förskjutits till en unik posit…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar alla nuvarande och tidigare medlemmar av Cobb-laboratoriet för värdefullt arbete och diskussioner, och Dionne Ware för administrativt bistånd. Dessa studier stöddes av National Institute of Health Grant R37 DK34128 och Welch Foundation Grant I1243 till MHC
Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 |
Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC |
Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 |
Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 |
R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 |
Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 |
Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 |
Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 |
Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 |
Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 |
Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector |
BioMax Cassette 8×10" | Carestream Health | 107 2263 |
BioMax MS Film 8×10" | Carestream Health | 829 4985 |
BioMax MS Intensifying Screen 8×10" | Carestream Health | 851 8706 |
Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A |
Scintillation vials | Research Products International | 125500 |
Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 |
Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |